小反刍兽疫诊断技术

小反刍兽疫诊断技术

国家标准 GB/T27982一2011 小反乌兽疫诊断技术 Diagnostictechniquesforpestedespetitsruminants 2011-12-30发布 2012-06-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27982一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口 本标准起草单位:农业部热带亚热带动物病毒学重点实验室、动物卫生与流行病学中心、 检验检疫科学研究院 本标准主要起草人;包静月、吴晓东、王志亮、李林、刘春菊、王清华,赵文姬,邹艳丽,郑东霞,徐天刚 李金明、姚李四,张乐、林祥梅、吴绍强、韩雪清
GB/T27982一2011 小反乌兽疫诊断技术 范围 本标准规定了小反刍兽疫的临床诊断和实验室诊断的技术要求 本标准适用于小反乌兽疫的诊断 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB194892008实验室生物安全通用要求 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 荧光定量反转录-聚合酶链式反应realtimequantitativereversetranseriptionpolimerasechainre actiom 荧光定量RT-PCR反应 在RT-PCR反应体系中加人荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个RT-PCR进程,最后通过 标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 3. 2 荧光域值thresholad 荧光定量RT-PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是 个15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 3 3.3 Ct值Ctvale 每个反应管内的荧光信号到达设定的荧光域值时所经历的循环数 生物安全措施 进行小反乌兽疫实验室检测时,如病毒分离、血清处理等,按照GB19489一2008 临床诊断 5.1临床症状 . .1.1突然发热,第2天第3天体温达40C~42C高峰 发热持续3d左右,病羊死亡多集中在发 热后期
GB/T27982一2011 5.1.2眼、鼻大量排出分泌物,最初水样的眼、鼻分泌物日益增多,变成脓性然后结干,动物发出恶臭 由于鼻孔被凸起的结干的鳞屑覆盖,动物打喷嚏和咳嗽 呼吸急促,呼吸困难,排痰性咳嗽和眼睛的卡 他性分泌物 .1.3口腔粘膜充血,口腔上皮和鼻腔粘膜出现大量部分粘连的极微小的略灰色坏死点,坏死组织脱 落后形成界线分明的浅糜烂斑 上皮破损偏好部位为嘴唇,齿龈,牙板,舌头以及母羊阴户的阴唇表面 口腔破损可能伴有大量流涎 55 .1.4发热2d~3d后病畜开始腹泻,伴随严重脱水、消瘦,虚脱 怀孕母羊可发生流产 5.1.5特急性病例在发热开始的4d6d内死亡 亚临床型病例症状较轻,病畜在生病10d14d 以后康复 2 5. 病理变化 5.2.1嘴唇充血,口腔破损程度不等,较轻的只有一处溃疡,严重的出现广泛的溃疡性及坏死性口腔 炎,涉及牙板、硬聘、颊粘膜和乳突和舌头喙部背面 粘膜病变可延伸至咽部,偶尔在网胃和瘤胃交 界处 5.2.2上呼吸道粘膜可能严重充血,伴有鼻孔和气管的溃疡 支气管肺炎,肺尖肺炎 5.2.3皱胃粘膜出现严重的充血和溃烂 偶尔,整个肠道出现弥散性的充血,但是,多数情况仅局限于 十 二指肠,回肠、盲肠和结肠上部分 常见回盲肠瓣膜出血 大肠纵向折叠顶部偶尔出现严重的出血形 成斑马样条纹 5.2.4肠淋巴组织坏死、萎陷 肠系膜淋巴组织轻微肿大,水肿,牌可能肿胀 上呼吸道粘膜可能严重 充血,伴有鼻孔和气管的溃疡 支气管肺炎,肺尖肺炎 肺部淋巴结肿胀并水肿 5.2.5结膜出现脓性结膜炎 肾和膀胱可见充血 母羊可见阴户和阴道糜烂 5.2.6组织学上可见肺部组织出现多核巨细胞以及细胞内嗜酸性包含体 5. 3 结果判定 山羊或绵羊出现上述临床症状和病理变化,羊群发病率,病死率较高,传播迅速,可判定为疑似小反 乌兽疫 实验室诊断 样品采集与运输 6.1.1样品的采集 每个发病羊群最少选择5只病畜采集样品 6.1.1.2选择处于发热期(体温40C41),排出水样眼分泌物,出现口腔溃疡,无腹泻症状的活畜 采集样品 采集结膜棉拭子2个,鼻粘膜棉拭子2个,颊部粘膜棉拭子1个,分别放在300L灭菌的 0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中 无菌采集血液10mL,用常规方法分离血清 6.1.1.3选择刚被扑杀或者死亡时间不超过24h的病畜采集组织样品 无菌采集肠系膜和支气管淋 巴结各3个4个,脾、胸腺、肠粘膜和肺等组织各约25g50g,分别置于50mL离心管中 6.1.1.4肉制品取25g一50g,置于50mL离心管中 6.1.2样品的运输与储存 样品采集后,置冰上冷藏送至实验室检测 6.1.2.2血清储存应置于一20C冰箱
GB/T27982一2011 6.1.2.3棉拭子、病料组织和肉制品储存应置于一70C冰箱 器械与设备 5%二氧化碳培养箱,DNA热循环仪,低温高速离心机,电泳仪和电泳槽,凝胶成像系统或者紫外检 测仪,实时荧光定量PCR仪,96孔高吸附性酶标板,洗瓶或者洗板机,恒温箱,酶标仪 病毒分离与鉴定 6.3.1试验材料 非洲绿猴肾(Vero)细胞,pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)见A.1),细胞培养液(见A.3),细胞培 养瓶 6.3.2样品处理 棉拭子充分捻动、挤干后弃去拭子,加人青霉素至终浓度200IU/mL.加人链霉素至终浓度 e/ml. 7笔作用1h 300斤离心I0m,眼上请液30w儿作为接种材料 200 用灭菌的剪刀、错子取大约o.5g组织样品或肉制品,置于研钵中,剪碎,充分研磨,加人5mL灭菌 的a.0molLpH7.4确酸盐缓冲被(含青霉素200U/ml,链霉素200g/mL),制成1:10悬液 7C作用1h 3000片离心10min,取上清液》mL作为接种材料 不能立即接种者,应将上清放一70C保存 6.3.3样品接种 取样品上清液接种已长成单层的vero细胞,37C恒温箱中吸附2h,加人细胞培养液,置5%二氧 化碳培养箱37C培养 6.3.4观察结果 接种后5d内,细胞应出现细胞病变效应,表现为细胞融合,形成多核体 如接种5d一6d后不出 现细胞病变,应将细胞培养物盲传三代 6.3.5病毒的鉴定 将出现细胞病变的细胞培养物,按“6.4RT-PCR方法”和“6.5荧光定量RT-PCR反应”做进- 步鉴定 6.3.6结果判定 样品出现细胞病变,而且RT-PCR方法或实时荧光RT-PCR方法鉴定结果阳性,则判为小反刍兽 疫病毒分离阳性,表述为检出小反乌兽疫病毒 否则,表述为未检出小反乌兽疫病毒 6 RI-PCR方法 6.4.1试剂与材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂 实验用水符合GB/T6682的要求 TRIzol试剂,三氯甲炕,异丙醉,无水乙醇,DEPC处理过的水(见附录B),反转录酶/TaqDNA聚 合酶混合液,2×一步法RT-PCR反应缓冲液,1.5%的琼脂糖凝胶(见附录B),0.5×TBE缓冲液(见附 录B),溴化乙锭
GB/T27982一2011 可以采用引物NP3/NP4用于小反乌兽疫病毒核酸的检测,引物的靶基因、位置、序列和扩增产物 的大小见表1 表1用于小反乌兽疫病毒RI-PCR检测的引物 引物 目的 粑基因 序列5'-3' 产物 正向引物 351bp NP3 N基因 TCTCGGAAATCGCCTCACAGACTG NP4 反向引物 N基因 CCTCCTCCTGG;TCC'TCCAGAATCT 6.4.2样品处理 将棉拭子充分捻动,挤干后弃去拭子,取100L样品液至一新的离心管中,加人1mLTRol试 剂,振荡混匀,进行RNA提取 取大约100mg组织样品,剪醉碎后,加人lmlTRIol试剂充分匀浆后转移至1.5ml离心管中,进 行RNA提取 6. .4.3RNA提取 经TRIzol处理的样品液12000r/min,！C离心10min,取上清,静置5nmin 加200L三氯甲 婉,振荡混匀,15s,静置2min~3min 12000r/min,4C离心15min,取400al上层水相到新的离 心管中,加400L的异丙醇,混匀,静置10min 12000r/min,4C离心10min,去上清 加人75%乙 醇lml.,混匀,12000r/nmin,4C离心5min,去上清 再加人75%乙醇1nmL,混匀,12000r/min,！c 离心5min,去上清 干燥RNA沉淀后加人100aLDEPC处理过的水溶解 立即进行RT-PCR反应 或一70丫保存 6.4.4RT-PCR反应 反应体系为25L,依次加人以下成分12.5L2×一步法RT-PCR反应缓冲液,1L正向引物 NP3(10mol/L),lL反向引物NP4104mol/I),lMlL反转录酶/TaqDNA聚合酶混合液,4.51 4L DEPC处理过的水,5LRNA模板 每次进行RT-PCR反应时均设标准阳性、阴性及空白对照 标准阳性用阳性对照RNA作为模板 标准阴性用Vero细胞RNA作为模板,空白对照用DEPC处理过的水作为模板 RT-PCR反应条件为50C反转录30min;94C，2min进行Taq酶的激活;94C，30s,55C. 30s." ,72，30s,共35次循环;72C延伸7min. 6. .4.5CR产物的电泳 取PCR产物5L在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像系统中观察结果 6.4.6质控标准 小反乌兽疫病毒RT-PCR标准阳性对照有大小为351bp的特异性阳性扩增条带,标准阴性对照和 空白对照无任何扩增条带,说明质控合格 6.4.7 结果判定 样品有大小为351p的特异性阳性扩增条带判为RT-PCR结果阳性,表述为检出小反刍兽疫病毒 核酸
GB/T27982一2011 样品无特异性的阳性扩增条带判为RT-PCR结果阴性,表述为未检出小反刍兽疫病毒 6.5荧光定量RT-PCR反应 6.5.1试验材料 TRIzol试剂,三氯甲,异丙醇,无水乙醇,DEPC处理过的水(见附录B).2×一步法荧光RT-PCR 反应缓冲液,TaqDNA聚合酶,反转录酶,参比荧光RoXI 引物和探针:引物和探针针对小反乌兽疫病毒N基因保守序列区段设计,引物和探针的位置和序 列见表2 表2用于小反刍兽疫病毒实时荧光定量T-PCR检测的引物和探针 引物 目的 位置 序列(s'-3' PPRN8a 1213-1233 cACAGCAGAGGAAGcCAAACT 正向引物 PPRN9b 反向引物 1327-1307 TGTTTTGTGcCTGGAGGAAGGA PPRN10P 探针 1237-1258 FAM-5'-CTcGGAAATcGCCTCGCAGGCT-3'-TAMRA 6.5.2RNA提取 同6.4.3 6.5.3荧光定量RI-PCR反应 反应体系为25AL,依次加人以下成分:12.5Al2×1stepbuffer,1L正向引物PPRN8a 10Mmol/L),l"l反向引物PPRN9b(10Mmol/L),0.5L探针PPRN1op(10pmol/L),0.54lTaag DNA聚合酶,0.5l反转录孵,0.5L参比荧光ROoxIl，3.5.DEPC处理过的水,5LRNA模 板 每次进行荧光定量RT-PCR时均设标准阳性、阴性及空白对照 标准阳性用阳性对照RNA作为 模板,标准阴性用Vero细胞RNA作为模板,空白对照用DEPC处理过的水作为模板 荧光定量RT-PCR反应条件为;42C反转录30min;95C，10min进行Taq酶的激活;95C 15s,60C，1nmin,共50次循环;每个循环在60C，1min时收集荧光信号 6.5.4质控标准 读取每个样品的Ct值 标准阳性对照样品有特异性扩增曲线而且Ct值<30,标准阴性对照和空白对照无特异性扩增曲 线,说明质控合格 6.5.5结果判定 样品有特异性扩增曲线而且Ct值<40判为实时荧光RT-PCR扩增阳性,表述为检出小反乌兽疫 病毒核酸 样品Ct值>40或者无特异性扩增曲线判为实时荧光RT-PCR扩增阴性,表述为未检出小反刍兽 疫病毒核酸 6.6竟争ELISA方法 6.6.1试验材料 包被用抗原:PPRV疫苗株重组N蛋白 对照血清强阳性血清、弱阳性血清、阴性血清 单克隆
GB/T27982一2011 抗体;小反乌兽疫病毒N蛋白的单克隆抗体 酶结合物;辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠血清 封 闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物溶液及终止液,配制方法见附录C 6.6.2抗原包被 PPRV重组N蛋白用包被缓冲液1:3500倍稀释后,每孔50AL包被96孔酶标板,37C置湿盒 吸附1h,用洗涤缓冲液洗板4次 6.6.3血清加样步骤 每孔加人45ML封闭缓冲液 每份待检血清做2孔,每孔加人5AL待检血清 设强阳性血清对照 孔(C+)4个,每孔加人5L强阳性血清,设弱阳性血清对照孔(C)4个,每孔加人5Al弱阳性血 清,设阴性血清对照孔(C-)2个,每孔加人5AL阴性血清,设单抗对照孔(Cm)4个,每孔加人5AL封 闭缓冲液,设酶结合物对照孔(Ce)2个,每孔加人55AL封闭缓冲液 单克隆抗体的加入 6.6.4 除酶结合物对照孔外,每孔加人50L.工作浓度的单抗.37C置湿盒作用1h,用洗涤缓冲液洗板 4次 6.6.5酶结合物的加入 每孔加人50Al工作浓度的酶结合物,37C置湿盒作用1h,洗涤缓冲液洗板4次 6.6.6显色与终止 每孔加人50L底物溶液,37笔避光反应10mim,每孔加人50L终止液 6.6.7读值 酶标仪预热15min,读取每孔492nm波长的吸光度值(oD值) 6.6.8计算抑制率 按照式(1)计算每孔(包括对照孔)的抑制率,并计算每份样品的平均抑制率 PI=100一(ODrOD×100 式中: 抑制率; PI 试验孔或对照孔oD值， OD 单抗对照孔oD平均值 OD 质控标准 6.6.9 结果在质控标准(见表3)范围内,则试验成立 表3小反刍兽疫竟争ELIsA检测方法质控标准 目 项 最大值 最小值 Cm孔的OD值 1.500 0.500 Cc孔抑制率 +105 十95 Cm孔抑制率 十20 -19
GB/T27982一2011 表3(续 最小值t 项 目 最大值 C十十 孔抑制率 90 81 c十孔抑制率 80 51 孔抑制率 30 6.6.10结果判定 平均抑制率(PI)>80.,判为强阳性,50<平均抑制率(PD)<80.,判为弱阳性,表述为小反刍兽疫血清 学阳性 早均排制率(P<0,判为阴性,表述为小反刍兽疫抗体血清学朗性 综合判定 凡具有6.3.6,6.4.7,6.5.5,6.6.10中任何一项阳性者,均判为小反乌兽疫阳性
GB/27982?2011 ?A 淶?? ? A.1pHH7.4λ?(Ps NaC 8.00g KCl 0.20g NaHPO2H,O g l1.44 KH,PO 0.24g HC?pH?7.4,??1000mL,1.03410Pa? 20min?PBs??,4C治3? A.2DMEM? DMEM 13.37g ?(NaHcO.) a.7 g 10001 ? ml ?,0.224nm???4C A.3?? 950mL DMEM? 50mL ??? ù?200IU/mL,ù?2004g/mL,ùB?2.5g/ml ??4档
GB/T27982一2011 附 录 B 规范性附录 反转录-聚合酶链反应溶液的配制 B.1DEPC处理过的水 DEPC l1m 去离子水 1000ml 充分混匀,将瓶盖拧松后置于37C放置过夜,高压灭菌 B.25×TBE缓冲液 54 Tri、碱 g 砌酸 27.5g 20mL 0.5mol/L EDTA 加去离子水调整体积至1000mL B.30.5×TBE缓冲液 取100mL5×TBE缓冲液,加去离子水调整体积至1000mL B.41.5%的琼脂糖凝胶 0.75 琼脂糖 g 50mL 0.5×TBE缓冲液 2.5儿l 澳化乙锭溶液(10mg/ml 称取0 75只琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加人50ml0.5×TBE缓冲液,加热溶解,冷却至 0笔一0笔时加人2.5儿澳化乙绽游液,倒人胶槽内自然濒固
GB/27982?2011 ? c 淶?? ?? C.1? -0.05mol/LplH9.6?/?λ? Na.CO. 0.318 g 0.588g NaHC(O. ?? 200ml 0.224m??,±汸á ???- ?pH7.4PBST0.05%-20 -20 0.5ml pH7.4PBS 1000ml C.3??(3%BSApH7.4PBSs) BSA 30s g 1000mL pH7.4PBS ???? C.4? C.4.1A? NaHPO 3.682g 1.021 0.06g ?? 00ml ?,?4C8C档 C.4.2B? 1.05g EDTA 14.6 mg TMB3,3'- 25.0 mg ?? 100ml 0.45m?,?,?4档 C.4.3÷ ??,A?B?1:1?? 10o
GB/T27982?2011 C.5??3mol/LHso 16.5 ? ml 87.5mL ?? ????,?

小反刍兽疫诊断技术GB/T27982-2011

小反刍兽疫诊断技术是一种高效、快速、灵敏和特异的诊断方法，广泛应用于COCA的监测和诊断。

该诊断技术利用多种手段，如血清学、分子生物学等，对COCA进行全方位的检测和诊断。其中最常用的是血清学诊断方法，通过检测动物体内对COCA的抗体水平来确定感染情况。同时，分子生物学诊断方法也越来越受到重视，通过检测COCA相关基因的扩增和检测来确定感染情况。

在实际应用中，该诊断技术的操作简单、快速、高效，可用于各种类型样本的检测，如血清、乳汁、脑脊液等。同时，该技术还具有高度的特异性和灵敏性，可避免与其他病原体的交叉反应，并能够准确鉴定COCA感染。

综上所述，小反刍兽疫诊断技术是一种高效、快速、灵敏和特异的诊断方法，已被GB/T27982-2011标准采纳。在COCA的监测和诊断中具有重要的应用价值，为保障畜牧业生产和动物健康提供了有力的技术支持。

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