饲料中恩拉霉素的测定微生物学法

饲料中恩拉霉素的测定微生物学法

国家标准 GB/T21542一2008 饲料中恩拉霉素的测定微生物学法 Determinationoferamycininteds一Mcrobiologicealmethod 2008-04-09发布 2008-07-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T21542一2008 前 言 本标准的附录A为规范性附录 本标准由农业部提出 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口 本标准起草单位:上海市兽药饲料监察所 本标准主要起草人:顾欣、蔡金华、刘雅妮、沈富林、王蓓、黄士新、金凌艳
GB/T21542一2008 饲料中恩拉霉素的测定微生物学法 范围 本标准规定了饲料中恩拉霉素的微生物学测定方法 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、预混合饲料中恩拉霉素的含量测定 本方法测定饲料中恩拉霉素的定量限为0.5mg/kg(500U/kg) 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682一1992 分析实验室用水规格和试验方法(neqIsO3696;1987 GB/T20195动物饲料 试样的制备aso6498198.,Dr 兽药典(2005年版一部 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 恩拉霉素效价单位poteneyunitfemramycim 微生物学法测定的恩拉霉素生物活性单位用U表示 1mg恩拉霉素相当于1000U 原理 用酸性甲醇溶液提取试样中的恩拉霉素,然后提取液用大孔吸附树脂对恩拉霉素吸附、洗脱,除去 饲料中的干扰物质 利用标准溶液中恩拉霉素浓度的对数与其对敏感微生物生长抑制而产生的抑菌圈 的直径成正比关系的原理制作标准曲线,根据试样液中恩拉霉素产生抑菌圈的大小来测定饲料中恩拉 霉素的含量 试剂和材料 除另有规定外，在分析中使用的试剂均为分析纯，水为蒸僧水或去离子水，应符 合GB/T66821992规定的三级用水要求 甲醇溶液 甲醇-水(1十1). 5.2盐酸溶液 取盐酸9mL,加水至1000mL混匀 5.3氢氧化钠溶液 取澄清的氢氧化钠饱和溶液112mL,加水至1000ml.,混匀 洗涤液 甲醇溶液(5.1),用氢氧化钠溶液(5.3)调节pH值至8.
GB/T21542一2008 5.5提取液 甲醇溶液(5.1),用盐酸溶液(5.2)调节pH值至3. 5.6洗脱液 甲醇-水(7十3),用盐酸溶液(5.2)调节pH值至3 5.7灭菌水 按附录A的规定制备 5.8磷酸盐缓冲液(plH6.0 按附录A的规定制备 5.9大孔吸附树脂 多孔苯乙烯-二乙烯苯聚合物树脂(AmberliteXAD2,粒度;20目60目,平均孔径;9nm,比表面 积300m'/g,孔容积:0.65ml/g,骨架密度;l.08g/ml,25C) 可使用参数相同的同类产品 将准备使用的大孔吸附树脂浸人足量的甲醉中(液面高出树脂层2cm一cm),轻轻地搅拌,使充 分混合,放置15nmin,小心地尽量倾去上层甲醇液,加人足量的水,搅拌混合,放置10min,备用 5.10大孔吸附树脂层析柱 将预处理过的大孔吸附树脂(G.9)湿法装人层析柱中(高20 cm,内径10mm),使柱床高度为 5cm,使用25ml.洗涤液(6.4)以0.4ml/min流速过柱,平衡后待用 恩拉霉素标准溶液 5.11 恩拉霉素标准贮备溶液 称取恩拉霉素标准品(效价单位不小于900U/mg)适量.精确至0.lmg,用甲醉溶液(5.1)溶解并 稀释成含恩拉霉素1000U/ml.的溶液,在0C一4C可保存7d 5.11.2恩拉霉素标准工作溶液 精确量取恩拉霉素标准贮备溶液(5.11.1),用pH6.0磷酸盐缓冲液(5.8)稀释成0.4U/ml 0.8U/ml,1.6U/mL、3.2U/mL,6.4U/mL浓度的标准工作溶液 以1.6U/mL为中心浓度标准 工作溶液 5.12培养基I 按附录A的规定制备 5.13培养基I 按附录A的规定制备 5.14试验菌种 枯草芽抱杆菌(Baciussubtilis)[CMCc(B)63501或CVcc717] 5.15菌悬液 取枯草芽抱杆菌(5.14)的新鲜培养物接种于培养基I(5.12)内,在35C37C培养7d,用灭菌 水将芽袍洗下,在65C水浴加热30min后,于3000r/min离心30nmin,弃去上层液,加人足量的灭菌 水使沉淀物重悬浮,离心,重复洗涤三次,弃去洗液,最后加人适量的灭菌水制成菌悬液,此菌悬液在 0C一4C可保存6个月 5.16双碟的制备 取培养基I(5.13)加热融化,冷却至60C,加人适量的菌悬液(以1.6U/mL中心浓度标准工作溶 液产生的抑菌圈直径不小于16mm为宜),摇匀 每个双碟加人10m含菌培养基,均匀摊布,放置于 水平操作台上冷却,待培养基凝固后,在每个双碟内半径为2.8cm的圆周上等距离放置6个已灭菌的 不锈钢小管 仪器与设备 6.1分析天平:感量0.000lg
GB/T21542一2008 6.2天平;感量0.01g 6.3振荡器;往复式 4 66 离心机. 6.5旋转真空蒸发器 6.6电热恒温水浴锅;温度被动士1c 6.7平底双碟;直径为90, mm17mm， 高16 ,符合《兽药典》2005年版一部的 mm 要求 6.8陶瓦盖 nmm士0.1 6.9不锈钢小管;高10.0mm士0.1mm,外径8.0" mm,内径6.0mm士0.1mm ,符合《中华 人民共和国兽药典》2005年版一部的要求 6 10恒温培养箱;温度波动士1C 6.11高压灭菌锅 6.12可调式微量移液器:200Al1000AL 游标卡尺(精度0.02mm)或抑菌圈测定仪 试样的制备 按GB/T20195制备试样,经粉碎后全部通过1mm孔筛,混匀,装人密闭容器中备用 含量测定 8.1标准曲线的制备 取制备好的双碟(5.16)平均分为5组,标准工作溶液(5.11.2)每一个浓度为一组,每组不少于3个 碟子 每个双碟的6个不锈钢小管中,间位的3个使用可调式微量移液器滴加200L中心浓度标准工 作溶液(5.l1.2),另外3个滴加200l该组浓度标准工作溶液,将双碟小心移至恒温培养箱中,盖上陶 瓦盖,于36C37C培养16hl8h. 测量各组中心浓度标准工作溶液和该组标准工作溶液的抑菌圈直径,分别计算平均值,再计算所有 双碟中心浓度标准工作溶液抑菌圈直径的总平均值,作为修正值 各浓度组的抑菌圈直径按式(1)修正 A，=B一B十A 式中: 该浓度标准工作溶液被修正后的抑菌圈直径; A B 修正值; B 该浓度组中心浓度标准工作溶液所至抑菌圈直径读数平均值; -该浓度标准工作溶液抑菌圈直径读数平均值 以各组溶液浓度的对数与该组溶液被修正后的抑菌圈直径作线性回归,求出回归方程 相关系数r应不小于0.99 8.2试样溶液的制备 8.2.1准确称取10g的试样,精确至0.01g,置于250mL具塞锥形瓶内，加人50.0mL提取液 (5.5),摇匀,调节pH至3,使用往复式振荡器振荡30min 转移至100tmL离心管中,3000r/min离 心10min,取上清液过滤,将滤液用氢氧化钠溶液(5.3)调节pH至8， 量取20.0mL滤液.,以0.6mL/min的流速经过大孔吸附树脂层析柱(5.10),再用12ml洗涤 8.2.2 液(5.4)以0.4mL/min 的流速过柱,洗涤去除杂质 然后用40mL洗脱液(5.6)以0.2mL/min 的流
GB/T21542一2008 速过柱,收集洗脱液 8.2.3将洗脱液用旋转真空蒸发器于45C燕干,加人适量的甲醇溶液(5.1)于燕发瓶中,溶解残渣,定 容(使溶液中的恩拉霉素浓度在0.4U/ml6.4U/ml之间)制成试样溶液 8.3测定 取与标准曲线同时制备的至少3个双碟(5.16),按标准曲线的制备方法(8.1)分别滴加试样溶液 8.2)和中心浓度标准工作溶液,与标准曲线同时操作和培养 判定与结果计算 9.1判定 试样溶液不产生抑菌圈,判定饲料中恩拉霉素为阴性 试样溶液产生抑菌圈,判定饲料中恩拉霉素为阳性并计算含量 结果计算 9. .2 用回归方程求出中心浓度标准工作溶液对应的抑菌圈直径作为修正值,按式(1)校正试样溶液抑菌 圈直径数的平均值,再用回归方程求出试样溶液中恩拉霉素的实测浓度(e) 饲料中恩拉霉素的含量X.以效价单位每千克(U/kg)表示,按式(2)计算 -Yx1000 x 2 n又m 式中: 试样溶液中恩拉霉素的实测浓度,单位为效价单位每毫升(U/mL) -提取液的体积数.单位为毫升(ml) 提取液过柱后的浓缩倍数; 试样的质量,单位为克(g). m7 测定结果用平行测定的算术平均值表示,保留至三位有效数字 10 重复性 由同一操作者对同一试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差不大于15%
GB/T21542一2008 录 附 规范性附录) 培养基及溶液的配制 A.1培养基I A.1.1成分 0.0g 蛋白陈 5.0" 牛肉浸出粉 2， 氯化钠 5g 15 琼脂 g 1000mL 水 A.1.2制法 除琼脂外,混合上述成分,调节pH值比最终pH值略高0.20.4,加人琼脂,加热溶化后过滤,调 节pH值使灭菌后为6.5士0.1,分装于试管中,于121C灭菌15min 制成斜面备用 A.2培养基I A.2.1成分 5.0 蛋白陈 g 5.0 牛肉浸出粉 80 氯化钠纳 g 磷酸氢二钠 2.0g 琼脂 15g 1000mlL 水 A.2.2制法 除琼脂外,混合上述成分,调节pH值比最终pH值略高0.2~0.4,加人琼脂,加热溶化后过滤,调 节pH值使灭菌后为8.0士0.1,分装于锥形瓶中,于121C灭菌15min A.3磷酸盐缓冲液(p6.0) A.3.1成分 磷酸氢二钾 2.0g 磷酸二氢娜 8.0g 水 1000ml A.3.2制法 将上述各成分于水中溶解,分装于锥形瓶中,于121C灭菌15min A.4灭菌水 将水分装于锥形瓶中,于121C灭菌15min