水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法

国家标准 GB/T20361一2006 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法 Determinationofmalachitegreenandgentianvioletresiduesinfisheryproduets Highperformaneeliquidchromatographywithluoresceneedetector 2006-09-01实施 2006-06-21发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20361一2006 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法 范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿(Malachitegreen,MG)及其代谢物隐色孔雀石绿(Leucomala- chitegreen,LMG)残留总量、结晶紫(Gentianviolet,GV)及其代谢物隐色结晶紫(Leucogentianviolet. LGV)残留总量的高效液相色谱荧光测定方法 本标准适用于水产品可食部分中孔雀石绿和结晶紫残留的测定 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一1992,neqIso3696;l987) 原理 样品中残留的孔雀石绿或结晶紫用删氢化钾还原为其相应的代谢产物隐色孔雀石绿或隐色结晶 紫,乙晴-乙酸铵缓冲混合液提取,二氯甲烧液液萃取,固相萃取柱净化,反相色谱柱分离,荧光检测器检 测,外标法定量 试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯.试验用水应符合GB/T6682一级水的标准 4.1乙睛;色谱纯 4.2二氧甲烧 4.3酸性氧化铝,分析纯,粒度0.071 mm0.150mm 4.4 二甘醇 4.5碉氢化钾 4.6无水乙酸铃 冰乙酸 氨水 棚氢化钾溶液[0.03mol/1];称取0.405g棚氢化钾于烧杯中,加250ml水溶解,现配现用 4.10砌氢化钾溶液[o.2nmol/L],称取0.54 研棚氢化钾于烧杯中,加50mL水溶解,现配现用 e 4.1120%盐酸羚胶溶液;溶解12.5区盐酸羚胶在50ml水中 4.12对-甲苯瞒酸溶液[0.05mol/1]称取0.95旦对-甲苯碱酸用水稀释至100; ml 4.13乙酸铵缓冲溶液[o.1nol/I];称取7.71g无水乙酸铵溶解于1000ml.水中,氨水调pH到10.0. 乙酸铵缓冲溶液[o.125mol/1]:称取9.64g无水乙酸铵溶解于1000ml水中,冰乙酸调pH 到4.5 酸性氧化铝固相萃取柱;500mg,3mlL 使用前用5mlL乙睛活化 4.16 Vam arianPRS柱或相当者:500mg,3mL 使用前用5mL乙睛活化
GB/T20361一2006 4.17标准品:孔雀石绿(MG)分子式为[(CaHN.)(CHO]CH,O、结晶紫(GV)分子式为 C;HCIN,,纯度大于98% 4.18标准储备溶液;准确称取适量的孔雀石绿、结晶紫标准品,用乙睛分别配制成100g/ml的标准 贮备液 4.19混合标准中间液(lg/ml)分别准确吸取1.00ml孔雀石绿和结晶紫的标准储备解液至 100mL容量瓶中,用乙睛稀释至刻度,配制成14g/mL的混合标难中间游液 一18C避光保存 4.20混合标准工作溶液;根据需要,临用时准确吸取一定量的混合标准中间溶液,加人碉氢化钾溶液 4.9)0.40ml,用乙晴准确稀释至2.00ml,配制适当浓度的混合标准工作液 仪器与设备 5.1高效液相色谱仪;配荧光检测器 5.2匀浆机 5.3离心机;4000r/min 5.4旋涡振荡器 5.5固相萃取装置 5.6旋转蒸发仪 样品制备 6.1取样 鱼去鳞、去皮,沿背脊取肌肉部分;虾去头、壳肠腺,取肌肉部分;蟹、甲鱼等取可食部分 样品切为 不大于0.5cmmx0.5cmmx0.5cenm的小块后混合 6.2提取 称取5.00g样品于50ml离心管内,加人10ml.乙睛,10000r/min匀浆提取30s,加人5g酸性 氧化铝,振荡2min,4000r/min离心10min,上清液转移至125mL.分液漏斗中,在分液漏斗中加人 二甘醉,3mL酬氢化钾溶液(4.10),振摇2min 2ml 另取50ml离心管加人10ml乙睛,洗涤匀浆机刀头10s,洗涤液移人前一离心管中,加人3ml 砌氢化钾溶液(4.10),用玻棒捣散离心管中的沉淀并搅匀,漩涡混匀器上振荡1min,静置20min 4000r/nmin离心10nmin,上清液并人125mL分液漏斗中 在50ml离心管中继续加人1.5ml盐酸胫胶溶液(！ 1)2.5mL对-甲苯磺酸溶液(4.12) 5.0mL乙酸铵缓冲溶液(4.14),振荡2min,再加人10mL乙睛,继续振荡2min,40o0r/min离心 10 nmin,上清液并人125mL .分液漏斗中,重复上述操作一次 在分液漏斗中加人20ml二氧甲烧,具塞,剧烈振摇2min.静置分层,将下层溶液转移至250ml 茄形瓶中,继续在分液漏斗中加人5mL乙睛、10mL二氯甲烧,振摇2min,把全部溶液转移至50ml 离心管,4000r/min离心10min,下层溶液合并至250mL茄形瓶,45C旋转蒸发至近干,用2.5mL乙 睛溶解残渣 6.3净化 将PRs柱安装在固相萃取装置上,上端连接酸性氧化铝固相萃取柱,用5ml乙猜活化,转移提取 液到柱上.再用乙精洗茄形瓶两次,每次2.5mL..依次过柱弃去酸性氧化铝柱,吹PRs柱近干,在不抽 真空的情况下,加人3mL等体积混合的乙睛和乙酸铵溶液(4.13),收集洗脱液.乙睛定容至3mL,过 0.45am滤膜,供液相色谱测定 测定 色谱条件 mm×4.6mm(内径),粒度5 色谱柱:ODS-C柱,250 m
GB/T20361一2006 1.2流动相乙睛十乙酸铵缓冲溶液(0.125mol/LpH4.5)=80十20. 7. 7.1.3流速1.3mL/min 7.1.4柱温;35c. 7.1.5微发波长:26nmr 刀.1.6发射波长360mm. 7.1.7进样量;20L. 7.2色谱分析 分别注人20AL孔雀石绿和结晶紫混合标准工作溶液及样品提取液于液相色谱仪中,按上述色谱 条件进行色谱分析,记录峰面积,响应值均应在仪器检测的线性范围之内 根据标准品的保留时间定 性,外标法定量 标准品色谐图参见附录A 结果 8.1计算 样品中孔雀石绿和结晶紫的残留量按式(1)计算 AXc.XV X= A，× 式中 样品中待测组分残留量,单位为毫克每千克(mg/kg) -待测组分标准工作液的浓度,单位为微克每毫升(ug/mL) 样品中待测组分的峰面积 待测组分标准工作液的峰面积; 样液最终定容体积,单位为毫升(mL); 样品质量,单位为克(g) 7 8.2线性范围 孔雀石绿和结晶紫混合标准溶液的线性范围;0.1ng/mL600ng/mL 8.3检出限 本方法孔雀石绿、结晶紫的检出限均为0.54g/kg 8.4回收率 在样品中添加0.44g/kg1004g/kg孔雀石绿时,回收率为70%~110% 在样品中添加0.4g/kg~100g/kg结晶紫时,回收率为70%110% 5 8. 重复性 本方法的相对标准偏差<15%
GB/T20361一2006 附录A 资料性附录》 孔雀石绿(MG)和结晶紫(GV)混合标准的液相色谱图 15 10- 7.5 10.0 12.5 timim 图A.1浓度为0.01/mL孔雀石绿(G)和结晶紫(G)混合标准的液相色谱图