国家标准 GB/T34408一2017 天然皮革牛羊、猪源性成分定性 PCR检测方法 Detectionofbowine,ovineandporeinederivedmaterialsinleather yqualitativepolymerasechainreaetion(PCR)method 2017-09-29发布 2018-04-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/34408一2017 天然皮革牛、羊、猪源性成分定性 CR检测方法范围本标准规定了天然皮革中水牛,黄牛,山羊、绵羊和猪源性成分的聚合酶链式反应(PCR)检测方法本标准适用于水牛、,黄牛,山羊、绵羊和猪皮革动物源性成分的定性检测本标准不适用于再生革和浸溃水解胶原的人造革(合成革)等材料的检测规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T20190一2006饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应(PCR)法 GB/T211012007动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法PCR方法原理提取天然皮革样品的脱氧核糖核酸(DNA),针对牛,羊、猪物种特异性的内源基因序列设计引物通过PCR扩增,获得目标物种的基因序列,根据扩增结果判断皮革所含动物源性成分试剂和材料 4.1所用试剂除特殊指明外,均为分析纯,用水均为GB/T6682中规定一级水 4.2灭菌水 4.3低亚硫酸钠 4.4三羚甲基氨基甲烧(Tris) 4.5氢氧化钠(NaOH) 乙二胺四乙酸钠盐(EDTA-2Na). 4.6 47 十二婉基硫酸钠(SDS) 4.8乙酸钠 4.9氯化钠 4.10琼脂糖 4.11苯前(Tis平衡酗 412三叙甲烧 4.13冰乙酸 4.14无水乙醇 4.15异戊醇
GB/T34408一2017 4.16异丙醇 4.17盐酸 4.18氨水(25%) 4.1975%乙醉溶液;取75mL无水乙醇,加水定容至100ml. 4.20三氧甲烧:异戊醇=24:l(体积比 4.21蛋白酶K(20mg/mL),一20丫保存 4.22澳化乙锭(10mg/mL.)或等效商业化的其他染料 4.232%(质量浓度)低亚硫酸钠溶液;称取2g低亚硫酸钠,溶于100mL水中 .241malLTieHcl缓冲液(H7.6和pH8.0)称取121.1只三羚甲基氨基甲烧(Tis)溶于 800ml水中,冷却至室温,用盐酸调节pH至所需值,加水定容至1L,高压灭菌 4.250.5mol/LEDTA溶液(pH8.0):称取186.lgNaeEDTA,溶于700mL水中,用NaOH调节pH 至 8.0,溶解后加水定容至1l,高压灭菌 nmol/L氢氧化钠溶液;称取40只氢氧化钠溶于100ml.水中,冷却后,加水定容至200ml 4.26 5 5 4.27 nmol/I氯化钠溶液;称取58.44g氧化钠溶于100mL水中,加水定容至200mL 4.28 3 nmolL乙酸钠溶液;称取49.21g乙酸钠,溶于120ml.水中,用冰乙酸调节pH至5.2,加水定容至200ml,高压灭菌 4.29SDs裂解缓冲液;在500mL水中加人100mL1nmol/几Tris-HCl缓冲液(pH7.6),100ml 0.5nmol/IEDTA(pH8.0)溶液,100ml.5mol/1氯化钠溶液,5SDs,完全溶解,加水定容至1L,高压灭菌 4.30TE缓冲液;在800ml水中加人10ml1nmol/LTris-HCl(pH8.0)缓冲液,2mL0.5mol/L EDTA(pH8.0)溶液,加水定容至1L,高压灭菌 4.311×TAE电泳缓冲液:取50×TAE(242gTris,57.1mL冰乙酸,100mL0.5mol/几EDTA溶液,定容至1L)按比例稀释上样缓冲液;0.25%澳酚蓝,40%质量浓度)蔗糖溶液,或等效商品化试剂 4.32 4.33DNA吸附柱:推荐使用Qiagen品牌DNA吸附柱,也可以使用等效DNA吸附柱 4.34DNA提取试剂盒 4.35PCR产物回收试剂盒 4.36PCR试剂盒,包括Taq酶,dNTPs,PCR体系缓冲液等,按试剂盒要求保存 4.37DNA分子量标准品(100bp、200bp,300bp,400bp,500bp等) 牛、羊猪基因组DNVA.4C保存 4.38 4.39引物;所需引物信息见表1,-20保存表1引物信息引物名称引物序列 CR产物大小/bp叫目标基因适用范围正;5'-AAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTT-3 内参基因(线粒内参引物约240 哺乳动物皮革反;5'-GATTGcGCTGTTATcccTAGGGTA3' 体16sRNA基因牛特异性正:5'-GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3 牛内源基因牛皮革 27 反;5'-GTAGGCTTGGGAATAGTACGA-3 引物" 山羊特异性正;5'-TATTAGGccTcccccTTGTT -3 293 山羊内源基因山羊皮革引物！" 反;5'-CcCTGCTCATAAGGGAATAGCcC3
GB/34408一2017 表1(续引物名称引物序列 PCR产物大小/bp 目标基因适用范围绵羊特异正;5'ccTccAAcAGTGAATAcTT3" 202 绵羊内源基因绵羊皮革性引物反:5'-TCCTcCTCATAAAGGAATGGCC-3 猪特异性正;5'-GCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA-3 猪皮革 212 猪内源基因反5'-ATGAAAGAGGcAAATAGANTTTTcG -3 引物" 该引物来源于GB/T20190 -2006 该引物来源于GB/T201902006 该引物来源于GB/T21101一2007 S 仪器与设备 5.1分析天平;精度士0.01g 5.2pH计:精度士0.1 5.3高压灭菌锅 5.4剪刀 5.5恒温水浴箱 5.6 涡旋震荡器 57 高速冷冻离心机 5.8 微量可调移液器:0.1Al2.5Alll10L2l204AL,20Al200AL,100l1000AL 5.9超微量核酸蛋白分析仪 5. .10超净工作台 5. .11PCR热循环仪 5.12电泳仪 5.13凝胶成像系统 5.14全自动核酸电泳分析仪检测步骤 6.1脱色深色皮革样品宜预先在通风厨中进行脱色处理将2%低亚硫酸钠溶液(4.23)加人烧杯中,水浴加热至65C 取2块3块约5em×5cnm试样放人烧杯中,试样应完全浸没在溶液中,边摇晃边滴人氨水(4.18),每100ml溶液加人1mL.氨水,65C水浴0.5h~2h,期间摇晃数次,直至试样明显脱色自来水冲洗干净,晾干待用 6.2DNA提取 6.2.1试样DNA提取试样DNA提取步骤如下 mm×2 将经脱色(6.1)处理或未经脱色处理的样品剪碎至小于2" mm,称取1g一2g试样,放 a
GB/T34408一2017 人50mL离心管中,加人5mL预热至65C氢氧化钠溶液(4.26),混匀(混匀时间不宜超过 10s),立即加人10mL灭菌水(4.2) 12000r/min离心5min,弃上层液体 b 加人15mL灭菌水(4.2),将沉淀震荡混匀,12000r/min离心5min,弃上层液体浅色样品重复本操作1次2次,深色样品重复本操作共3次一4次加人3mlSDS裂解缓冲液(4.29),将沉淀震荡混匀,用冰乙酸(4.13)或乙酸钠溶液(4.28)调 pH为7一8,加人20L蛋白酶K(4.21),65C恒温水浴4h以上,期间摇晃5次一10次取出,室温放置5min,12000r/min离心5min 取2mL上清液,加人等体积苯盼(4.11),不停摇晃混匀5nmin,12000r/min离心15nmin d 重复d小)操作一次 e 取步骤e)获得的上清液,加人等体积三氯甲烧:异戊醇(4.20),充分混匀5min,12000r/min fD) 离心10min. 重复f)操作一次日 h) 取步骤g)获得的上清液,加人等体积异丙醇(4.16),混匀后冰上静置10min 将混合液转人 DNA吸附柱(4.33),室温放置2min ,12000r/min离心30s,弃液体 i 加人700ML75%乙醉(4.19),l2000r/min离心30s 弃液体 j 重复)操作一次 k12000r/min离心2min,将DNA吸附柱放人新的1.5ml离心管中,室温放置5min,使乙醇挥发完全加人50ALTE缓冲液(4.30),室温静置5min,12000r/min离心2min,收集离心得到的液体,即为试样DNA溶液,待测除上述方法外,也可用等效的DNA提取试剂盒(4.34)提取试样DNA 6.2.2阴性对照模板DNA提取以滤纸代替皮革样品,按6.2.1提取DNA,所获得的液体作为PCR扩增的阴性对照 6.2.3DNA质量评估 260nm 用超微量核酸蛋白分析仪对试样DNA的质量进行评估,检测230nm、和280nm处的吸光值OD.m.OD丽和oD.w,满足以下要求则适宜PCR扩增 DNA浓度>10ng/aL ODm/ODm比值在1.7一2.0之间 OD.m/OD.m>1 6.2.4DNA纯化当按照6.2.1提取的试样DNA不能达到6.2.3的要求时,需将DNA进一步纯化宜使用PCR产物回收试剂盒(4.35)进行纯化 6.3PCR检测 6.3.1对照设置对试样DNA进行内参基因和动物内源基因的PCR扩增每个PCR扩增体系应同时设置阳性对照,阴性对照和空白对照阳性对照的模板DNA为牛,羊,猪基因组DNA,阴性对照的模板DNA见 6.2.2,空白对照的模板DNA为灭菌水 6.3.2内参基因检测为降低检测成本,减少无效操作,可先将试样DNA进行内参基因的PCR检测若检测结果为阳
GB/34408一2017 性,表明提取的试样DNA适宜进行PCR检测,可以进行动物内源基因的检测;若检测结果为阴性,表明提取的DNA不适宜进行PCR检测,应重新提取DNA,若重新检测结果仍为阴性,则本方法不适用于该样品检测 6.3.3PCR扩增体系在超净工作台中按表2配制PCR扩增体系,每个试样DNA的PCR扩增做1个重复表2PCR扩增体系试剂名称浓度加人PCR扩增体系的体积 10×PCR缓冲液 2.5L dNTPs 2.5mmol/1 2.0L 正向:0.5Al 引物 10pmol/A 反向:0.5Al Taq酶 5U/Al 0.2AL(1U 模板DNA 1AL(10ng20ng 灭菌水补足反应体系总体积至25.0 6.3.4CR扩增循环参数按表3循环参数进行PCR扩增表3CR扩增循环参数基因变性扩增循环数后延伸 94C/30s 40 内参基因 94C/5min 60C/30s 72/5min 72 /30s 94"/30s 牛内源基因 94/5min 55C/30s 40 72/5min 72/30s 94C/30s 山羊内源基因 94/5min 56/30s 40 72/5min 72C/30s 94C/30s 4我0 绵羊内源基因 94/5min 53/30s 72/5min 72/30s 94C/30s 94/5min 72/5min 猪内源基因 58c /30s 40 72/30s
GB/T34408一2017 6.3.5PCR产物电泳检测称取适量的琼脂糖(4.10),加人1×TAE电泳缓冲液(4.31)中,配制成质量浓度为2%的溶液,加热溶解冷却片刻,加人澳化乙锭溶液或等效商业化的其他染料(4.22),至其终浓度为1g/ml 倒人胶槽中待冷却凝固后,将胶槽放人含1×TAE缓冲液的电泳槽中,垂直向上拔去梳板吸取8AL 5LPCR产物与适量的上样缓冲液(4.32)混合,加人点样孔在另一个点样孔中加人5ALDNA分 min40min 凝胶成像系统观察电泳检测子量标准品(4.37) 接通电源,按8V/cm的电压电泳15” 结果除上述方法外,也可采用全自动核酸电泳仪分析仪检测PCR产物 6.4平行试验每个样品应做1个平行试验 6.5测序若相关方对检测结果有异议时,可将PCR产物测序当产物序列与附录A中某一种动物序列同源性达到95%及以上时,可判断样品含该动物源性成分结果分析 7.1质量控制 7.1.1总则各种对照、重复和平行试验的凝胶电泳检测结果应符合7.1.2一7.1.4 出现任一种非7.1.2一7.1.4 所述结果,应重做试验 7.1.2阳性对照检测结果内参基因阳性对照的检测结果为阳性,内源基因阳性对照的检测结果为阳性 7.1.3阴性对照和空白对照检测结果内参基因阴性对照和空白对照的检测结果为阴性.内源基因阴性对照和空白对照的检测结果为阴性 7.1.4平行试验和重复试验检测结果平行试验和重复试验检测结果应一致 7.2结果判断 7.2.1试样DNA内参基因的检测结果为阴性,表明未能提取出适宜PCR检测的试样DNA,应重新提取DNA,若检测结果仍为阴性,则本方法不适用于该样品检测 7.2.2试样DNA内参基因的检测结果为阳性,动物内源基因的检测结果为阴性,表明提取的试样 DNA适宜PCR检测,可以判断待测样品不含该动物源性成分 7.2.3试样DNA内参基因的检测结果为阳性,动物内源基因检测结果为阳性,表明提取的试样DNA 适宜PCR检测,可判断待测样品中含该动物源性成分
GB/34408一2017 结果表述 8.1试样DNA内参基因的检测结果为阳性,牛内源基因的检测为阳性,结果表述为“样品中检测出牛源性成分”;牛内源基因的检测为阴性,结果表述为“样品中未检出水牛(黄牛)源性成分” 8.2试样DNA内参基因的检测结果为阳性,山羊或绵羊内源基因的检测为阳性,结果表述为“样品中检测出羊源性成分”;山羊或绵羊内源基因的检测为阴性，结果表述为“样品中未检出山羊(绵羊)源性成分” 8.3试样DNA内参基因的检测结果为阳性,猪内源基因的检测为阳性,结果表述为“样品中检测出猪源性成分”;猪内源基因的检测为阴性，结果表述为“样品中未检出猪源性成分” 防护措施和废弃物处理检测过程中各种防护措施和废弃物处理按GB/T19495.2的规定进行
GB/T34408一2017 附录 A 资料性附录) 扩增产物序列来源NCBn A.1黄牛源性成分的PCR扩增产物序列271bp GCcATNTACTCTCCTTGGTGAC:ATGCCGCAACTAGACACG;TCAAC:ATGACTGACATGAT 61 CTTTCAATATITCTTGACCCTTTTTATCATCTTTCAACTAAAAGTTTCAAAACACAACTT 121TTATCACAATCCAGAACTGACACCAACAAAAATATTAAAACAAAACACCCCTTGAGAAAC 81AAAATGAACGAAAATTTATTTACCTCITTATTACCCCTGTAATTTIAGGTCTCCCTCTC 24GTAACCTTATCGYTA(CTATTCCCAAGCCTAC A.2水牛源性成分的CR扩增产物序列271bp GCcATATACTCTCCTTGGTGACATGCCACAGTTAGACACATCAACANTGAcTAACG:ATAAT CTTATCAATATTCTTAGCCTCTTCATCATTTTCAACTAAAAATTTCGAAACACAGCT 6 121CCACCACAACCCAGAACCGACACCAACAAAAATACCAAAACAAAACACCCCCTGAGAAAC 181AAAATGAACGAAAATCTXTTGCCTCTTICATTACcTATMAATTCTANGGCCTCCcCcTc 241GTAACTCTTATCGTACTANTTcCCAGCCTAc A.3山羊源性成分的CR扩增产物序列293bp CCCTGCTCATAAGGGAATAGCCATGCCTAGATTATIGATAGTTGTGTAGTTGGTGTAAA TGAGTGGGGTAGAAGGCCTAATGGTTGTAG:ATCAATAATGGATTAGCG;ACATAA 6 121TATTAATGTTCATGTTTGTCCTTGGTGTTATGAATATTATTATTTGTTTTGATATGAG 181TTGGAGTGCcCATTG;TIGGAGAGANGATGAG(GCGGTTGTTAATTAGTCGTTTGATGAGGG 241AAATA\GTAAGCIAGGAAATAAAATAATAAGGGTAACAAGGGGGAGGCCTAAA A.4绵羊源性成分的PCR扩增产物序列202bp CcICcCAACAGTGAATACTIcAATTA\GTATcAAAACAAATAATGAGCATcAT\AT\CCAA 6 AGGACAGACATGAGCATTAATGCTANTGTCCCCTAANTTTATTTXTTGGATCTACAAACT 121ACTAGGCCTCCTACCCCACTCATTTACACCAACTACACAACTATCAATAAACCTAGGCAT 181GGCCATTCCTTTATGAGGAGGA A.5猪源性成分的CR扩增产物序列(212p GCCTAAATCTCCCCTCAATGGTATGCCACAACTAGATACATCTACATGATTCATTACAAT
GB/34408?2017 6 TACATCAANTAATTNTACANTTANTTTATTTTANTTCCACIAAAAATTCAAANCT\ACTCATA 121CCAGCAAGCCCAGAATCAACGAACTCAAAACTCAAAAACATAGCACCCCTTGAGAAAT 81AAAATGAACGAAAATCTNTTGCCTCTTCAT

天然皮革牛、羊、猪源性成分定性PCR检测方法GB/T34408-2017

天然皮革是一种高档材料，广泛应用于箱包、衣服、鞋子等领域。为了保证消费者的权益和市场秩序，需要对天然皮革的成分进行检测。其中，牛、羊、猪皮革是比较常见的三种类型，因此本文主要介绍这三种皮革的成分检测方法。

检测原理

PCR（聚合酶链式反应）是一种能快速扩增DNA片段的技术，可以在非常短的时间内从微量样品中扩增出目标物质，并且具有高度的灵敏度和特异性。在天然皮革的成分检测中，可以利用PCR技术对牛、羊、猪皮革的源性进行检测。

检测步骤

天然皮革牛、羊、猪源性成分定性PCR检测按照GB/T34408-2017标准进行，主要包括以下步骤：

样品的预处理：将天然皮革样品切割成小块，并使用三氯甲烷等溶剂将其溶解。
提取DNA：通过特定的方法从样品中提取出DNA。
PCR扩增：在已提取出的DNA基础上，进行PCR扩增。选择适当的引物和扩增条件，以确保PCR扩增的特异性和灵敏度。
电泳：将PCR扩增产物进行电泳分析并进行结果解读。

注意事项

在进行天然皮革牛、羊、猪源性成分定性PCR检测时，需要注意以下几点：

样品应该来自具有代表性的样本，以保证检测结果的可靠性。
提取DNA的过程中，需要严格控制环境，避免污染。
PCR扩增的过程中，需要对反应体系进行严格控制，并在负对照样品中检测是否存在污染。
在电泳结果分析时，需要掌握专业知识，以避免结果解读错误。

总之，天然皮革牛、羊、猪源性成分定性PCR检测是一种高效、准确、可靠的检测方法，可以帮助我们及时发现问题，保障消费者的权益和市场秩序。希望本文内容对读者有所帮助。