饲料安全性评价喂养致畸试验

饲料安全性评价喂养致畸试验

国家标准 GB/T21035一2007 饲料安全性评价 喂养致畸试验 Feedsafetyevaluation一 Feedingteratogenieitytest 2007-06-21发布 2007-09-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T21035一2007 前 言 本标准是在参阅了GB15193.14一2003致畸试验及国内外相关文献的基础上,根据我国技术发展 水平研究制定的 本标准由农业部畜牧业司提出 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口 本标准负责起草单位:农业大学动物医学院、兽医药品监察所 本标准主要起草人:沈建忠、肖希龙、黄齐颐、张素霞吴聪明
GB/T21035一2007 饲料安全性评价 喂养致畸试验 范围 本标准规定了喂养致畸试验的基本技术要求 本标准适用于饲料和饲料添加剂的致畸性评价 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB14922.1实验动物寄生虫学等级及监测 GB14922.2实验动物微生物学等级及监测 GB14924.1实验动物配合饲料通用质量标准 GB14924. 2 实验动物配合饲料卫生标准 GB14924.3实验动物小鼠大鼠配合饲料 GB14925实验动物环境及设施 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 妊娠率gestationindex 妊娠鼠数占确认交配雌鼠数的百分比 3.2 分娩率parturitionindex 分娩活仔雌鼠数占奸娠鼠数的百分比 3.3 死胎率fetalmortality 死胎仔数占分娩胎仔总数的百分比 3 畸胎出现率incidenceofterata 畸胎总数占活胎仔总数的百分比 3.5 sumofterata 畸胎总数 出现畸形的所有活胎仔数 单项畸形出现率ineidene efsngle terat0sis 出现某种畸形的活胎仔数占活胎仔总数的百分比
GB/T21035一2007 meanincidenceofteratosis 活胎仔平均畸形出现率 畸形总数占活胎仔总数的百分比 3.8 畸形总数sumofteratosis 所有活胎仔出现的各种畸形种类数 母体畸胎出现率inecidenceofterataparturitior 分娩畸胎的母体数占妊娠母体总数的百分比 试剂及其配制 除特别注明外,本法所用试剂均为分析纯,水为去离子水,符合GB/T6682规定的二级用水要求 乙醇固定液:95%乙醉 4.2鲍因(EBouins)固定液:取饱和苦味酸溶液750mlL40%甲醛250ml和乙酸50ml混合而成 4.3氢氧化即溶液;分别配制1%和2%两种不同浓度的氢氧化钾溶液 茜素红(alizarinred)贮备液;将茜素红加人5mL乙酸、10mL纯甘油和60mL.1%水合氯醛的混 合液中至饱和 4.5茜素红应用液;取茜素红贮备液1mL,加1%氢氧化钾溶液至1000mL,用前临时配制 4.6脱水透明液A;甘油20mL2%氢氧化钾溶液3mL..加蒸水至100mL 4.7脱水透明液B;甘油50ml、.2%氢氧化钾溶液3mL,加蒸懈水至100mL 仪器与设备 5. 1 实验室常用设备 5.2放大镜和解剖显微镜 5.3游标卡尺百分尺). 实验动物及饲养管理 常用实验动物为大鼠、小鼠 首选大鼠,雌雄比例为1:1或2:1,大鼠交配时约12~14周龄,小鼠910周龄 使用清洁级大 鼠和小鼠应符合GB14922.1和GB14922.2的要求 实验动物饲养环境应符合GBl4925的规定,并注明动物饲养室的光照和通风条件,每天记录温 度.,湿度 笼养大鼠每笼不超过百只 饲料应符合GB1492t.1.GB1924.2和GB1924.3的规定 剂量分组 至少设4组,即1个空白对照组(或溶剂对照组)和3个试验组 试验组剂量一般选择在1/10~1/100母体LD之间 高剂量一般应使母体产生中毒症状;低剂量 应不引起母鼠产生可观察到的中毒症状;在高剂量组与低剂量组之间设1个2个中剂量组 设1个 空白对照组(或溶剂对照组),必要时,还要设阳性对照组 每组孕鼠不能低于12只 操作步骤 受试物给予与观察 8 -般采用混饲或混饮给予受试物 原则上雄鼠交配前4周~8周开始给予受试物直至交配成功， 确证雌鼠受孕为止 雌鼠从交配前2周4周开始给予受试物至孕期的第13天一第15天 在试验期 间,每天观察试验鼠的体征、行为活动、采食和饮水情况 每周至少称1次体重,并同时计算采食量
GB/T21035一2007 8.2受孕检查 雌、雄大鼠按1:1(或2:1)同笼后,每日早晨检查笼底有无阴道栓(石蜡状圆柱体)或用浸湿生理 盐水的棉签取阴道分泌物涂布于滴有1滴生理盐水的玻片上,置低倍显微镜下检查有无精子 发现阴 道栓或精子的当天定为孕期的0d 一般每组应获得13只15只受孕鼠,以保证实验结束时妊娠母鼠 数不少于12只 8.3孕鼠称重 孕鼠于孕期的0d、7d,l4d和20d称重,以观察孕鼠的体重变化,随时注意记录孕鼠的状况 孕鼠处死和检查 大鼠在孕期第20天(小鼠第19天)将孕鼠处死 沿腹中线剖开腹腔,取出子宫 分别检查并记录左 右侧卵巢黄体数、窝重(子宫连胎鼠)、子宫重、着床数、活胎数、死胎数(含早期及晚期死胎)和吸收胎数 8.5活胎鼠检查 逐个记录活胎鼠体重、性别体长,外观检查头颅外形、面部,躯干,四肢等有无畸形,包括露脑、脑膨 出、眼部畸形(小眼,无眼、睁眼等).鼻孔扩大.单鼻孔.唇裂.脊柱裂.,四肢及尾畸形等等 8.6胎鼠骨标本制作与检查 将每窝二分之一的活胎(奇数或偶数)放人乙醉固定液(4.1)中固定2》周一3周 取出胎仔(可去 皮、去内脏及脂肪)流水冲洗数分钟,放人至少倍于胎仔体积的1%一2%氢氧化钾溶液(4.3)中作用 8h一72h,然后将胎仔放人茜素红应用液(4.5)中染色6h 一48h,并轻摇1次/d 一2次d,至头骨染红 为宜 再将胎仔放人透明液A(4.6)中1d一2d,放人透明液B(4.7)中2d~3d,待骨骼红染而软组织 基本褪色为止 将胎仔标本放人 人小平皿内,用透射光源,在体视显微镜下作整体观察,逐步检查骨恪 检查时先测量囱门的大小,矢状缝的宽度、头顶间骨及后头骨缺损情况,然后检查胸骨的数目,缺失 或融合(胸骨为6个,骨化不完全时首先缺第5胸骨次缺第2胸骨)检查肋骨肋骨通常为12对 13对,常见畸形有融合肋,分叉肋、波状肋、短胁、多肋、缺肋、肋骨断裂),检查脊柱发育,椎体数目颈椎 7个,胸椎12个~13个,腰椎5个6个,骶椎4个,尾椎3个~5个)以及椎骨有无融合、纵裂等,最后 检查四肢骨 8.7胎鼠内脏检查 将每窝二分之一的胎鼠放人鲍因固定液(4.2)中,两周后作内脏检查 先用自来水冲去固定液,将 鼠仰放在石蜡板上,剪去四肢和尾,用刀片从头部到尾部逐段横切或纵切 观察不同切面器官的大小、 形状和相对位置 切面制作见图1 -经口从上聘与舌之间向枕部横切(切面1),可观察大脑、间脑、.正脑、舌及飘裂: 从眼眶前缘垂直纵切(切面2),可观察鼻道、鼻中隔" 从头部经眼球中央垂直纵切切面3),可观察眼球,视网膜、嗅球 从头部最大横位处纵切(切面4),可观察大脑及脑室 5 -沿下颁水平穿过颈部横切(切面5),可观察舌,咽、气管、食管和延髓 图1胎鼠切面制作示意图
GB/T21035一2007 以后自腹中线剪开胸、腹腔,依次检查心,肺、横嗝膜、肝、胃、肠等脏器的大小、位置,查毕将其摘除 再检查肾脏、,输尿管,膀胱、子宫和睾丸位置及发育情况 然后将肾脏切开,观察有无肾盂积水与扩 大等 统计处理和结果评价 根据检查情况,分别计算各组实验动物的妊娠率,分娩率、死胎率、畸胎出现率、单项畸形出现率、活 胎仔平均畸形出现数、母体畸胎出现率等 计算畸胎总数时,1个活胎仔出现1种或1种以上畸形均记 为1个畸胎;计算畸形总数时,如1个活胎仔表现出几种畸形,则应将相应数目记人总数 选用x检验或方差分析对试验结果进行分析评价 如试验组的上述指标显著高于对照组,并有剂 量-反应关系,可判定受试物具有致畸作用