GB/T35910-2018
猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测方法
Blockingenzyme-linkedimmunosorbentassayfordetectingtheantibodytoporcinecircovirustype2
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2018-09-01
- 文件格式PDF
- 文本页数9页
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猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测方法
国家标准 GB/T35910一2018 猪圆环病毒2型阻断ELISA 抗体检测方法 Bloekingenym-linkedimmunosorbentassayfordeteeting heantibodytoporeineeireovirus type2 2018-02-06发布 2018-09-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35910一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由农业部提出
本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口
本标准起草单位:南京农业大学
本标准起草人:姜平、王先炜、白娟、杨香林,刘捷
GB/35910一2018 猪圆环病毒2型阻断ELISA 抗体检测方法 范围 本标准规定了猪圆环病毒2型抗体阻断ELISA的检测方法
本标准适用于猪圆环病毒病的抗体检测、疫苗免疫抗体监测和血清流行病学调查
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 SN/T2984检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则 缩略语 下列缩略语适用于本文件
albumin) BSA;牛血清白蛋白(Bovine Serum ELISA;酶联免疫吸附试验(Enzyme-lhnkedimmunosorbentassay) HRP辣根过氧化物(Horseradishperoxidasey Pcv2;猪圆环病毒2型(Porcime.circorirusype2)” TMB;四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine) 仪器、材料与试剂 4.1试验仪器 4.1.1酶联免疫检测仪 4.1.2高速台式冷冻离心机
4.1.3微量移液器规格0.5AL~10AL、20AL一200AL、,100AL~1000L
4.1.412道可调微量移液器;规格10L100AL 4.2试验材料 4.2.196孔酶标反应板
4.2.2注射器(5mL)
4.2.3微量离心管(1.5mL
4.2.4吸头(可与移液器配套》.
GB/T35910一2018 4.3主要试剂 4.3.1PCV2重组核衣壳蛋白(Cap)抗原(见附录A). 4.3.2辣根过氧化物酶(HRP)标记的PCV2单克隆抗体 4.3.3PCV2阳性对照血清和阴性对照血清(见附录A)
4.3.4四甲基联苯胺(TMB)(见附录B) 4.3.5商品化PCV2ELISA抗体检测试剂盒
5 PCV2抗体阻断EI.ISA检测方法 5.1样品采集,运输与保存处理 5.1.1基本要求 按NY/T54采集猪血液,按SN/T2984处理待检猪
另外,按GB19489进行检测
S 5.1.2样品采集与运送 采用消毒注射器经猪颈静脉采集血液2mL,凝固后24h内在冷藏条件下送到实验室
若不能及 时送往实验室,则应分离血清,放人无菌微量离心管中置一20C保存,并在冻结状态下送往实验室
血清分离与保存 5.1.3 取凝固血液,2000r/min离心5min,收集上清,放人无菌微量离心管中,立即用于抗体检测,或置 -20C保存
要求血清清亮,无溶血
5.2ELISA操作步骤 5.2.1抗原包被板的制备 抗原包被;用抗原包被液(见B.1)将PCv2Cap蛋白(见A.1)稀释成2.04g/mL.,加人96孔酶 a 标反应板,每孔100L,置37C2h; 洗涤;倾去孔中液体.用PBST洗涤液(见B.5)洗涤,每孔300L.洗涤3次,每次3min,最后 b -次拍干; 封闭:每孔加人200L1%BSA(牛血清白蛋白)封闭液(见B.2),置37C下孵育3h, c d 加保护剂;弃去孔中液体,按5.2.1b)洗涤3次,加人抗原保护剂见B.3),l00AL/孔,置37C 下作用1h; 密封;置37C晾干,用锡箔纸真空包装,密封
e 5.2.2血清样品稀释和加样: 取出抗原包被板并在记录表(表1)上标记待检样品(YPYP,)的位置
用血清稀释液(见B.4)在 稀释板内将待检血清11稀释,即每孔先加50L样品稀释液,再加50L待检血清,混匀后,按记录 表中标记的对应于抗原包被板上的位序,依次加人到YP、YP、YP、等位置的各孔中
吸取每份 血清时均应更换吸头
待检血清样品数量较多时(>10份),应先使用血清稀释板稀释所有待检血清,再将稀释好的血清 转移到抗原包被板,以尽可能使反应时间一致
GB/35910一2018 表1样品加样记录表(推荐模式 10 ll 12 YP P YP3 B YP YP YP c YP YP YP YP YP D YP YP YP YP YP E YP YP YP7 YP YP YP YP0 YP8 YP YP YP G YP YPm YP9 YP H YP YP P P T? 注;一为阴性对照;十为阳性对照;YP为样品1,其余类推
5.2.3加对照血清;用血清稀释液(见B.4)将阳性对照血清(见A.2.1),阴性对照血清(见A.2.2)分别做 l:1稀释后,各取100L阴性对照血清分别加人A1孔和A2孔,各取100L阳性对照血清分别加人 B孔和2孔
吸取不同血清时需要更换吸头
5.2.4混合孵育:轻轻振荡微量反应板(孔中样品勿溢出),用封条封闭,置37C下孵育2h 5.2.5洗涤;同5.2.1b). 5.2.6加酶标单抗和孵育:每孔加人100AL.工作浓度的HRP标记的PCV2单克隆抗体,37C孵育 30min 该试剂使用前恢复到室温,使用后放回2C8C
5.2.7洗涤:同5.2.1b). 5.2.8显色:每孔加人100LTMB底物液显示液(见B.6),37C避光孵育10min15min,至阴性对 照显蓝色阳性对照基本不显色时,每孔加人50AL终止液(见B.7)
5.2.9在酶联免疫检测仪450nm波长处读取各孔的OD值数,15min内完成
5.3结果判定 5.3.1结果计算 阴性对照平均OD值(NCx)见式(1) NCx=(Al孔OD值十A2孔OD值/2 阳性对照平均OD值(PCx)见式(2): PCx=(B1孔OD值+B2孔OD值/2 ( 样品阻断率的计算见式(3) 阻断率(P-(NC一样品oD值)/Nc.X100% 5.3.2判定 NC、大于0.7,PC、小于0.生时,试验条件成立
当PI>38%判为阳性,P<30%判为阴性,30%< PI<38%判为可疑,对可疑样品重新检测一次,PI<38%,判为阴性
或使用商品化PCV2ELISA抗体检测试剂盒,其操作和判定按其说明书进行
GB/T35910一2018 附录 A 规范性附录 抗原抗体的制备 A.1重组Cap抗原制备 A.1.1菌种 表达抗原蛋白的菌种为L.21-CapC,由含PCv2Cap第51一234aa基因原核表达质粒pET-CapC 转化大肠杆菌BL.21(DE3)获得
A.1.2菌液培养 取BL21-CapC种子液按培养基体积1%量接种于含卡那霉素的LB液体培养基中,200r r/min， 37C摇床振荡培养1.5h一2h,菌液浓度OD.值达到0.6一0.8时,加人IPTG至终浓度 l.0mmol/L,37C振荡培养6h
A.1.3菌体裂解与包涵体蛋白提取 将A.1.2收集的细菌样品4C8000r/min离心5min,PBS缓冲液(0.01mol/L,pH7.2)重悬,如 此洗涤2次;弃上清,用适量PBS重悬细菌沉淀,并反复冻融3次;在功率200w的条件下超声波裂解 细菌,超声裂解5s,停倾5s,直至菌液变得清澈,在冰盒上操作;将上述裂解物4C8000r/min离心 10nmin,沉淀用与上清等体积的PBS重悬
8000r/min离心15min,用包涵体洗液I见B.8)重悬沉 淀，c2h,重复1次;8000r/min离心15min,包涵体洗液I(见B.9)重悬沉淀,4C2h,重复1次; 8000r/min离心15min,用8mol/L尿素重悬沉淀,4放置12h24h;8000r/min离心15min,吸 取上清即纯化后的蛋白)至微量离心管,分光光度计测定蛋白浓度,分装，-20保存
A.1.4重组抗原质量检验 A.1.4.1抗原纯度鉴定 取A.1.3收集的样品,加人25"lL的5×蛋白样品上样缓冲液,充分混匀后100C煮沸5min,立即 置冰上1min一2nmin,上样前瞬时离心,吸取上清,用12%的丙烯酰胺SDsPAGE分析,在41kDa处出 现一条清晰条带,抗原纯度达90%以上
A.1.4.2蛋白抗原性鉴定 取上述收集的样品204L,按A.1.4.1方法进行sDs-PAGE电泳
然后25V恒压下,转印45min 使目的条带转印至NC膜上
用PBsT洗涤液(见B.5)配制的5%的脱脂乳封闭2h,PBsT洗涤后,加 适量稀释的PCV2Cap单克隆抗体,作用1h,PBST洗涤,再加1;20000稀释的羊抗鼠lgGHRP作用 lh,洗涤后加显色液于暗室曝光,应在41kDa处出现单一清晰条带,且无其他杂带
A.1.4.3抗原浓度的测定 用紫外分光光度计分别测定包被抗原在280nm和260nm波长时的光吸收值(OD),按公式 1.45×OD8 -0.74×OD的计算抗原浓度,浓度不低于0.5mg/ml. 8mm"
GB/35910一2018 A.1.4.4抗原免疫学活性鉴定 采用L.IsA方法测定
用抗原包敲液将纯化的蛋白从1.0g/mL稀释至0.2w/ml.,包被 ELISA酶标板,进行ELISA检测
选择阳性对照血清的s/P值高于阳性判定标准时的抗原最高稀释 倍数作为抗原包被浓度
抗原效价应大于0.354E/'ml A.1.5分装及保存 将检测合格的抗原分装到1.5ml微量离心管中,分装量为1mL/管,置一70C下保存,有效期为 12个月
避免反复冻融和污染 A.2PCV2阴性和阳性对照血清制备 A.2.1阳性对照血清 A.2.1.1血清来源动物 4周龄6周龄健康仔猪(ELISA检测血清中PCV2抗体阴性,PCR检测PCV2阴性),隔离观察 7d
A.2.1.2 免疫接种 取PCV2SH株(TCID>10“/ml)病毒液,颈部肌肉注射2ml/头,间隔28d用相同剂量PCV2 再次肌注接种,第二次接种后20d40d采血分离血清,用PCV2间接免疫荧光试验检测PCV2抗体， 抗体效价大于l:64时,即可用于采血并分离血清
A.2.1.3血清制备 采取颈部动脉采血方式无菌采集血液,离心分离血清,用0.45m滤膜过滤除菌
用PCV2间接 兔疫荧光试验检测PCV2抗体,应为阳性
用阻断ELIsA方法检测PCV2ELISA抗体,阻断率均应大 于60%,OD0 .值均应低于04. A..2.1.4血清保存 置一70c以下保存,避免反复冻融和污染,有效期24个月
A.2.2阴性对照血清 A..2.2.1 血清来源动物 同A.2.1.1
血清制备 A.2.2.2 采取颈部动脉采血方式,无菌采集血液,离心分离血清,用0.45m滤膜过滤除菌
用PCv2间接 免疫荧光试验检测PCV2抗体,应为阴性
阻断:LISA方法检测阻断率均低于30%,OD0值均应大 于0.7
A.2.2.3血清保存 同A.2.1.4
GB/T35910一2018 附录 B 规范性附录 溶液的配制 抗原包被液(pg.6,0.05mo/L) B.1 称取Na.co1.59g、NaHco2.93g,加去离子水800nmL,用1nmol/I的NaOH和1mol/L的 HCl调pH值至9.6,加去离子水定容至1000ml
B.2 封闭液 称取BSA1g,溶解于100mLPBST洗涤液中,0.22Hm滤膜过滤,分装后4保存
保护剂 B.3 称取BSA0.5g,蔗糖2g,加去离子水溶解并定容至100mL,0.22pm滤膜过滤,分装后2C8C 备用
B.4样品稀释液 取NaCl8g,KHPO
2H.00.2g,NagHPO
2H.02.9gKCl0.,2g和Tween-200.5ml,溶 于灭菌去离子水中,定容至10001 mL,0.224m滤膜过滤,分装,20mL/瓶
2C8C下保存
B.510倍浓缩洗涤液 取NaCl80g,KH.PO2H.O2g,NaHPO12H,029g,KCl2g、Tween-205mL.,加人灭菌 去离子水充分溶解,定容至1000ml,0.22m滤膜过滤,分装,80mL/瓶
2C8C下保存
PBST洗涤液配制将10倍浓缩洗涤液恢复至室温,并摇动使沉淀溶解或于37C水浴锅中加热 5min10mim),然后用去离子水作10倍稀释,混匀,稀释好的洗涤液在2C8C可以存放7d
B.6 显色液 A液配制;取NaHPO14.6g、柠檬酸9.33g,30%Hl,O2mL,加双蒸水至1000ml,调pH至 5.2 B液配制;取四甲基联苯胶(TMB)20mg.无水乙醉10mL,加双蒸水至1000mL. 使用前将A液和B液等量混合,分装于棕色瓶内,20mL/瓶,2C8下避光保存
B.7终止液2mol/LH,SO 取去离子水177.8mL,缓慢加人HsO,(96%)22.2mL,分装,10mL/瓶,2C8C下保存
GB/35910一2018 B.8包涵体洗液IpH8.0 取TrisHCl6g,NaCl5.8g,EDTA2.92g、TritonX-10010mL,用去离子水加至1L B.9包涵体洗液I(pHH8.0 取TrisHCl6g、NaCl5.8g,EDTA2.92g、TritonX-1005ml,用去离子水加至1L
猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测方法GB/T35910-2018
猪圆环病毒2型是一种主要感染猪只的病毒，对猪产生严重危害。因此，及时准确地检测猪圆环病毒2型是保障猪健康的关键。而阻断ELISA法是一种常用的抗体检测方法，可以高效、快速地检测样品中特定抗体的含量。
GB/T35910-2018是中国国家标准化管理委员会发布的《猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测方法》标准，规定了猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测的具体步骤和操作要求。
猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测方法GB/T35910-2018的具体步骤：
1. 样品处理：
将样品离心去除杂质，然后进行稀释。通常使用PBS缓冲液进行稀释。
2. 加入抗原：
在96孔板中加入猪圆环病毒2型抗原，并将其孵育在37°C下约30分钟，使其充分吸附在孔板表面。
3. 加入样品：
将经过稀释的样品加入到孔板中，与抗原结合。同时，在其中加入阴性对照和阳性对照。
4. 清洗：
用洗涤缓冲液清洗孔板，去除未结合的物质。
5. 加入检测抗体：
将检测抗体加入孔板中，与已有的复合物反应。
6. 加入底物：
加入TMB底物，使含有检测抗体的孔板呈现蓝色。随着底物的反应，颜色会逐渐变深。
7. 停止反应：
加入硫酸将反应停止，使孔板呈现黄色。
8. 检测结果：
使用酶标仪检测各孔的吸光度值，计算样品中特定抗体的含量。
总之，猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测方法GB/T35910-2018是一种简单、快速、准确的检测方法。通过严格遵守该标准所规定的步骤和操作要求，可以确保检测的准确性和可靠性，为猪圆环病毒2型的防控提供有力支持。
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