水生动物病原DNA检测参考物质制备和质量控制规范质粒

水生动物病原DNA检测参考物质制备和质量控制规范质粒

国家标准 GB/T41185一2021 水生动物病原DNA检测参考物质制备和 质量控制规范质粒 Specificeationofpreparationandqalitycontrolofrefereneemateriasfor DNAdeteetionofaguaticanimalspathogen一Plasmid 2021-12-31发布 2022-07-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花警理委员会国家标准
GB/41185一2021 前 言 本文件按照GB/T1.1一2020<标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由农业农村部提出 本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口 本文件起草单位:检验检疫科学研究院、北京海关、连云港海关 本文件主要起草人:林祥梅、张昱、王娜、吴绍强、景宏丽、谷强、任彤、周毅、江育林
GB/41185一2021 水生动物病原NA检测参考物质制备和 质量控制规范质粒 范围 本文件给出了作为水生动物病原DNA检测阳性参考物质的质粒,其质量控制规范术语和定义、缩 略语、原理试剂或材料、仪器设备,规定了质粒制备的通用要求、质粒的质量控制、质粒的验证,以及质 粒的质量评价方法 本文件适用于水生动物病原DNA核酸检测中质粒的制备和质量控制 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SC/T7019水生动物病原微生物实验室保存规范 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 变异系数coefficientofvariationm 概率分布离散程度的一个归一化量度,其定义为数据标准差与数据平均值之比 3.2 初始样rrontsaple 按照制备先后顺序,最先制备的1/3批次产品 3.3 均匀性uniformity 同一生产批次的质粒,每支含有等量目的基因的状态 3.4 溯源性traeeability 质粒中目的基因序列与病原参考毒株序列的一致性 3.5 稳定性stabilty 质粒在特定保存条件和保存时间范围内,保证检测结果为阳性的能力 3.6 阳性参考物质posi sitiverefereneematerial 与病原拥有某些完全相同的特征,如相同的目的基因序列抗原性、敏感性等,用于该病原检测一定 会得出理想的阳性检测结果,通常作为阳性对照判定待测样品是否为病原阳性
GB/T41185一2021 3.7 中间样middlesample 按照制备先后顺序,中间制备的1/3批次产品 3.8 终止样finalsample 按照制备先后顺序,最后制备的1/3批次产品 3.9 最小有效取样量minimumeffeetivesamplevolume 使用病原检测方法,可检测出阳性结果的最小阳性参考物质的量 缩略语 下列缩略语适用于本文件 Amp;氨节青霉素(ampicillin) Ct:扩增循环数(eyclethreshold DNA;脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicaed) dATP:三磷酸腺哪岭脱氧核苷酸deoxyadenosinetriphosphate cTP三磷酸胞喘晓脱氧核苷酸(doxyeyidimetiphoplhan te dGTP:三磷酸鸟喋岭脱氧核苷酸(deoxyguanosinetriphosphate dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate dTTP:三磷酸胸腺唁唁脱氧核苷酸(deoxythym nidinetriphosphate) EB;澳化乙锭(ethidiumbromide) IPTG;异丙基-8-D硫代半乳糖苷(isopropylbeta-D-thiogalactopyranoside) LB:营养肉汤(Iuria-bertanibroth PCR;聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) PCR;实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitativerealtimepolymerasechainreaction) Taq:水生嗜热菌(Ther r4saqatic4s 5 原理 利用基因重组技术,将目的DNA片段连接人空质粒中,再将连接产物转化人感受态细胞,筛选出 含有阳性重组质粒的细胞,再从细胞中提取质粒,制备流程按照附录A进行 为满足病原分子生物学 检测要求,作为DNA参考物质的质粒应具备以下特征;包含有针对检测病原的目的DNA片段;不易降 解,不会丢失病原DNA片段;易于大量制备提纯;可用于病原定性或定量检测 试剂或材料 6.1水:;符合GB/T6682中一级水规定 6.2PCR试剂和qPCR试剂商品化试剂 6.3扩增病原目的基因的引物可参照相应的国家标准或行业标准合成 6.4琼脂糖;电泳纯
GB/41185一2021 6.5空质粒;商品化试剂 6.6经高温高压灭菌处理的水、缓冲液离心管,试管,PCR管,移液器枪头、培养皿、三角瓶,涂布棒或 棉签 6.7制备质粒所需的其他试剂;按照附录B配制 仪器设备 7.1超净工作台 7.2高速冷冻离心机 7.3电子天平 7.4 高压灭菌锅 PCR仪 5 7.6荧光定量CR仪 77 电泳仪 7.8紫外分光光度计 7.9凝胶成像系统 7.10移液器 8 质粒制备的通用要求 8.1目的DNA的选择 目的NA片段应含有该病原检测方法中推荐的全部目的基因序则 8.2空质粒的选择 空质粒应具备以下特征: 多克隆位点可以容纳全部目的基因片段; a b性质稳定,不易产生基因变异; 具备抗生素抗性基因或lacZ基因,转化人感受态细胞后可进行抗性筛选或蓝白筛选 c 8.3连接反应 连接反应前,目的DNA片段和空质粒应提纯 8.4连接产物转化入感受态细胞 每批转化实验,应设置未处理的感受态细胞作为空白对照、转化空质粒的感受态细胞作为阴性对 照,转化已知重组质粒的感受态细胞作为阳性对照 只有在空白对照、阴性对照和阳性对照都成立的情 况下,才能判定连接产物是否转化人感受态细胞 8.5质粒的纯度检测 使用紫外分光光度计测量质粒的Am/A比值 若比值介于1.8一2.0之间,则纯度合格;否则需 重新提取
GB/T41185一2021 质粒的质量控制 9.1质粒的定性检测 9.1.1PCR检测 以质粒溶液为模板,同时设立阴性对照(水)和阳性对照(病原DNA),进行PCR检测,电泳观察检 测结果,或使用质粒上的通用引物做PCR检测 9.1.2目的基因的溯源性分析 对质粒多克隆位点进行测序,测序结果与相应病原参考株的序列进行比对 9.1.3结果判定 在阴性对照和阳性对照都成立的情况下 可检测到目的DNA,且测序结果与相应病原参考株的序列同源性至少达到99%,则质粒可作 a 为阳性参考物质用于病原的定性分子生物学检测; b 无明显的目的DNA,或测序结果与相应病原参考株的序列同源性低于99%,则说明病原目的 DNA并未正确插人质粒,或质粒提纯失败,需重新制备提纯 9.2质粒的定量检测 9.2.1qPCR方法 以目的DNA中的保守序列为模板,设计引物和探针 分别以质粒和空质粒为模板进行qPCR,对所设计的引物探针进行特异性检测 质粒检测结果为阳性,空质粒为阴性,则该套引物探针可以特异性扩增目的DNA,可用于目的 a DNA的定量检测; 检测结果都为阳性,则该套引物探针也可以与空质粒某段基因反应,不能用于目的DNA的定 b 量检测,应重新设计引物探针; 检测结果都为阴性,则该套引物探针不能与目的DNA反应,应重新设计引物探针,或优化反 应体系和反应条件 9.2.2标准品的选择和定量 将纯化的目的DNA作为标准品,用于qP(CR标准曲线的制备 使用分光光度计测量目的DNA的质量分数,再根据公式(1)换算成拷贝数浓度 6.02×10×N/Mw=Y 式中 N -目的DNA的质量分数,单位为克每毫升g/mL); Mw 分子量的数值,单位为克每摩尔(g/mol): -目的DNA溶液拷贝数浓度的数值,单位为拷贝数每微升copies/L) 目的DNA拷贝数浓度不应低于10"copies/L拷贝数,若低于此浓度,应加大DNA提取量,再 提纯
GB/41185一2021 9.2.3制备标准曲线 9.2.3.1将标准品(目的DNA溶液)10倍梯度稀释5次 9.2.3.2使用9.2.1设计的引物探针,以标准品原液及5次梯度稀释溶液为模板,进行qPCR扩增 9.2.3.3以标准品Ct值和对应的拷贝数,制备标准曲线,曲线横坐标为反应体系中加人样品的拷贝数 纵坐标为Ct值;标准曲线R值不低于0,.98 若各稀释度标准品的Ct值无法形成良好的线性关系,需 重新梯度稀释标准品,制备标准曲线 9.2.4质粒中病原DNA的定量 9.2.4.1使用9.2.1设计的引物探针,以提纯的质粒为模板,设置3个平行对照,测定质粒的Ct值 9.2.4.2以水为模板设置阴性对照,以病原DNA为模板设置阳性对照 9.2.4.3在阴性对照和阳性对照都成立的情况下,根据标准曲线,3个平行对照样品Ct值分别对应3个 拷贝数,将拷贝数平均值除以反应体系中加人的样品体积,即为质粒真实的拷贝数浓度 若质粒的Ct 值小于标准品原液的Ct值,需将质粒稀释10倍或100倍后,重新进行定量 9.3最小有效取样量的测定 在已知浓度的基础上,分别取0.5L、1AL、2L5L和10L 质粒溶液作为模板,按照相应病原 检测方法推荐的方法进行核酸扩增,观察检测结果 获得阳性结果的最低模板量为最小有效取样量 9.4质粒均匀性检测 9.4.1检测方法 g.4.1.1以初始样、中间样、终止样三阶段分别随机抽取共10份质粒样品 分别以10份质粒为模板,使用相应梢原检割方法推荐的引物和实验条件逃行CR或qPCR 9.4.1.2 扩增 9.4.1.3PCR产物电泳,或qPCR产物读数并计算变异系数 9.4.2质粒均匀性判定 均匀性判定方法如下: 10份质粒样品的检测结果全部为阳性,PCR扩增的10条DNA条带亮度相近,或qPCR得出 a 的10份样品C值变异系数10%,表明样品均匀性良好; 有样品为弱阳性,甚至为阴性;或qPCR的10份样品C值变异系数>10%,则表明样品均匀 b 性不良,需重新混匀分装 9.5质粒稳定性检测 设置3组质粒样品,分别放置于37C、4C,-20C保存 分别在第1天,第3天、第5天,第7天、 第2周、第3周、第1月直至第1年时间段,每组各取3支样品,1个样品应至少设3个重复,使用相应 病原检测方法推荐的引物和实验条件进行检测 若质粒经以下3种方法平行处理后,PCR或qPCR检测结果仍为阳性说明稳定性良好,否则需重 新制备 37C至少保存7d a
GB/T41185一2021 b)4C至少保存3周 -20C以下至少保存1年 c 9.6质粒的保存 9.6.1质粒溶液的保存 质粒原液分装成50L/管,低于一20C条件下保存不超过1年,避免反复冻融,C条件下保存不 超过3周 使用时取出相应的量,根据9.2规定的方法重新检测合格后使用 9.6.2携带质粒菌株的保存 符合sC/T7019的规定 0质粒参考物质的验证 质粒作为水生动物病原DNA检测参考物质,应经过至少5家具备核酸提取和分子生物学检测能 力的水生动物检测实验室的协作定值,定值内容包括病原目的DNA片段的特异性、定性检测、定量检 测等内容,定性检测要求检测结果为阳性,定量检测要求Ct值误差范围不超过士3.3 定值结果都合格 后,才能投人使用 质粒参考物质的质量判定 1 经9.1一.6步骤检测,质粒应同时满足以下5项要求,才能作为水生动物病原DNA核酸检测参考 物质使用 重组了病原目的DNA片段,且片段序列与相应病原的参考株序列同源性不低于99% a b)每个反应体系的最小取样量不高于病原检测标准推荐的反应体系的加样量 同批次样品均匀性良好,检测结果基本一致; c 有效期:37C至少保存7d,4C至少保存3周,-20C至少保存1年 d 经过至少5家水生动物检测实验室协作定值,且定值结果全部合格
GB/41185一2021 附 录 A 规范性) 质粒制备方法 A.1试剂或材料 A.1.1水:符合GB/T6682中的一级水的要求 A. .1.2目的基因凝胶回收试剂和质粒提取试剂:商品化试剂盒 A.1.3空质粒;pG;EM-T,pUCm-TpBLUE-T等商品化试剂 A.1.4dNTP含dCTP,dGTP,dATP,dTTP各2.5mmol/L A.1.5TaqDNA聚合酶;5U/L,-20C保存,避免温度剧烈变化 A.1.6扩增病原目的基因的引物;根据国内外相应病原检测标准推荐的引物序列合成 A.1.7T4DNA连接酶;350U/AL,一20C保存,避免温度剧烈变化 A. .1.8IPTG;20%,按照附录B的B.1配制 A. .1.9 -gal:2%,按照B.2配制 A. ..1.10大肠杆菌感受态DH5a;商品化试剂 A.1.11LB培养基:按照B.3配制 A.1.1250×电泳缓冲液;按照B,4配制,也可选择商品化试剂 A.1.13溴化乙锭;10mg/mL,按照B.5配制,也可选择商品化试剂 A.1.146×上样缓冲液;按照B.6配制,也可选择商品化试剂 A.1.15经高温高压灭菌处理的耗材 A.2仪器设备 A.2.1生化培养箱 A.2.2恒温摇床 A.2.3超净工作台 A.2.4冷冻高速离心机 A.2.5电子天平 A.2.6高压灭菌锅 A.2.7PR仪 A.2.8荧光定量CR仪 A.2.9电泳仪 A.2.10紫外分光光度计 A.2.11凝胶成像系统 A.2.12移液器 A.3质粒参考物质的制备 A.3.1目的DNA的扩增 PCR扩增所使用的引物和反应条件采用国内外已发布的病原检测方法中推荐的引物和反应条件， 以病原基因组DNA为模板,使用TaqDNA聚合酶及其专用缓冲液进行PCR扩增 反应产物至少为 200 Al
GB/T41185一2021 A.3.2CR反应产物的上样和电泳 将50×电泳缓冲液稀释50倍,配制1%的琼脂糖(含0.5g/mlEB)凝胶平板 将全部CR扩增产 物和1/5体积的上样缓冲液混匀后加人样品孔 在电泳时使用核酸分子量标准参照物作对照 5V/cnm min30min， 电泳20 ,当澳酚蓝到达凝胶平板2/3处时停止 A.3.3目的NA的回收 在紫外灯下观察电泳后的凝胶,切下含目的基因的条带,放人离心管中 采用商品化凝胶回收试剂 盒提取目的DNA 最后使用20AL水溶解DNA,-80笔保存备用 A.3.4目的DNA连接入空质粒 根据分子量计算目的DNA和pGEMTeasy的摩尔浓度,质粒连接目的基因体系应符合表A.l 要求 表A.1质粒连接目的基因体系 试剂 加人量 10×T4DNALigaseBuffer 2.5AL 目的DNA 0.3pmol pGEM-Teasy 0.03pmol T4DNA连接酶 lL 加水至总体积25A ddH.O 反应条件;16C,至少12h A.3.5连接产物的转化与蓝白筛选 A.3.5.1取100ML大肠杆菌DH5感受态溶液于1.5mL离心管中,加人10L连接产物,将离心管置 冰浴30min,42C水浴90s,再冰浴5min;加人900LLB培养液,混匀,37C振荡培育1h A.3.5.2取100L菌液,加人40L.X-gal溶液(2%)和7AlLIPTG(20%),混匀后,均匀涂布于含 150 g/ml.Amp的LB平板(90mm直径)上;室温放置5min后,37C倒置培养12h一16h. A.3.5.3另取100AL感受态溶液,不加连接产物,为阴性对照,同A.3.5.2操作 A.3.5.4培养结果观察;蓝色菌落携带空质粒,乳白色菌落携带质粒;若未加人连接产物的菌液也生长 出菌落,说明培养基中Amp失效,需重新制备平板进行蓝白斑筛选 A3.5.5将平板放于4C保存备用 将1.5mL携带质粒的细菌菌液与0.5mL60%灭菌甘油混匀,保 存于-80C或液氮中 A.3.6质粒的提取 A.3.6.1挑白斑单菌落,放人3mL 含1004g/mL Amp的LB液体培养基中,37C摇菌过夜 取 1.5ml菌液4笔保存,剩余1.5mL菌液用于提取质粒 A.3.6.2使用商品化质粒提取试剂盒提取菌液中的质粒,加人50AL超纯水溶解，一20C保存备用
GB/41185一2021 录 附 B 规范性 试剂及其配制 IPIG(20% B.1 8ml水溶解2glPTG,定容至10mL,0,.224m过滤器过滤除菌,分装成1nmL,一20C保存 B.2X-gal2% 用二甲基甲酰胺溶液10mL溶解0.2gX-gal,分装成1mL,使用棕色容器或锡箔纸包裹,-20C 避光保存 B.3LB培养基 10 胰蛋白胯 g 酵母提取物 5g NaCI 10 g 若配制固体LB培养基,再加人15g琼脂 加800ml.双蒸水完全溶解 用10mol/L的NaOH和5mol/L的HC调pH至7.07.4,再定容至1000mL,120C高压灭菌 20min 备用 B.4TAE电泳缓冲液(50× 242 Tris碱 g 57.1mL 冰乙酸 100mL EDTA(0.5mol/L,pH8.0 加水至1L溶解混匀 使用前加水稀释至1× B.5澳化乙锭(10mg/mL) 100ml水中加人1g嗅化乙锭,完全溶解后,使用棕色容器或锡箔纸包裹,密闭避光保存 用时每 10ml琼脂中加0.5AL B.66×上样缓冲液 澳盼蓝10mg,加双蒸水5ml在室温下过夜,待游解后再称取蔗糖25g,加双蒸水游解后移人澳 酚蓝溶液中,摇匀后定容至50mL加人氢氧化钠1滴,调至蓝色

水生动物病原DNA检测参考物质制备和质量控制规范质粒GB/T41185-2021

水生动物病原DNA检测是一项重要的技术，在水产养殖、水产品加工等领域具有广泛的应用。然而，由于复杂的样品矩阵以及检测条件的不确定性，病原DNA检测结果可能存在误差。因此，建立高质量的参考物质和质量控制规范，对于保证病原DNA检测的准确性和可靠性具有重要意义。

GB/T41185-2021是水生动物病原DNA检测参考物质制备和质量控制规范质粒的标准，规定了参考物质的制备、测试、分装和保存等要求，以及质量控制规范的建立和实施方法。该标准旨在为水生动物病原DNA检测提供参考和指导。

根据该标准的要求，参考物质应当是一种稳定的、可追踪的、能够代表实际样品特征的物质。制备参考物质时需要考虑样品来源、处理方式、质量控制等因素，并进行系统的验证和评估。而质量控制规范则包括了实验室设备、试剂的选择和使用、数据分析等多个方面。

此外，该标准还规定了参考物质和质量控制规范的检测方法和要求，例如：参考物质宜采用实时荧光PCR技术检测其含量，而质量控制规范的实施应当采用双盲对照试验的方式进行。

总之，GB/T41185-2021为水生动物病原DNA检测参考物质制备和质量控制规范质粒提供了明确的要求和实施方法，有助于提高水生动物病原DNA检测的准确性和可靠性，为水产养殖和水产品加工等领域的发展提供有力支持。

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2022/7/8 0:11:07 即将实施