甘蔗线条病毒检疫鉴定方法

甘蔗线条病毒检疫鉴定方法

国家标准 GB/T33127一2016 甘蔗线条病毒检疫鉴定方法 DeteetiamdidentifeatonSugarane streakirS 2016-10-13发布 2017-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T33127一2016 甘蔗线条病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了甘蔗线条病毒的检疫鉴定方法 本标准适用于可能带有甘蔗线条病毒的活体寄主植物的检疫鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 件 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T1840 sN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 甘蔗线条病毒基本信息 中文名;甘蔗线条病毒 学名:Sugarcaesreakvirus 缩写.Ssv 分类地位;双生病毒科(Geminioiridae),玉米线条病毒属(Masreoirus) 甘蔗线条病毒的其他信息参见附录A 方法原理 SsV的免疫原性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据 利用常规PCR,实时荧光PCR,双抗体 夹心酶联免疫吸附测定(DAs-ELISA)和免疫电镜方法对样品进行检测 仪器设备、设施、用具和试剂 5.1仪器 电子天平(感量0.001g),高速离心机、小型瞬时离心机,超低温冰箱(一80C),制冰机、涡旋振荡 器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、透射电子显微镜、超净工作台、PCR仪、实时荧光定量PCR仪、微 波炉,电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪,酶联检测仪 5.2设施 隔离温室(10C30C) 5.3用具 酶联板、可调移液器(2.5aL、10aL、20AL100AL、1000aL)和可调移液器头、离心管、研钵、微型
GB/T33127一2016 磨杵等 5.4试剂 除有特别说明外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定 DAs-EL.ISA测 定试剂见附录B;PCR检测试剂见附录C;实时荧光PCR检测试剂见附录D 症状观察与抽样 6.1 症状观察 现场检疫主要观察植物材料上病毒为害的症状,SSV为害症状描述参见附录A 6.2 抽样 发现有病毒为害症状的植物材料直接送检;未发现症状的,则按sN/T2122中规定进行抽样,并送 实验室检测鉴定 实验室检测 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAs-ELISA) 7.1 对待检组织进行研磨,并按1:1o(质量:体积)的比例加人抽提缓冲液,制备的汁液分别盛装于离 心管中,离心后吸取上清液作为待测样品,并设阳性对照,阴性对照和空白对照 具体操作步骤见附 录B. 7.2常规PCR检测 植株叶片液氮研细,取0.1g用于提取植物总DNA,双蒸水作为空白对照 分别提取样品和对照的 DNA后进行常规PCR检测,具体操作步骤见附录C 7.3实时荧光PCR检测 实时荧光PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1,双蒸水作为空白对照 分别提取样品和对照的 DNA后进行实时荧光PCR检测,具体操作见附录D. 7.4免疫电镜检测 按照SN/T1840中规定的方法制备样品和进行电镜观察病毒粒子形态 在免疫电镜下如观察到 大小为30nm×20nm的杆状双联体粒体,即可判定结果阳性 结果判定 样品检测时,检测结果判定按下述原则进行 -样品经PCR检测为阴性;或者样品经PCR检测为阳性,但是序列测定结果与目的序列不一 致,则判定样品不携带甘蔗线条病毒 -样品经PCR检测为阳性,且序列测定结果为目的序列;同时免疫电镜、DAS-ELISA,荧光PCR 这 三种检测方法其中一种为阳性检测结果,即可判定样品携带甘蔗线条病毒
GB/T33127一2016 样品与记录结果保存 经检验确定携带甘蔗线条病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核 实验样品保存在一20 冰箱中,有条件的保存在一80冰箱中更好 做好登记和标记工作 记录包括样品来源、种类、,取样人员、实验的时间地点、方法和结果、检验检疫员的签字等 双抗付 夹心酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值,PCR检测应有电泳结果照片
GB/T33127一2016 附 录A 资料性附录 甘蔗线条病毒背景资料 A.1寄主范围 甘蔗(Saccharuo/icinarwm),蕨藜草(Cenehrwseehinatus),两耳草(Pasalumconjugalwm,柔 毛狗尾草(Setariabarbata、弯叶画眉草(Erugrostiscurula) A.2分布 印度,巴基斯坦、尼日利亚、贝宁、多哥、塞内加尔、科特迪瓦、肯尼亚、马拉维、毛里求斯、莫桑比克、 南非,苏丹、乌干达等许多国家和地区 A.3病害症状 SSV影响寄主植物的整个生长期,可以导致对该病毒敏感品种11%以上的损失 受感染植株叶片 有无数小的斑点或条纹,病斑透明状,细窄,与叶脉平行 侵染后期,条斑不规则分布,植株下部叶片症 状严重,植株生长受阻 病毒主要分布在叶肉细胞、茎尖分生细胞及韧皮细胞中 A.4传播途径 SSV可通过种茎和苗木等无性繁殖材料远距离传播 可以通过多种叶蝉(Cicadwlinaspp.)以持 久性方式传播,在昆虫介体体内不能增殖,不能经过机械、嫁接、种子,花粉和植株间相互接触进行传播 A.5粒体形态 病毒粒体为双联体结构,大小30nm×20nm A.6基因组 基因组为单链环状DNA，长2760nt左右,病毒正义链有两个阅读开放框(ORF),分别编码运动 蛋白和外壳蛋白;互补链编码2个ORF,经mRNA剪接合成复制酶蛋白
GB/T33127?2016 ? B 淶?? ???(DAS-ELIsA) B.1?? B.1.1 ??塣 B.1.2? ???塣 B.1.3???(pl7.4 (Na.SO 1.3g ??(PVP,Mw2400040000)20 g (NaN 0.2g 20mL -20 900mL1PBST,HCIpH7.4,1000mL B.1.410xPBST?(pH7.4) 0 ?(NaCl 2g (KH,PO (Na;HPO. 1.5g ?(KCD) 2g -20 5mL 900mL?,?(HCI)pH7.4,1000ml B.1.5建?(pH9.6) ?(Na.cO. 1.59 ?(NaHcO. 2.93g 900mL??,?(HcI)pH9.6,1000mL B.1.6??建?(pH7.4 1PlBST? 800m ???(BsA) 2g PVP(MW2400040000 20g ??1000mL B.1.7(pNPp)?(pH9.8 97ml ?(CHNO
GB/T33127一2016 叠氮钠(NaN, 0.2g 溶于600mL的无菌蒸僧水中,用浓盐酸(HCI)调节pH至9.8,然后用蒸僧水定容至1000 mla B.1.8反应终止液 氢氧化钠(NaoH)120尽溶于100mL的无菌蒸溜水中,浓度3mol/儿 B.2实验步骤 B.2.1 包被抗体 用包被缓冲液将包被抗体按说明稀释,加人酶联板孔中,l00L/孔,加盖,37C孵育2h,清空孔中 溶液,PBST洗涤4次,每次3min B.2.2样品制备 待测样品幼嫩叶片拨11u(质量1体机)加人抽提缓冲液,用研钵研磨成浆,2o0片离心10r min, 上清液即为制备好的检测样品 对阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行 B.2.3加样 加人制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照,100L/孔,加盖,37C孵育2h或4C冰箱孵育过 夜,PBST洗涤4次,每次3min B.2.4加酶标抗体 根据说明书用酶标抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释至工作浓度,加人到酶联板中,100aL/孔,加 盖,37C孵育2h,PBST洗涤4次,每次3min B.2.5加底物 将底物pNPP加人底物缓冲液中,终浓度为1mg/mL(现配现用),每孔加人100L,室温避光孵育 30min 必要时每孔加人50L3mol/儿氢氧化钠溶液终止反应 B.2.6读数 30min后用酶标仪在405nm处读OD值 B.3结果判定 B.3.1对照孔的OD值(缓冲液孔,阴性对照及阳性对照孔),应该在质量控制范围内,即: 缓冲液孔和阴性对照孔的OD值均<0.15,当阴性对照孔的OD值<0.05时.按0.05计算;阳性 对照OD值/阴性对照OD值>510;同一样品的重复性基本一致 否则不能进行结果判断 B.3.2在满足了B.3.1质量要求后，结果可判断如下 样品OD值/阴性对照OD值>2,判为阳性;样品OD值/阴性对照OD值在阀值附近,判为 可疑样品,需重新进行试验,或用其他方法加以验证;样品OD值/阴性对照OD值<2,判为阴性 注:或者按照商品化DAsELISA试剂盒操作程序进行操作
GB/T33127一2016 附 录 C 规范性附录 常规CR检测 C.1主要试剂 C.1.1提取缓冲液 2%cTAB,.20mmol几EDTA.10o mmol/儿Tris-HCIpH8.0),1.4mol/LNaCI,用前加0.2%筑 基乙醉 C.1.2电泳缓冲液TAE(50× 三胫甲基氨基甲烧(Tris 242g 52.1ml 冰乙酸 100m 乙二胺四乙酸二钠纳(EDTA0.5mol/L 用时加蒸儡水稀释至1×TAE C.1.3澳化乙锭(EB)溶液(10g/L 澳化乙锭 20mg 灭菌去离子水 20mL 实验步骤 c.2.1植物总DNA提取 取植株材料约0.1g,置于研钵中加液氮研磨成粉状,迅速加人600L的2%CTAB抽提缓冲液 65C水浴预热),稍作研磨混匀;研磨液转人1.5ml离心管中,65C水浴30min45nin,期间不时 摇匀,使其充分混匀;取出后,加人300LTris饱和盼与300L三氯甲烧/异戊醉(24:1),混匀,剧烈 振荡30s;室温下,12000《离心10min;取上清液置于新的离心管中,加人1/10体积3mol/LNaAe pH5.2)和2倍体积预冷的无水乙醇,混匀,置于-20C冰箱20min以上;4C,12000片离心10min. 弃上清液;用70%乙醇和无水乙醇分别洗DNA沉淀一次,室温下风干;沉淀辫于200AL TE中(含 RNaseA104g/ml,pH8.0),37C孵育1h,-20C保存备用 注:或者按照商品DNA提取试剂盒进行操作 C.2.2CR反应 C.2.2.1PCR引物 SsV-F;5'-TCTCAAGCCAGGTATTTATTGC-3',SsV-R:5'-ATGAAGACGGAGGGTATCACAT-3' 目的扩增产物长度为465bp C.2.2.2PCR反应体系 PCR反应体系见表C.1 每个样品设2个平行处理 反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不 同的反应总体积进行适当调整 检测时以含甘蔗线条病毒的DNA或含有甘蔗线条病毒目标片段的质
GB/T33127一2016 粒作为阳性对照,以健康植物材料作为阴性对照,以水代替模板作为空白对照 PCR反应条件:94C5min; 94C35s,54C35s,72C35s,30个循环;7210min延伸 表C.1PCR反应体系 储存液浓度 加样量/山 名称 PCR缓冲液(含MgCl 0 2.5 dNTP 10mol/1 SSV-F 104mol/L SSV-R 10Amol/L 0.5 TagDNA聚合酶 5U/l. DNA模板 补dH.0至25山 ddH.O C.3琼脂糖凝胶电泳检测 c3.1制备凝胶 用1×TAE配制1.2%琼脂糖凝胶,加热溶化后冷却至55C左右 c3.2加澳化乙锭 将5L澳化乙锭(EB)加人到配制好的100mL凝胶中 将凝胶倒人凝胶槽中,插上样品梳子 冷 却凝固后拔掉梳子,在电泳槽内加人1×TAE,缓冲液要没过凝胶表面约1 mm C.3.3加样 将加样缓冲液与样品混合后加人样品孔,同时设计PCR的阴性对照和阳性对照,并加人分子量标 准物(Marker) C.3.4 电泳 接通电源,以3V/em一5V/em电场强度进行电泳,0.5h后观察结果 C.3.5结果观察 电泳结束后,将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察,记录结果 C,4结果判定 如果阴性对照和空白对照未出现条带,阳性对照出现预期大小的条带,样品未出现预期大小的条 带,则可判定样品为甘蔗线条病毒阴性 如果阴性对照和空白对照未出现条带,阳性对照出现预期大小的条带,样品出现预期大小条带,可 通过测序的方式进一步确认 如果CR产物序列与甘蔗线条病毒的序列一致,则可判定样品为甘蔗线 条病毒阳性,若序列不一致,则可判定样品为甘蔗线条病毒阴性
GB/T33127一2016 附 录D 规范性附录 实时荧光CR检测 D.1试剂 核酸提取试剂同C.1 TaqManPCRMixture D.2引物探针 引物序列:SsV-Fq:5'-CCTcTCTccCCAGTATGTA-3',SSV-Rq:5'-TGTcCATTAGAACCT- GAA-3' 探针序列SsV-P:5'-FAM-cGTATGCTCTGACCTTGTTGGC-TAMRA-3' D.3核酸提取 方法同C.2.1 D.4实时荧光CR反应 实时荧光PCR反应体系见表D.1,每个样品及对照设2个平行处理 检测时以含ssV的材料作为 阳性对照;以健康植物材料作为阴性对照;以水代替DNA模板作为空白对照 表D.1实时荧光PCR反应体系 名 称 贮备液浓度 加样量/儿 PCR缓冲液 10 2.5 SsV-Fg 04mol/L S SSV-Rg 10Amol/1 SSV-P 10Mmol/I TagDNA聚合酶 5U/l 0,2 DNA模板 2.0 ddH.o 心 ddH.o至25pl 注，PCR反应体系中各种试剂的量可根据具体情况进行适当调整,也可采用商品化试剂盒 95C5s,60C30s,40个循环 反应条件:9510min; 点击运行,进行PCR反应,保存文件,打开分析软件,仪器自动分析试验结果，给出ARn(荧光信号 增加值)与循环数之间关系的图像
GB/T33127一2016 D.5结果判定 在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值<30并出现典型扩增曲线的条 件下 待测样品的Ct值>40时,判定SSV阴性 待测样品的C值<35时,判定SSV阳性 -待测样品的3540时,判定SsV阴 性;如果重新测试的Ct值一40,则判定SSV阳性 10o
GB/T33127?2016 streak [1]F.L.HughesE.P.RybickiIR.Kirby.Completenueleotidesequenceofsgarcane MonogeminivirusArehives.ofVirology. 1993132;171-182. evidenceforthreedistinct [2]LBigarreM.SalahM.Granieretal.Nucleotide sequence 1999144:2331-2344 ArchivesofVirology. sugarcanestreakmastrevirusesJ [3]A.M.ShamloulaN.A.AbdallahM.A.Madkouretal.SensitivedetectionoftheEgyp tianspeciesofsugarcanestreakvirus robecapturehybridizationPCR-ELISAanditscom sbyPCR- p" pletenucleotideseguence ].JournalofVirologiealMethods200192;45-54 [4]AA.O.tiaA.M.M.MahdyM.A.L.Fatenetal.Serologicalandmoleeulardeteetionof sugarcanestreakvirus]AnnalsofAgrieultureSeience200341(4);1551-1559.

甘蔗线条病毒检疫鉴定方法GB/T33127-2016

GB/T33127-2016《甘蔗线条病毒检疫鉴定方法》是一项非常重要的标准，它规范了甘蔗线条病毒的检疫鉴定流程，能够有效地防止甘蔗线条病毒传播。

该标准首先描述了甘蔗线条病毒的形态特征、感染方式和危害程度，通过深入了解这些特征可以更好地开展甘蔗线条病毒的检测工作。

其次，该标准详细介绍了甘蔗线条病毒检测的样品采集、处理和保存方法，保证了样品的质量和可靠性。

最重要的是，该标准还规定了甘蔗线条病毒的检测方法和指标，如ELISA法、RT-PCR法等，这些方法和指标经过实验研究和实践验证，具有科学性、准确性和实用性。

此外，该标准还规范了检测结果的判定和报告，为检测结果的准确和权威提供了保障，对于甘蔗生产保护具有十分重要的意义。

总之，GB/T33127-2016《甘蔗线条病毒检疫鉴定方法》为保护我国的甘蔗生产做出了重要贡献，未来我们应该继续加强甘蔗线条病毒的防控工作，共同保护好我们的甘蔗产业。

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2022/10/1 18:33:52 现行