国家标准 GB/28071一2011 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法 Deteetionandidenifieationofeueumbergreen m0ttlem0SaicVirS 2011-12-30发布 2012-06-01实施国家质量监督检监检疫总局发布国家标准花管理委员会国家标准
GB/T28071一2011 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标淮起草单位厦门出人境检验检疫局、广东出人境检验检疫局、检验检疫科学研究院本标准主要起草人:陈青、陈红运、廖富荣、林石明、吴冰冰、冯黎霞、张永江
GB/T28071一2011 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法范围本标准规定了黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法本标准适用于可能携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的种子、苗木及其产品的检疫鉴定黄瓜绿斑驳花叶病毒基本信息中文名;黄瓜绿斑驳花叶病毒学名:cueumbergreenmottlemosaicvirus 缩写;CGMMv 属烟草花叶病毒属Tobamoirus成员 cGMMV可通过接触传播也可通过种子传插蚜虫等常见瓜类病毒的传播介体不能传播 cGMMV 嫁接等农事操作是田间病害流行的主要因素之一植株一旦发病,如果未进行杀灭处理,士壤也可带毒,带毒土壤也可成为病害发生的侵染源黄瓜绿斑驳花叶病毒的其他信息参见附录A 方法原理通过基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAsELISA、体外反转录和体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),并根据生物学特性进行检测鉴定仪器设备、用具及试剂仪器设备洗板机、酶联检测仪,高速冷冻离心机、电子天平感量0.001g),超净工作台,旋涡混合仪、PCR 仪,实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽,紫外透射仪、,隔离温室、榨汁机,水浴锅 4.2用具微量移液器(0.5AlL,2AlL,10AlL,20ML,l00L,200L,l000AL)、化学PG;R反应管和(或)96孔光化学PCR反应板、酶联板、研钵 4.3试剂 4.3.1酶联测定试剂见附录B) 4.3.2RT-PCR检测试剂(见附录c) 4.3.3实时荧光RT-PCR检测试剂(见附录D) 4.3.4生物学测定(参见附录E)
GB/r28071一2011 样品制备种子样品制备及检疫鉴定挑取500粒种子(重点挑取畸形、不成熟的种子)播于灭菌土中,待长出3片4片叶后将表现症状的植株编号,未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号采集的叶片分成两份,分别用于酶联测定和分子生物学检测也可以挑取畸形将不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测 5.2苗木检验鉴定有症状的苗木单独检测没有症状的分组检测,分组方法和检测方法同5.1 5 植物产品的检验鉴定植物产品有症状的部分(如:果实上的畸形、斑驳等)单独检测没有症状或无法观察症状的植物产品,应按比例取样,检测方法为酶联测定和分子生物学检测检测方法 6.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定把制备的样品上清液加人已包被CGMMV抗体的96孔酶联板中,进行DAs-ELISA检测每个样品平行加到两个孔中健康的植物组织作阴性对照,感染cGMMV的植物组织作阳性对照,样品提取缓冲液作空白对照,其中阴性对照种类和材料(如种子或叶片)应尽量与检测样品一致具体操作见附录B 6.2RT-CR检测分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后,进行PCR扩增健康的植物组织作阴性对照,感染cGMMV的植物组织作阳性对照,用超纯水作空白对照具体操作见附录c 6.3实时荧光RT-PCR检测分别提取样品和对照的总RNA,进行实时荧光RT-PCR检测健康的植物组织作阴性对照,感染 CGMMv的植物组织作阳性对照,超纯水作空白对照具体操作见附录D 生物学接种试验参见附录E 结果判定 6.1,6.2,6.3,6.4中如果两种方法的检测结果为阳性,即可判断该批种子或苗木携带黄瓜绿斑驳花叶病毒一般是酶联测定为阳性后,RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阳性即可判断为携带黄瓜绿斑驳花叶病毒必要时可进行生物接种试验
GB/T28071一2011 样品保存经检验确定携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的样品应在合适的条件下保存,种子保存在4C,病株在 20C或者一80C冰箱中保存,做好标记和登记工作结果记录与资料保存完整的实验记录包括样品的来源、种类、检测时间,地点,方法和结果等,并要有经手人和检测人员酶联测定应有酶联板反应原始数据,RT-PCR检测应有扩增结果图片,生物学接种应有症状的签字照片
GB/r28071一2011 附录A 资料性附录黄瓜绿斑驳花叶病毒简介 A.1寄主范围黄瓜绿斑驳花叶病毒在自然界主要侵染西瓜(Ci/rulluslanat4s)、甜瓜(Cucumi、melo),黄瓜 Cucumissatius)南瓜(Cucurbitamoschata、弧子(lagenariasiceraria,丝瓜(Lufacylindrica、苦瓜Momordicacharantia等葫芦科植物一些杂草也是cGMMV的寄主,主要包括北美览 Amaranhusblitoides),反枝览(Amaranhusrelrolerus),天芥菜(Heliotropiumeuropaeum)、马齿苑(Portulacaoleracea)龙葵(Solanumnigrum)等 A.2病害症状黄瓜;叶片斑驳并凸起,畸形,植株矮化,果实上可产生黄或银色条斑,果实严重受损西瓜:受侵染叶片轻型叶斑驳,严重时出现庖斑,植株矮化,成熟期果实表面出现浓绿色圆斑,果肉变色和腐烂甜瓜:茎端新叶出现黄斑,随叶片老化症状减轻弧子:叶片出现花叶,有绿色突起,脉间黄化,叶脉呈绿带状 A.3分布地区 cGM于193年在英国首次发现和报道目前在英国、希腊、罗马尼亚、匈牙利、印度、沙特阿拉伯、丹麦,德国、俄罗斯、保加利亚,捷克,巴西,爱尔兰、摩尔多瓦、蹦典,芬兰、韩国、朝鲜,以色列,波兰、日本、巴基斯坦和我国的大陆和台湾均有分布 A.4血清学特性 CGMMV具有很强的免疫原性 A.5粒体形态黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体为直杆状,长度为300nm,直径为18nm A.6基因组病毒基因组为正单链RNA,全长约6.4kb,编码4个蛋白;病毒基因组5'和3'端分别含有一段非编码区
GB/T28071?2011 ? B 淶?? ??? B.1? B.1.1 ??????塣 B.1.2?? ???????塣 B.1.3 (pNPP B.1.4PBsT?(???p7.4) 8.0g NaC Na,HPO 1.15g KH,PO 0.2g KCI 0.2g 0.5mL Tween-20 900mL??,NaOHHcpH?7.4,?1L ?PESм0.5mlTween-20 B.1.5???pH7.4 PBST 1L NaSO 1.3g PVP(MW2400040000) 20 g NaN 0.2g Na(OHHClpH?7.44C档 B.1.6?p9.6) Na,CO. 1. 59g NaHHcO 2.93g NaN 0.2g 0mL??ν,Hc1?pH?6,1L1 B.1.7?????(plH7.4) PBST 1 BSA(???)?? 2.0g
GB/r28071一2011 PVP(MW2400040000 20.0g NaN 0.2g 用NaOH或HCl调节pH值到7.4 4储存 B.1.8底物(pNPP)缓冲液(pHH9.8 MgC 0.1g NaNa 0.2g 二乙醇胺 97ml 溶于800mL燕僧水中,用Hc调pH值至9.8,蒸溜水定容至1L 4C储存 B.2程序 B.2.1包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释,加人酶联板的孔中,100AL/孔,加盖,室温避光孵育4h或4C 冰箱孵育过夜,清空酶联板孔中溶液,PBST洗涤4次一6次 B.2.2样品制备待测样品按1;10(质量;体积)加人抽提缓冲液,用研钵研磨成浆,2000r/min,离心10min,上清液即为制备好的检测样品样品提取缓冲液作空白对照,阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行 B.2.3加样加人制备好的检测样品,空白对照,阴性对照、阳性对照,100L/孔,加盖,室温避光孵育2h或4C冰箱孵育过夜,清空酶联板孔中溶液.PBST洗涤4次一6次 B.2.4加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度,并加人到酶联板中,100L/孔,加盖室温避光孵育2h,清空酶联板孔中溶液,PBST洗涤4次6次 B.2.5加底物将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用),按100AL/孔,加人到酶联板中,室温避光孵育 B.2.6读数用酶联检测仪在30min、1h和2h于405nm处读OD值 B.3结果判断 B.3.1对照孔的OD值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔),应该在质量控制范围内,即缓冲液孔和阴性对照孔的OD值<0.15,当阴性对照孔的oD值之0.05时,按0.05计算阳性对照有明显的颜色反应;阳性对照OD值/阴性对照OD值>2;孔的重复性基本一致 B.3.2在满足了B3.1】质量要求后,结果原则上可判断如下样品oD值/阴性对照oD丽值明显>2,判为阳性
GB/T28071一2011 样品OD值/阴性对照OD值在阔值附近,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验证样品OD值/阴性对照OD值明显<2,判为阴性若满足不了B.3.1质量要求,则不能进行结果判断
GB/r28071一2011 c 附录规范性附录 RT-PCR检测 C.1试剂 C.1.1RNA提取试剂 TRIzolreagent、三氯甲婉、异丙醇、75%乙醉 c.1.2反转录试剂 M-MIVRT(200U/nlL)、5×RT缓冲液、,dNTP(10mmol/L),RNaselnhitbitor(40U/L) C.2PCR试剂 10×PCR缓冲液含15mmol/L的Mg+、TaqDNA聚合酶(5U/al)、dNTP混合液各 10mmol/L) C.3实验步骤 C.3.1总RNA提取称取0.1g植物组织加液氮研磨成粉末状,迅速将其移人灭菌的1.5mL离心管中,加人1mL的 TrizoL试剂,剧烈振荡摇匀,室温静置3min;4C,12000离心10min,取上清液;加人200l三叙甲烧，上下颠倒混匀,室温静止3min;4C,12000尽离心10min,取上层水相;加等体积的异丙醇,颠倒混匀;4C,12000 离心10min,弃上清;加1mL75%的乙醉洗涤沉淀4C,7500片离心5min,弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后,溶于30nL经DEPc(焦碳酸二乙醋)处理的ddH.o,一20保存备用 C.3.2RT-PCR反应 C.3.2.1引物序列上游引物cGMMV1:5'-CgTggTAAgCggCATTcCTAAAcCTC3” 下游引物CGMMV2:5'-CCgCAAACCAATgAgCAAACCg-3’ RT-PCR产物大小654bp C.3.2.2eDNA合成反转录总体系为12.5AL 在PCR管中依次加人3L总RNA,1l.cGMMv2引物,在65C温浴7nmin,然后,冰浴5min,瞬离,再向PCR管中加人下列试剂.MMIVRT(200U/AL)0.了L.5× RT缓冲液2.5l,dNTP(10mmol/L)0.5l,RNasin(40 U/AL)0.5AL.,DEPC处理的ddHO 4.5L 反应参数.37C60mim.95C10min 合成的cDNA于一20C冰箱保存备用. C.3.2.3PCR扩增 PCR反应体系见表C.1 反应参数;95C4min;95C60s,60C50s,72C60s,30个循环; 72Cl0min 也可采用一步法RT-PCR试剂盒进行扩增
GB/T28071一2011 表C.1PCR反应体系 10×R缓冲液 2.5 dNTP(10mmol/L cGMMV1(20 0.5 pmol/AL) 0.5 cGMIMV2(20pmol/L Taq酶(5U/aL 0.2 cDNA模板 3.0 ddHO 补足反应总体积至25AL C.3.3琼脂糖电泳 C.3.3.1制备凝胶配制1.0%质量浓度)的琼脂糖凝胶澳化乙铵可直接加人琼脂糖凝胶中(浓度为0.54g/mL). 也可在电泳完成后用澳化乙锭染色 C.3.3.2电泳用1AL6×加样缓冲液与5样品混合,然后将其和适合的DNA相对分子质量标准物分别加人到琼脂糖凝胶孔中接通电源,以3V/em5V/em电场强度进行电泳,约0.5h后观察结果 c.3.3.3结果观察电泳结束后,将琼脂糖凝胶放人装有0.54g/AL的嗅化乙锭(EB)溶液的容器中染色,然后在清水中清洗后,置于紫外透射仪上观察,拍照并保留结果 C.4结果判断阳性对照在654bp左右处有扩增片段,阴性对照和空白对照无特异性扩增,样品出现与阳性对照 -致的扩增条带,可判定为阳性阳性对照,阴性对照和空白对照正确,样品未出现与阳性对照一致的扩增条带,判定结果为阴性
GB/r28071一2011 附录D 规范性附录实时荧光RT-PCR检测 D.1主要试剂 RNA提取试剂见C.1.1 TagMan(O)ne-StepRT-PCRMasterMixReagents D.2实时荧光Rr-PCR检测 D.2.1引物与探针引物和探针序列见表D.1 表D.1引物和探针序列及其在基因组中的位置引物和探针序列位名称置 cGMMV-F 6284nt一6304nt 5'gCATAgTgCTTTccCgTTCAC-3” ”-TcAgAATTACTgcccATAgAAAC3 cGMMV-R 6361nt一6384nt CGMMV-P 6315nt6337nt CggTTTgCTCATTggTTTgCggA D.2.2lRNA提取操作方法见C.3.1 D.2.3反应体系实时荧光PCR反应体系见表D.2 表D.2实时荧光RI-PCR反应体系加样量试剂名称 Al 2×MasterMixwithoutUNG 25.0 40×MuliSeribeandRNaselnhibitorMix 1.25 CGGMV模板(RNA 3,0 CGMMV-F(20Amol/L 1.0 cGMMv-Rd (20Mmol/L 1.0 cGMMV-P(20umol/L 0.5 DEPC处理水补足反应总体棋至儿 10
GB/T28071一2011 D.2.4实时荧光RT-PCR反应参数检测CGMMV反应参数见表D.3 表D.3实时荧光RT-CR反应参数用温度作时间反转录 48 30min 活化DNA合成酶和预变性 95C 10min PCR(40个循环变性 95 C 15s 延伸 60 1min D.3结果判定检测样品的Ct值大于或等于40时,则判定黄瓜绿斑驳花叶病毒阴性检测样品的Ct值小于或等于35时,则判定黄瓜绿斑驳花叶病毒阳性检测样品的Ct值小于40而大于35时,应重新进行测试,如果重新测试的Ct值大于或等于40时则判定黄瓜绿斑驳花叶病毒阴性;如果重新测试的Ct值小于40,则判定黄瓜绿斑驳花叶病毒阳性
GB/T28071一2011 附录 E 资料性附录生物学接种 E.1接种病叶加1:3(质量:体积)的磷酸盐缓冲液(0.01nmol/L,pH7.2)于研钵中充分研碎,在待接种植物叶片表面均匀洒上硅藻土,用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面 E.2寄主及症状 E.2.1鉴别寄主黄瓜(Cucumissatiows);系统侵染;褪绿斑;花叶西瓜(Cilrulluslanalas);系统花叶 E.2.2枯斑寄主苑色黎(Chenopodiumamaranticolour):局部侵染;枯斑曼陀罗(Dalura.s/ramonium);局部侵染;枯斑碧冬茄(Pet rida);局部侵染;枯斑 2tia ahyhr

黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法GB/T28071-2011

引言

黄瓜绿斑驳花叶病毒是黄瓜等作物上的一种常见病毒，严重危害农业生产和经济发展。为了减少病毒传播和危害，需要对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行检疫鉴定，并及时采取措施进行防治。GB/T28071-2011标准规定了黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定的具体方法和步骤，本文将对其进行详细介绍。

检疫样品的采集

GB/T28071-2011标准规定，采集病毒检疫样品应在植株发病期采集，一般采用带有叶片、茎、花、果实等多种组织的植物部位作为样品。采样时应选取典型症状表现的植株，每个样品至少应包括5个植株。

样品处理

采集样品后，需要将样品进行粉碎、磨汁、离心等处理，得到澄清液或悬浮液后，再进行鉴定。其中，样品的粉碎和磨汁操作需要在低温条件下进行，以避免病毒被破坏。

鉴定方法

GB/T28071-2011标准规定了包括ELISA法、PCR法、RT-PCR法等多种方法，可以根据实际情况选择适合的鉴定方法。其中，ELISA法是常用的鉴定方法之一，主要通过对样品中的病毒抗原进行检测来判断是否感染黄瓜绿斑驳花叶病毒。PCR法和RT-PCR法则是通过扩增样品中的病毒RNA或DNA来检测是否感染病毒。这些方法都具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。

结语

GB/T28071-2011标准规定了多种鉴定方法，可以根据实际情况选择适合的方法进行检测。在日常生产中，应加强对黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测和防治工作，以保障农业生产和经济发展的稳定性。