GB/T18936-2020
高致病性禽流感诊断技术
Diagnostictechniquesforhighlypathogenicavianinfluenza
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2020-12-14
- 文件格式PDF
- 文本页数18页
- 文件大小1.30M
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高致病性禽流感诊断技术
国家标准 GB/T18936一2020 代替GB/T189362003 高致病性禽流感诊断技术 Diagwstieteehmiquesforhighlypathvgenicavianinfuenz 2020-12-14发布 2020-12-14实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/T18936一2020 次 目 前言 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义 临床诊断 样品采集,保存与运输 病毒分离与鉴定 血凝和血凝抑制试验 禽流感病毒RT-PCR试验 禽流感病毒实时荧光RT-PCR试验 10综合判定 附录A规范性附录)试验所用溶液和1%鸡红细胞的配制 附录B(资料性附录)高致病性禽流感病毒IVPI测定试验 附录c(资料性附录)血清非特异性凝集和非特异性抑制因子的处理方法 附录D(资料性附录)禽流感病毒RT-PCR试验用引物 附录E(资料性附录RT-PCR反应液配制 13 附录F资料性附录)实时荧光RT-PCR引物探针序列及反应液配方 14
GB/T18936一2020 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准代替GB/T189362003《高致病性禽流感诊断技术》,与GB/T18936一2003相比,主要技 术变化如下 -增加了禽流感病毒RT-PCR试验(见第8章); -增加了禽流感病毒实时荧光RT-PCR试验(见第9章) -删除了琼脂凝胶免疫扩散(AG;ID)试验(见2003年版的第4章) 删除了间接酶联免疫吸附试验(ELISA)(见2003年版的第5章)
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本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任
本标准由农业农村部提出
本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口
本标准起草单位;农业科学院哈尔滨兽医研究所、北京海关、动物卫生与 流行病学中心 本标准主要起草人;王秀荣、田国彬、刘环、邓国华、蒋文明、施建忠、曾显营、李雁冰、谷强、孙晓东、 陈化兰 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 GB/T189362003
GB/T18936一2020 高致病性禽流感诊断技术 范围 本标准规定了高致病性禽流感临床诊断,样品采集、保存与运输,病毒分离与鉴定,血凝和血凝抑制 试验,禽流感病毒RT-PCR试验和禽流感病毒实时荧光RT-PCR试验的技术要求 本标准适用于高致病性禽流感的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查等
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T765高致病性禽流感样品采集,保存及运输技术规范 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 高致病性禽流感hiehtypathne vgenieavianinflenza;HPAI 由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的以禽类为主的急性传染病
3.2 血凝hemagglu utinin;HA 流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白,具有识别红细胞表面受体并使红细胞凝集的特性
3.3 血凝抑制hemagglutnininhibition;H 抗体特异性地附着在HA分子的抗原位点上,干扰流感病毒HA与红细胞受体之间的结合,抑制 了流感病毒HA凝集红细胞的能力
3,4 nerasechainreaction;RT-PCR 反转录聚合酶链式反应 reverSetranm meriptium-pusn -种用于放大扩增特定的RNA片段的分子生物学技术
先用RNA反转录为cDNA然后以 DNA为模板进行PCR扩增的过程
3.5 实时荧光RT-PCRreal-timeRI-PCR 利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程的一种扩增核酸方法
3.6 Ct值eyclethreshold 每个反应管内的荧光信号量达到设定的囤值所经历的循环次数
GB/T18936一2020 临床诊断 4.1易感动物 鸡,火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉鸡、鹧鸪、鸵鸟、孔雀等多种禽类易感,多种野鸟也可感染发病
临床症状 4.2 4.2.1精神沉郁,嗜睡,头翅下垂,呆立;食欲不振;呼吸困难,有呼吸道症状
4.2.2鸡冠发绀,发紫;眼结膜发红;排黄、白、绿色稀便,并有未完全消化的饲料;脚鳞或有出血
4.2.3产蛋下降,软壳蛋,畸形蛋增多;有歪脖子等神经症状
4.2.4鸭、鹅等水禽可见神经和腹泻症状;有时可见角膜发红,充血、有分泌物,甚至失明
4.3剖检变化 4.3.1气管弥漫性充血、出血,有少量黏液;肺部有炎性症状
4.3.2腹腔有浑浊的炎性分泌物;肠道可见卡他性炎症;输卵管内有浑浊的炎性分泌物,卵泡充血、出 血、萎缩、破裂,有的可见“卵黄性腹膜炎”;胰腺边缘有出血,坏死
4.3.3心冠及腹部脂肪出血;腺胃乳头可见出血;盲肠扁桃体肿大出血;直肠黏膜及泄殖腔出血 4.4结果判定 出现4.2、4.3中的情况,初步判为高致病性禽流感临床疑似病例,需要进一步开展实验室诊断
样品采集、保存与运输 5 5.1总则 样品采集、保存及运输应按照NY/T765进行
样品采集宜在发病初期、选择具有典型临床症状的 禽进行,采样过程中应避免交叉污染
死禽或其他动物采集气管、肺和脑等组织样品,进行分别处理;活 禽样品应包括咽喉和/或泄殖腔拭子;小珍禽用拭子取样易造成损伤,可采集新鲜粪便
5.2拭子样品 5.2.1采集咽喉拭子时将拭子深人喉头及上颚裂来回刮2次3次并旋转,取分泌液
5.2.2采集泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔至少旋转3圈并沾取少量粪便
5.2.3将采样后的拭子分别放人盛有1.2mL样品稀释液(配制方法见附录A中的A.1)的2mL采样 管中,编号并填写相应采样单
5.3组织样品 发病禽鸟可无菌采集气管、肺脑、肠包括内容物、肝、脾、肾、心等组织脏器,装人15ml
或 50m带螺口的有机材料保存管中,编号并填写相应采样单
5.4血清样品采集 无菌采集禽类的血液,每只约2mL.,编号并填写相应采样单
待血液凝固,血清析出后收集血清 用于H检测
GB/T18936一2020 5.5样品保存和运输 样品采集后置保温箱中,加人预冷的冰袋,密封,宜24h内送实验室
样品应尽快处理,没有条件 的可在4C存放不超过4d,也可在低温条件下保存(一70C贮存为宜)
病毒分离与鉴定 6.1适用范围 病毒分离与鉴定方法适用于对HPAI的病原学诊断,应在有资质的高等级生物安全实验室操作， 按照GB19489的规定执行
6.2样品处理 将棉拭子充分捻动,挤干后弃去拭子;粪便、研碎的组织加样品稀释液充分研磨,按照1g组织加 0mLPBs的比例配成悬液
样品液经3000!/min离心10min.取上清作为接种或者核酸检测材料 6.3样品接种及收获 取处理好的样品,以0.2mL/胚的量经尿囊腔途径接种9d~11d无特定病原体鸡胚,每个样品接 种3一5枚鸡胚,在37C孵化箱内孵育,每天上午和下午定点观察鸡胚死亡情况
无菌收取死胚及96h 仍存活鸡胚的鸡胚尿囊液,测HA活性
6.4病毒鉴定 若无HA活性,则收取尿囊液进行盲传,至少盲传1代,若仍阴性,则认为病毒分离阴性;若有HA 活性说明可能有正黏病毒科的流感病毒,可进一步采用血凝和血凝抑制试验(见第7章)、高致病性禽流 感病毒IVPI静脉内接种致病指数)测定试验(参见附录B)、禽流感病毒RT-PCR试验(见第8章)、禽 流感病毒实时荧光RT-PCR试验(见第9章)等方法进行验证
血凝和血凝抑制试验 7.1适用范围 血凝和血凝抑制试验适用于血凝素亚型的诊断和抗体效价测定
7.2试剂 7.2.1阿氏(Alsevers)液,配方参见A.2
7.2.21%鸡红细胞悬液,配方参见A.3
7.2.3pH7.2,0,o1mol/儿LPBS,配方参见A.4
7.2.4禽流感病毒血凝素分型标准抗原、标准阳性血清、阴性血清
7.3HA试验(微量法)试验步骤 7.3.1在96孔V型微量反应板中,每孔加0.025mlPBS 7.3.2第1孔加0.025ml.抗原或病毒液,反复吹吸3次5次混匀
7.3.3从第1孔吸取0,.025ml抗原或病毒液加人第2孔,混匀后吸取0.025ml加人第3孔,进行2俏 系列稀释至第11孔,从第11孔吸取0.025mL弃去
第12孔为PBS对照孔
GB/T18936一2020 7.3.4每孔加0.025mLPBS. 7.3.5每孔加人0.025mL1%体积分数)鸡红细胞悬液
.3.6结果判定
轻扣反应板混合反应物,室温(约20C)静置40nmm,.环境温度过高时可在4C条件 下静置601 ,当对照孔的红细胞呈显著纽扣状时判定结果
判定时,将反应板倾斜60',观察红细胞 min， 有无泪珠状流淌,完全无泪珠样流淌(100%凝集)的最高稀释倍数判为血凝效价
7.4H试验(微量法)试验步骤 7.4.1根据HA试验测定的效价配制4个血凝单位即4HAU)的病毒抗原
4HAU抗原应根据检验 结果调整准确
示例;如果血凝的终点滴度为1:256(2”或8log2),则4HAU=256/4=64即1:64);取PBS6.3ml.,加抗原 .,即通过1:6稀释获得4HAU
配制的4HAU抗原需检查血凝价是否准确,将配制的4HAU抗原进行系列 0,1ml 稀释,使最终稀释度为1;2、1;3、1;4、1;5、1;6和1;7
从每一稀释度中取0,025ml,加人PEBS0.025ml,再加人 1%鸡红细胞慧液002;ml.说匀
将血概板在室蕉(《约20t)条件下静置0mim或4七60min,如果配制的抗原液为 4HAU,则1:4稀释度将出现凝集终点;如果高于4HAU,可能1:5或1:6为终点;如果低于4HAU,可能1:2或 113为终点 7.4.2第1孔第11孔加人0.025mlLPBS,第12孔加人0.05ml.PBS作为空白对照
7.4.3第1孔加人0.025ml血清(鸭、鹅血清在检测时建议进行预处理,参见附录C);第1孔血清与 PBS充分混匀后吸取0.025ml于第2孔,依次2倍稀释至第10孔,从第10孔吸取0.025ml弃去
第 11孔作为抗原对照
7.4.4第1孔~第11孔均加人0.025mL4HAU抗原,在室温(约20C)下静置30 或4 min 60min
7.4.5每孔加人0.025mL1%体积分数)鸡红细胞悬液,震荡混匀,在室温(约20C)下静置40min或 4C60min， 1,空白对照孔(12孔)红细胞呈显著纽扣状时判定结果 7.4.6结果判定
当抗原对照孔(第11孔)完全凝集，且阴性对照血清抗体效价不高于1;4(2”或 2log2),阳性对照血清抗体效价与已知效价误差不超过1个滴度时,试验方可成立
以完全抑制 4HAU抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的Hl抗体效价
用于检测抗体,检测鸡血清时,H抗体 效价不高于1:8(2或3log2)判为阴性,不低于1:16(2'或4log2)判为阳性
用于检测抗原,能够被 某亚型禽流感标准血清抗体抑制,HH效价不低于1:l6(2'或4log2)时判定为该亚型阳性;H抗体效 价不高于1:8(2”或3log2)判为阴性
对于疑似H5亚型等抗原性可能存在较大差别的病毒,应结合 其他病毒检测方法进行鉴定
8 禽流感病毒RT-PCR试验 8.1适用范围 适用于检测禽组织分泌物、排泄物、鸡胚培养物等物质中禽流感病毒核酸 8.2仪器设备 8.2.1PCR扩增仪及配套反应管
8.2.2高速台式冷冻离心机(离心速度不低于12000r/min)
8.2.3级生物安全柜 8.2.4微量移液器(5AlL、10AL、,100L、1000"L)及配套吸头与1.5ml离心管
8.2.5电泳仪 8.2.6电泳槽
GB/T18936一2020 8.2.7紫外凝胶成像仪
8.3试剂 8.3.1推荐的禽流感病毒RT-PCR引物序列,参见附录D. 8.3.2RT-PCR反应液,配方参见附录E的E1
8.3.3无核酸酶水,配方参见E.2
8.3.4无水乙醉
8.3.5阴性对照为SPF鸡胚尿囊液
8.3.6阳性对照为灭活的相应亚型禽流感病毒胚培养物
8.4RNA提取 可选市售商品化RNA提取试剂盒,按说明书进行
8.5RT-PCR操作 取2.5L(约250ng)提取的RNA加人RT-PCR反应液中,置于PCR仪中,循环参数为:45C逆 转录45min;94C预变性2min;94C30s,52C45s,68C45s,35个循环;最后68C延伸8min. 8.6电泳 PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分析
8.7结果判定 在阳性对照出现相应扩增带、阴性对照无此扩增带时判定结果
出现预期大小的扩增片段时,判定 为核酸检测阳性,否则判定为阴性
禽流感病毒实时荧光RT-CR试验 g.1适用范围 实时荧光RT-PCR适用于检测禽组织、分泌物、排泄物、鸡胚尿囊液等物质中禽流感病毒核酸
g.2仪器设备 9.2.1荧光PCR仪
9.2.2其余器材同8.2.2~8.2.4
9.3试剂及引物探针序列 推荐的实时荧光RT-PCR引物探针序列参见附录F的F.1
9.4样本核酸的提取 可选市售商品化RNA提取试剂盒,按说明书进行
g.5实时荧光RT-CR操作 g.5.1实时荧光RT-CR扩增试剂的准备与配制 宜在专门的反应混合物配制区配制实时荧光RT-PCR扩增试剂
根据需要检测的样品数,按推荐
GB/T18936一2020 的实时荧光RT-PCR反应液配方(参见F.2)配制反应液,充分混匀后分装,每个反应管15L
转移反 应管至样本制备区
g.5.2加样 宜在专门的样本制备区进行
在9.5.1配好的反应管中分别加人9,4中制备的RNA溶液5L(约 500ng),使每管总体积达到20AL,记录反应管对应的样品编号
盖紧管盖后,500r/ 离心30s
min 9.5.3实时荧光RT-PCR反应设定 宜在专门的检测区进行实时荧光RT-PCR反应
将9.5.2中加样后的反应管放人实时荧光RT PCR检测仪内,编辑样品表后,选定与探针标记荧光基团相符合的检测通道读取荧光信号值,淬灭基团 选择" 推荐的实时荧光RT-PCR反应参数设定参见F.3
nOne
9.6结果判定 g.6.1结果分析条件设定 综合分析仪器读取的各项数据及扩增曲线,设定合理的阔值(threshold)和基线(baseline),使仪器 显示正确的结果
9.6.2质控标准 阴性对照检测通道读取数据无C值或C值>35并且无特征性扩增曲线， 9.6.2.1 g.6.2.2阳性对照检测通道读取数据出现特征性扩增曲线,且Ct值应<30
g.6.2.3如阴性和阳性对照不满足以上条件,此次试验视为无效
9.6.3结果描述及判定 9.6.3.1若测定样品Ct值<30,判为所用引物探针禽流感病毒特定型或亚型核酸阳性
9.6.3.2若测定样品30
GB/T18936一2020 录 附 A 规范性附录 试验所用溶液和1%鸡红细胞的配制 A.1样品稀释液 样品稀释液的配制方法如下 A液:0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液
NaH,POH.27.6g,溶于蒸馏水中,最后定容至 a 1000mL
b B液;0.2mol/儿磷酸氢二钠水溶液
NaHPO7H.,O53.6g,或NaHPO12H.O71.6g" 或Na,HPO2H,035.6g,加蒸憎水溶解,最后定容至1000mL
0.01mol/LpHH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)(含抗生素和稳定剂)的配制
取A液14mL,B液 36 mL,加NaCI8.5g,用蒸憎水定容至1000 mL
经121C士2C、15min高压灭菌,冷却 后,无菌条件下分别加人青霉素2000U/mL、链霉素(2mg/mL)庆大霉素(504g/mL)霉菌 nL 抑制素(1000U/mL)和牛血清白蛋白(5mg/m 上述抗生素浓度宜用于组织和咽喉拭子,如果用作粪便和泄殖腔拭子的缓冲液,抗生素浓度可提高 5倍
A.2阿氏(Alsevers)液配制 称取葡萄糖2.05g柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g,氯化钠0.420g,加蒸僧水至100ml,散热溶解 后调pH值至6.1,69kPa15min高压灭菌,4C保存备用
A.31"%鸡红细胞悬液 采集至少三只SPF鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合,用pH 7.2的0.01mol/PBS洗涤3次,每次均以1000r/min离心10 1,洗涤后用PBS配成1%体积分 min 数)红细胞悬液,4C保存备用
A.4pH7.2,0.01mo/L，PBS的配制 pHH7.2,0.01mol/LPBs的配制方法如下 配制25×PB;称量2.74g磷酸氢二钠和0.79g磷酸二氢钠加蒸水至100mL
a 配制1xPs;量取40mL.25XPB.加人8.5【氧化钠,加燕僧水至1000mL b 用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2
c 灭菌或过滤
d PBs一经使用,于4C保存不超过3周
e
GB/T18936一2020 附录 B 资料性附录 高致病性禽流感病毒IVPI测定试验 试验鸡 B.1 6周龄sPF鸡,10只
B.2接种材料 感染鸡胚的尿囊液,血凝价在1:16(2'或4log2)以上,未混有任何细菌、霉菌、支原体或其他 病毒
B.3接种方法 将感染鸡胚尿囊液用PBs1:10稀释,以0.1m/羽的剂量翅静脉接种
每日观察每只鸡的发病 及死亡情况,连续观察10d
B.4记录方法 根据每只鸡的症状用数字方法每天进行记录:正常鸡记为0,病鸡记为1,重病鸡记为2,死鸡记 为3
病鸡和重病鸡的判断主要依据临床症状表现，一般而言,“病鸡"表现有下述一种症状,而“重病 鸡”则表现下述多个症状,如呼吸症状、沉郁腹泻、鸡冠和/或肉髯发绀、脸和/或头部肿胀、神经症状
列举1个假设试验来说明VPI的计算方法,参见表B.1和公式(B.1)
表B.1假设高致病性禽流感病毒致病性试验记录结果 临床症状 第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天第8天第9天第10天分类总计得分 10 正常(a=0 24 病鸡(b=l 重病鸡(e 10 20 死亡(d=3) 10 1o 66 198 10 总计 100 218 注1:当IVP值大于1.2时,判定分离株为高致病性禽流感病毒(HPAI)
注2:本试验中VPI=(0十0十20+198)/100=2.18>1.2,因此,本试验中的分离株为HPAIV
B.5IVP值计算 VPI值计算参见公式(B.1).
GB/T18936一2020 工
×0十×1十>.×2十>×3 IVPI= (B.1 式中
0d累计正常鸡数 s 0d累计病鸡数; 10d累计重病鸡数; 10d累计死鸡数; . T 0d累计记录10只鸡的总次数,即100. B.6判定标准 B.6.1 当IVPI值大于1.2时,判定此分离株为高致病性禽流感(HPAD)病毒株
B.6.2当IVP1值小于1.2时,H5和H7亚型的禽流感病毒应进行血凝素裂解位点的序列分析,如果氨 基酸序列同其他高致病性流感病毒相似,被检测的分离物应被视为高致病性禽流感病毒
GB/T18936一2020 附 录 C 资料性附录) 血清非特异性凝集和非特异性抑制因子的处理方法 C.1非特异性凝集因子的处理 有些禽类血清(如水禽、鸽)可能对鸡红细胞产生非特异性凝集,可先用待检血清做HA试验,如果 待检血清出现红细胞凝集现象,则说明有非特异凝集因子存在,宜用鸡红细胞对待检血清进行吸附,具 体方法为;每0.5m血清中加人0.025ml50%鸡红细胞,轻摇后静置至少30nmin,800g离心2min一 5min,收集上清液(处理后的血清)
用上清液进行HI试验时,需设处理阳性血清对照
或者可用与 待检血清宿主来源相同的1%红细胞悬液进行HA和H试验
非特异性抑制因子的处理 胰酶一加热一高碘酸盐法 C.2.1 利用胰酶一加热一高碘酸盐法处理非特异性抑制因子的操作如下: 取0.3mL血清,加0.15mL胰酶溶液(8mg/mL:200mg的P-250胰酶溶解于25mL的 a) 7.2的PBS中,混匀,过滤除菌,分装并在一15以下保存,保存期 .0malL.,pH值了0" 6个月),混匀后,在56C水浴灭活30min后冷却至室温
再加人0.9mL高碘酸钾(将230mgK1o用0.01mol/L,pH值7.0一7.2的PBs定容至 b 00ml,过滤除菌后避光室温保存,保存期1周),混合,室温孵育15" mn
再加人0.9mL的丙三醇盐溶液(1mL丙三醇加人99mL的0.01mol/L、pH值7.0~7.2的 PBS中,混匀,过滤除菌,室温保存),混合,室温孵育15min. d 最后加人0.75mL生理盐水,混匀,置4笔保存备用
处理后的血清最终为10倍稀释的血清
C.2.2受体破坏酶(RDE)处理法 利用RDE处理法处理非特异性抑制因子的操作如下 取1体积血清(50L),加4体积RDE(200L),37C水浴18(过夜)
a b) 再加人5体积(250L)的1.5%浓度的柠檬酸钠,混匀,置56C水浴30min(以破坏残余的 RDE活性)
将1体积的50%的红细胞加人到10体积RDE处理的血清中(50AL红细胞十500AL血清. 振荡混匀后4C放置1h,期间可轻轻摇匀悬浮红细胞数次
1000g离心10min,小心吸取上层上清,用于检测
处理后的血清最终为10倍稀释的血清
d c.2.3处理非特异性抑制因子后血清H试验方法 处理后血清H试验方法如下; 第2孔一第11孔加人0.025mL.Ps,第12孔加人0.05mLPBs作为空白对照
a b第1孔、第2孔加人处理后的血清0.025ml,第2孔血清与PHBS充分混匀后吸0.025ml于第 3孔,依次2倍稀释至第10孔,从第10孔吸取0.025mL弃去
第11孔为抗原对照
第1孔第11孔均加人0.025ml
4HAU抗原,在室温(约20C)下静置40min或4C 10
GB/T18936一2020 60 min
d 每孔加人0.025ml.1%体积分数)鸡红细胞悬液,震荡混匀,在室温(约20C)下静置40 min 或460min,对照孔红细胞呈显著纽扣状时判定结果
结果判定
当阴性对照血清抗体效价不高于1:10,阳性对照血清抗体效价与已知效价误差 不超过1个滴度时,试验方可成立
以完全抑制4HAU抗原的最高血清稀释倍数判为该血 清的H抗体效价
被检血清HI抗体效价低于1:10判为阴性,不低于1:10判为阳性
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GB/T18936一2020 附 录 D 资料性附录) 禽流感病毒RI-PCR试验用引物 采用普通RT-PCR方法开展禽流感检测,可根据检测目的基因不同选择引物(参见表D,1)
表D.1禽流感病毒RI-PCR试验可选择的引物 引物序列 长度 引物名称 扩增目的基因 bp M-229U TTCTAACCGAGGTCGAAAc M 229 M-229L AAGCGTCTACGCTGCAGTCC H5-372U \ATATGGTAAcTGcAACAccAN GGA 372 H5 H5-372L AAcTGAGTG;TTCATTTTGTcAATG H7-501U AATGCACARGGAGGAGGAACT 501 H7 H7-50lL TGAYGCCCCGAAGCTAAACCA H9-273u TGTGTcTTAcGATGGGAcAAGcA H9 273 TTGACAAGAGGccTTGGTccCTAT H9-273L N1-358U ATTRAAATACAAYGGYATAATAAC V 358 N1 GTcwccGAAAAcYccAcTGcN -358L N2-377U GTGTGYATAGCATGGTCCAGCTCAAG 377 N2 N2-3771 GAGCCYTTCCARTTGTCTCTGCA N9-203U ATAATGAAACAAACATCACCAA 203 N9 N9-203 AGCATAGAACCTGcATTcCATcT 注:w=(AT);Y=(CT);R=(AG)
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GB/T18936一2020 录 附 E 资料性附录 RI-PCR反应液配制 E.1RT-CR反应体系 每个RT-PCR反应体系包括的组分参见表E.1
表E.1RT-PCR反应液配方 1个检测体系的加人量 组分 nl 5×反应缓冲液 5.0 10mmol/1.dNTP 0.5 15mmol/儿氯化锁 1.0 20pmol上游引物 0.5 20pmol下游引物 0.5 AMV反转录酶(200U/Al) 0,5 0.5 TqDNA聚合孵(5U/l) 无核酶灭菌水 14.0 E.2无核酸酶水 将DEPC加人去离子水中至终浓度为0.1%,充分混合均匀后作用12h,分装,(121士2)c高压灭 菌30min,冷却后冷藏备用
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GB/T18936一2020 附录 F 资料性附录) 实时荧光RT-PCR引物探针序列及反应液配方 F.1引物和探针 采用实时荧光RT-PCR方法开展禽流感检测,可根据检测目的基因参见表F.1提供的序列合成引 物和探针,纯度为HPLC级,用RNase-Free灭菌水溶解并稀释至终浓度10Amol/L,一20C保存备用
表F.1禽流感病毒实时荧光Rr-PCR试验可选择的引物和探针 序列 引物和探针名称 (5'-3' M上游引物 GACCRATCCTGTCACCTCTGAC M下游引物 AGG;GCATTYTGGACAAAKCGTCTA TGCAGTccTcGCTCAcTGGGCAcG M探针 H5上游引物 AGGGAGGATGGCAGGGAATG H5下游引物 TCTTTGTCTGCAGCGTACCCACT H5探针 ATGGTTGGTATGGGrAcCAcCATAGCAATG CTAATTGATGGTTGGTATGGTTTcA H7上游引物 H7下游引物 AATTGCCGATTGAGTGiCTTTT H7探针 CAGAATGCACAGGGAGAGGGAACTGCT N6上游引物 TGcAGGATGTTTGcTcTG.AGTIc N6下游引物 CGAAATGGGCTCC'TATCATGTAT N6探针 ACAACACTCAGAGGGCAACATGCGAAT N8上游引物1 TCCATGYTTTTGGGTTGARATGAT GCTCcATCRTGCCAYGACCA N8下游引物" N8探针1 TCHAGYAGCTcCATTGTRATGTGTGGAGT N9上游引物 CAGAAGGCCTGTTGCAGAAATT N9下游引物 ccGTTGTGGcATACACATTcAG N9探针 CACATGGGcCcGAAACATACTAAGAACACA H9上游引物 (GCTGGAATCTGAAGGAACTTACAAA H9下游引物 AGGCAGCAAACCCCATTG TccTCACcATTTATTCGAcT(GTCGccTc H9探针 14
GB/T18936一2020 表F.1续) 序列 引物和探针名称 5'-3' HPH7上游引物 CAAAGGAGTCTTCTGCTGGCA HPH7下游引物 ;CcTcTcGCAGTccGT TAGG CAGGGATGAAGAATGTTcCTGAGGTTCCAA HPH7探针 注1.M和N8引物探针引自oIE
注2:R=(AG);Y=(CT);K=(GT);H=(ATC) F.2实时荧光RT-CR反应液配方 每个反应体系包括的组分参见表F.2
表F.2实时荧光RT-PCR反应液配方 1个检测体系的加人量 组分 Ml 2×RT缓冲液 10.0 0.5 酶混合液 上游引物(10mol/L 0.8 下游引物(10mol/L 0.8 探针(10mol/L) 0,4 无核酶灭菌水 2.5 F.3实时荧光RT-CR反应参数 推荐的实时荧光RT-PCR反应参数;第一阶段,反转录45C/15min;第二阶段,预变性95C/2mins 第三阶段,95C/15s,60C/60s,40个循环,在第三阶段每次循环退火延伸时收集荧光
试验结束后， 根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果
F.4注意事项 在检测过程中,应严防不同样品间的交叉污染
反应液分装时应避免产生气泡,上机前检查各反应 管是否盖紧,以免荧光物质泄露污染仪器
高致病性禽流感诊断技术GB/T18936-2020
随着全球范围内鸟类迁徙和贸易活动的不断增加，高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAI)已成为一种严重威胁禽类养殖业和公共卫生的传染病。为了更好地控制和预防禽流感疫情的发生，各国开展了大量的研究工作，提出了一系列的诊断技术和标准。
其中，我国于2020年发布了最新版的高致病性禽流感诊断技术标准GB/T18936-2020，该标准将成为我国禽流感诊断领域的重要规范。
高致病性禽流感诊断技术标准GB/T18936-2020的主要内容
GB/T18936-2020标准是我国在前版标准GB/T 18936-2003基础上进行修订和更新的产物。该标准主要涵盖以下内容：
- 术语和定义
- 检测方法的选择和应用
- 临床体征和病理学变化的评估
- 实验室检测方法的规定
- 标本采集、处理和保存的要求
- 数据处理和结果解释的标准
该标准对于禽流感的诊断和预防提供了明确的技术规范和操作指南。同时，标准的制定还为我国禽类养殖业的发展和公共卫生安全提供了保障。
高致病性禽流感诊断技术标准GB/T18936-2020在禽流感诊断中的应用
高致病性禽流感诊断技术标准GB/T18936-2020的发布，为我国禽流感的快速诊断和有效控制提供了有力支持。根据标准的规定，禽流感的诊断主要依靠病原学检测和临床诊断相结合的方法。
其中，病原学检测是一种直接检测病原体核酸、抗原或分泌物等的方法。该方法适用于实验室条件下的禽流感诊断，包括常规RT-PCR、实时荧光RT-PCR、LAMP等技术。在应用这些技术时，需要根据标准中的相关规定进行标本采集、处理、保存和数据处理等环节。
临床诊断则是通过观察禽类的临床症状、病理发现等非实验室手段进行的间接诊断。作为一种快速的诊断方法，临床诊断在禽流感的防控中起着重要作用。标准GB/T18936-2020对于临床症状、病理学变化的评估提出了明确的标准和指南。
除了病原学检测和临床诊断外，标准还规定了其他的检测方法，包括血清学检测、病毒分离等。这些方法可以为临床诊断提供补充，提高禽流感的诊断准确性。
综上所述，高致病性禽流感诊断技术标准GB/T18936-2020的发布，标志着我国禽流感诊断技术的进一步发展和完善。该标准的制定将为我国禽类养殖业的健康发展和公共卫生安全提供保障。
