工业微生物菌株质量评价拉曼光谱法

工业微生物菌株质量评价拉曼光谱法

国家标准 GB/T38569一2020 工业微生物菌株质量评价拉曼光谱法 Performanceevaluationofindustrialmiero0rganismstrain- Ramanspectroscopy 2020-03-31发布 2020-03-31实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/38569一2020 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由标准化研究院提出并归口 本标准起草单位:科学院青岛生物能源与过程研究所、标准化研究院 本标准主要起草人:马波、籍月彤、何曰辉、李涧融、徐健、马爱进
GB/T38569一2020 工业微生物菌株质量评价拉曼光谱法 范围 本标准规定了用拉曼光谐法评价工业微生物菌株质量的方法 本标准适用于工业发酵用细菌、真菌、微藻等相对于参考菌株的质量一致性评价 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 工业微生物菌株质量评价performaneeevaluationofindustrialmieroorganismstrainm 利用拉曼光谱法开展工业微生物菌株质量一致性评价 3.2 参考菌株referenee strain 发酵性能明确,用于发酵生产的经过鉴定的保存菌株 原理 细胞内部化合物拉曼光谐的叠加信息可以反映该细胞的综合表型,通过比较待评价菌株与参考菌 株单细胞拉曼光谱的相似性,可以判断待评价菌株是否具有与参考菌株可比较的发酵性能 试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂,水为GB/T6682规定的二级水 5.1无菌培养基 按照菌种类型配制,或选用相应商品化培养基 5.2载玻片 氟化钙载玻片(25mm×75mm). 仪器设备 试验中所使用的仪器设备为
GB/T38569一2020 显微拉曼光谱仪光谱分辨率不低于5cm',拉曼位移波数范围至少包含400cm- a 1850em-" b)培养箱; e 摇床; d)离心机 测定步骤 7.1菌株活化 根据生产工艺配制工业微生物相应的固体平板和液体培养基,用无菌接种环分别蘸取参考菌株和 待评价菌株的保种菌液,在固体平板上划线根据生产工艺参数选择相应的温度等条件进行培养,直至 长出单菌落;分别挑取3个参考菌株和3个待评价菌株单菌落,接种至含有5mL液体培养基的试管 中,根据生产工艺参数选择相应的温度和转速,培养至对数期 7.2菌株培养 用微量移液器分别移取活化后的参考菌株和待评价菌株各200AL.分别接种至3个含有20mL液 体培养基的容器中,根据生产工艺参数选择相应的温度和转迷,培养至稳定期 7.3样品前处理 7.3.1分别移取培养后的参考菌株和待评价菌株各1mL至无菌管中 7.3.2选择相应的转速离心,弃掉上清,加人1mL无菌双蒸水,混匀菌体 7.3.3按照7.3.2重复2次,移取10L.菌液,至无菌管中,加人990L无菌双蒸水,混匀,移取2AL稀 释后的菌液,在洁净的氟化钙载玻片上点样,无菌环境下室温风干 7.4测量 7.4.1将风干后的氟化钙载玻片置于显微拉曼光谱仪载物台上,在透射式明场模式下选择单个细胞 切换至光谱采集模式测定拉曼光谱信号 7.4.2每个样本随机选取至少20个单细胞作为样品信号 7.4.3在点样区内,采集3个无细胞处信号,并计算平均值,作为背景信号 7.5数据处理 7.5.1对单细胞拉曼光谱原始数据进行背景信号扣除(样品信号减去背景信号、基线校正(>5阶函 数)和基于面积的归一化处理 7.5.2计算信噪比,其中信号采用1001cm-'处的尖锐拉曼峰对应的信号强度,舍弃信噪比小于3的 数据,补充数据个数,使得待评价菌株组和参考菌株组具有相同的数据个数 8 结果计算和分析 8.1结果计算 8.1.1余弦距离按式(1)计算
GB/38569一2020 ai×b) cos0(a，b 式中: 单细胞a与单细胞的拉曼光谱向量的夹角; cos(a，b) -单细胞a与单细胞b的拉曼光谱余弦距离; -单细胞a拉曼位移i对应的强度; 单细胞b拉曼位移i对应的强度 计算余弦距离的平均值和标准偏差,并以细胞数为横坐标,以变异系数为纵坐标作图,若曲线达到 平台,说明细胞数已足够,若曲线未达到平台,则增加单细胞拉曼光谱采集个数,直至饱和为止 8.1.2相似度按式(2)计算 B R n(n一I] 式中 R 待评价菌株和参考菌株的相似度; -待评价菌株每个细胞与参考菌株每个细胞的拉曼光谱余弦距离的平均值; rn 待评价菌株组内每个细胞之间拉曼光谱余弦距离的平均值 rw -待评价菌株组内单细胞个数 计算结果以平行测定值的算术平均值表示,保留三位有效数字 8.2结果分析 R值越小说明待评价菌株与参考菌株越相似,在重复性条件下获得的3次独立实验R值均小于 0,05时，判定待评价菌株与参考菌株发酵性能一致

工业微生物菌株质量评价拉曼光谱法GB/T38569-2020

工业微生物菌株的质量评价是保证产品质量和增强市场竞争力的重要手段之一。传统的微生物菌株质量评价方法主要包括形态学观察、基因序列分析等。然而，这些方法需要较长的分析时间且容易受到外界环境干扰，无法满足快速、准确、无损伤的评价需求。

GB/T38569-2020作为新版的国家标准，提出了一种新型的微生物菌株质量评价方法——拉曼光谱法。该方法利用激光与样品相互作用时的特定散射光谱，对微生物菌株代谢产物、成分和结构进行表征。与传统方法相比，拉曼光谱法具有非接触式、无损伤、快速、高效等优势。

采用拉曼光谱法进行微生物菌株质量评价，需要先将样品制备成薄片或溶液后进行测试。在实验过程中，应注意控制激光功率和照射时间，防止样品受到过度激发而影响测试结果。此外，由于不同微生物菌株代谢产物和成分的拉曼光谱图谱存在差异，因此需要建立与微生物菌株特征相关联的光谱库，以便更准确地识别和鉴定微生物菌株。

总之，拉曼光谱法作为新型的微生物菌株质量评价方法，其高效、准确、无损伤的特点已经得到了广泛认可，并在工业微生物学领域中得到了广泛应用。未来，随着该技术的不断完善和推广，将有望成为工业微生物学领域中不可或缺的研究手段。

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