国家标准 GB/T31787一2015 香石竹环斑病毒分子生物学检测方法 MoleeulardeleetionofCarnaionringspotvirus 2015-07-03发布 2015-11-27实施中毕人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布中国国家标准化管厘委员会国家标准
GB/T31787一2015 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAc/TC271)提出并归口本标准起草单位;上海出人境检验检疫局,天津出人境检验检疫局、上海市标准化研究院、珠海出人境检验检疫局本标准主要起草人;杨翠云、于翠,魏亚东、杨瑞钳、张卫东、郭京泽,胡培龙、崔学慧
GB/T31787一2015 香石竹环斑病毒分子生物学检测方法范围本标准规定了香石竹环斑病毒的RT-PCR、IC-RT-PCR和实时焚光RT-PCR等分子生物学检测方法本标准适用于植物种苗中携带的香石竹环斑病毒的检测规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 sN/T1193基因检验实验室技术要求 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样仪器设备、用具和试剂 3.1仪器设备 PCR仪,实时荧光定量PCR仪,超净工作台、电子天平(1/10000g,电泳仪,电泳槽,凝胶成像系统、水浴锅、高速冷冻离心机、一80C超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、漩涡振荡器 3.2用具可调式微量移液器(2Al10L、,100AlL200l、1000L)及相应的无RNase吸头,无RNase离心管,PCR管和研钵等 3.3试剂 RT-PcR试剂(见附录B),cRT-PCR试剂(见附录c). 症状观察及抽样 4.1症状观察现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为害的症状,CRsV为害症状描述参见附录A 4.2抽样发现有病毒为害症状的植物材料直接送检;未发现症状的,则按SN/T2122中规定进行抽样,并送实验室进行病毒检测鉴定病毒检测 RT-PCR方法 5.1 将送检植物样品中有疑似病毒为害症状的植物组织液氨研细.取0.1g用于提取植物总RNA.然后
GB/T31787一2015 反转录获得cDNA.再进行PCR反应具体操作步骤见附录B 5.2免疫捕获RT-PCR方法(Ic-Rr-CR) 将送检样品中有疑似病毒为害症状的植物组织放人研钵内研磨,并按重量和病毒抽提缓冲液 1:10的比例稀释,制备的汁液分别盛装于离心管中,离心后吸取上清液作为待测样品用香石竹环斑病毒抗血清包被PCR管,洗涤后在PCR管中加人制备的待测样品,进行免疫捕获，然后反转录获得cDNA,再进行PCR反应具体操作步骤见附录G CC 5.3实时荧光RT-PCR方法采用5.1或者5.2方法获得cDNA,进行实时荧光PCR反应具体操作步骤见附录D 防污染措施香石竹环斑病毒分子生物学检测过程的防污染措施应符合SN/T1193的规定制样用的研钵经过洗涤液清洗后,160C干热处理2h. 结果判定样品经RT-PCR,IC-RT-PCR和实时荧光RT-PCR三种方法之一检测为阴性时,证明样品不携带香石竹环斑病毒样品经RT-PCR或IC-RT-PCR检测为阳性,需要进行序列测定,如果序列测定结果证实与所检测的香石竹环斑病毒一致,可判定样品携带香石竹环斑病毒样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性时,也可判定样品携带香石竹环斑病毒样品保存和结果记录 8.1 样品保存经检测确定携带香石竹环斑病毒的样品,应妥善保存在一80冰箱中并做好登记和标记工作保存期满后,需经灭活处理 8.2结果记录记录包括样品来源、种类,取样人员,实验的时间,地点,方法和结果,检验检疫员的签字等 RT PCR和IC-RT-PCR检测应有电泳结果照片及序列测定分析结果,实时荧光RT-PCR应有荧光曲线图与Ct值
GB/T31787一2015 附录A 资料性附录) 香石竹环斑病毒背景资料 A.1背景资料 A.1.1香石竹环斑病毒基本信息中文名:香石竹环斑病毒学名:Carnatioringspoir4s 缩写;CRsV 分类地位;番茄丛矮病毒科(Tombusviridae),香石竹环斑病毒属(Dianthoeirus) 传播途径该病毒通过无性繁殖材料的运输进行长距离传播,近距离主要是由于植物间的接触、土壤污染和农事操作等引起病毒传播尚未见种传报道 A.1.2方法原理用特异性抗体吸附待测样品中的病毒粒子后经高温裂解释放出病毒RNA,或直接从待测样品材料中提取植物总RNA,然后在逆转录酶的作用下合成cDNA,以cDNA为模板再通过普通PCR或实时荧光PCR进行检测分析PCR结果即可明确材料中是否含有香石竹环斑病毒的核酸成分 A.2寄主范围香石竹环斑病毒的实验寄主范围较自然寄主广,在自然条件下,CRSV主要侵染香石竹,还可侵染李树、梨树、苹果、葡萄、酸樱桃和甜樱桃等多种果树及果园里的杂草,如;繁缕在实验条件下,CRsV可侵染25科共133种植物,可系统侵染茄科、豆科和葫芦科的植物,非系统侵染的寄主范围更广 A.3为害症状 CRsV侵染香石竹引起叶片环斑,斑驳,导致叶和花的扭曲及畸变,严重可致叶尖坏死当CRsv与香石竹斑驳病毒(Caratiommottleinm 识s)共同侵染时,症状加重 CRsV侵染果树的症状较轻且很难发现 CRsV接种如下几种鉴别寄主可产生相应的症状,可用来作为该病毒的鉴定方法之色蔡(Che innoa):接种叶出现局部褪绿或坏死斑,通常 bodium.amaranthieolor)和昆诺藜(C.gui enou 无系统症状三生烟(Nie NN):接种叶出现退绿环斑、枯斑及坏死斑,后期病斑连成 cotia71tabc477nvar.Sa7S2(7n 片豇豆(Vignaunguiculatassp.Sinensis) );接种叶产生局部坏死斑,接着系统感染叶产生斑驳、坏死斑,叶片卷曲或脉缩美国石竹(Diathusbarbatus);接种叶产生环状病斑,接着为系统褪绿及坏死斑千日红(Gomphrenaglobosa);接种叶产生局部坏死环斑,接着系统感染叶产生病斑、斑驳和畸形菜豆(Phaseoluszulgaris);接种叶产生局部坏死斑,接着叶变白、坏死,产生不规则系统斑,坏死叶
GB/T31787一2015 脉斑,最后无症带毒番杏(Tetragoniaeransa):接种后叶片产生局部白斑,有时也产生系统坏死斑 A.4分布欧洲;丹麦、芬兰、法国、德国、意大利立陶宛、荷兰、波兰和英国美洲;巴西,加拿大,哥伦比亚、墨西哥和美国大洋洲:澳大利亚和新西兰 A.5病毒粒体形态病毒粒体为直径34nm的正二十面体(T=3),由180个分子质量为37900u的蛋白亚基组成病毒粒子外壳 A.6基因组基因组由RNA-1和RNA-2两条单链RNA分子组成,分别为3.8kb和1.4kb RNA-1在缺少 RNA-2时可单独在植物原生质体中进行复制,但侵染植物需RNA-1和RNA-2的共同作用
GB/T31787一2015 附录B 规范性附录 RT-PCR方法 B.1试剂 B.1.1RNA提取试剂 Tizol裂解液、三氯甲烧、异丙醇、75%乙醇 B.1.2反转录试剂 AMV反转录酶(5U/L)、5×AMV酶缓冲液,dNTP(10mmol/L),RNA酶抑制剂(40U/aL) B.1.3PCR试剂 10×PCR缓冲液,氯化镁(25mmol/L),dNTP(10nmnmol/L)、TaqDNA聚合酶(5U/L) B.1.450×TA上 Tris 242g 冰乙酸 52.1m 0.5mol/LEDTA 100ml 用时加蒸僧水稀释至1×TAE B.2实验步骤 B.2.1引物序列上游引物.CRsV-F:5'-CCGATGTGCcCAAGTATGT-3’; 下游引物.CRsV-R:5'-GGcTATGAcGcCGTGAAT-3' 扩增片段长度406bp B.2.2RNA提取取适量待测样品液氮研细,然后取0.1g磨碎的样品放人l.5mL离心管中,加人1mLTrizol,混匀;加人0.2nml三氯甲婉,猛烈振荡15s,4c11000r/min离心10min,小心吸取上层无色水相到新离心管中;加人等体积异丙醇,混匀,一20静置10min.4C12000r/min离心15mi n,保留沉淀;加人1m75%冷乙醇,悬浮沉淀,4C8000; r/min离心10min,干燥沉淀;加人30l.DEPCH.O,溶解沉淀(必要时,55C60C水浴10min,加速溶解),存于一80C备用或者按照植物总RNA提取试剂盒说明书进行操作 B.2.3反转录反应体系及反应条件见表B.1l,试剂加样量可根据具体情况进行适当调整也可采用RT-PCR 步法试剂盒,操作步骤按使用说明进行
GB/T31787一2015 表B.1反转录反应体系与反应条件储存液浓度名称终浓度加样量/Al 下游引物 204mol/I 1.0Amol/L. RNA H.O 上述混合物于70C,温育5min;立即置于冰上,lmin,加人下列试剂缓冲液 5 dNTP 10mmol/I nmnmol/L l.0 RNA酶抑制剂 40U/ 2U/l AMV 5U/aL 0.5U/L 20 总体积反转录反应条件;12C,50min;8C,5min立即置于冰上,此时得到的是病毒cDNA 如不立即进行PcR扩增,应将反转录产物置于一20C保存 B.2.4核酸扩增 PCR反应体系见表B.2,每个样品设2个平行处理反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整检测时以含香石竹环斑病毒材料的cDNA或含有香石竹环斑病毒材料目标片断的质粒作为阳性对照,以健康植物材料(尽量与所检测样品一致)eDNA作为阴性对照,以水代替模板作为空白对照 ,94笔30s.52C30s、,72C30s,30个循环;72c10minm PCR反应条件设置如下:94C3min;9 延伸表B.2PCR反应体系试剂名称终浓度 10×CR反应缓冲液 2.,0mmol/ MgC| dNTP 0.2mmol/L 上游引物 0.2umol/L 下游引物 0.2丝mmol/L TaDNA聚合酶 1.5U DNA模板 2从l 至 H.0 25nl B.2.5琼脂糖凝胶电泳检测用1×TAE配制1.5%琼脂糖凝胶,加热溶化后冷却至55C左右;将溴化乙锭(EB)加人到配制好的凝胶中,EB终浓度为0.54g/mL 将凝胶倒人凝胶槽中,插上样品梳子冷却凝固后拔掉梳子,在电泳槽内加人1×TAE,缓冲液要没过凝胶表面约1mm;将加样缓冲液与样品混合后加人样品孔,并加人
GB/T31787一2015 分子质量标准物(Marker);接通电源,以3V/em一5V/em电场强度进行电泳,0.5h后观察结果;将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察,记录结果 B.2.6结果判定通过观察,阳性对照出现406bp条带,阴性和空白对照不会出现相应条带,此时如果检测样品呈现相应条带应被判为阳性,否则应被判为阴性如果是阳性可通过测序的方式进一步确认如果PCR产物序列与香石竹环斑病毒的序列同源,则可判定样品为香石竹环斑病毒阳性,若序列不同源,则可判定样品为香石竹环斑病毒阴性
GB/T31787一2015 附录c 规范性附录免疫捕获RT-CR方法(IC-RT-PCR方法》 c.1试剂 C.1.1CRSV抗体 C.1.2反转录试剂 AMV反转录酶(5U/L),5×AMV酶缓冲液,d小NTP(10mmol/L),RNA酶抑制剂(40U/AL). c.1.3包被缓冲液(plH9.6 碳酸钠(Na.cO, l.59g 2.93 碳酸氢钠(NaHCO) g 叠氮钠(NaN,) 0.2" 溶于蒸馏水中,并用蒸馏水定容至1L c.1.4PBST缓冲液(p7.4 氯化钠(NaC1) 8.0 磷酸二氢钾(KH,PO) 0.2g 1.15 磷酸氢二钠(Na,HPO 12H.O g 0.2x 氧化钾(KCD 叠氮钠(NaN,) 0.2" 吐温20(Tween-20) 0.5mL 溶于燕僧水中,并用燕僧水定容至1L C.1.5样品抽提缓冲液(pH7.4) 亚硫酸钠(NaSO.) 1.3" 聚乙烯基毗咯婉酬(PVPy 20g 溶于PBST中,并用PS定容至1L 实验步骤 c.2.1引物序列见B.2.1 C.2.2抗体吸附将CRsV抗体用包被缓冲液作适量稀释,吸取200L包被R管,.37C,孵育2h,用PBsT洗 3次,取样品50mg,加人样品抽提缓冲液进行研磨,吸取100L.包被PCR管,4C过夜(或37C,孵育 2h);PBST洗3次,DEPC-H,O洗1次,短暂离心后吸去管底余液
GB/T31787一2015 C.2.3反转录直接在吸附了病毒的PCR管中进行反转录反转录体系总体积20Al,其中1l 反向引物 (20mol/L),生AL5×AMV酶buffer,2l.dNTP(10mmol/L),l0LDEPC-H.O,稍离心混匀后,置 85C变性5min,迅速置冰上2nmin一3min,然后加人2LAMV反转录酶(5U/aL),lLRNA酶抑制剂(40U/nL),42C反应1h c.2.4CR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测操作方法见B.2.4和B.2.5. c3结果判断通过观察,阳性对照出现406p条带,阴性和空白对照不会出现相应条带,此时如果检测样品呈现相应条带应被判为阳性,否则应被判为阴性如果是阳性可通过测序的方式进一步确认如果PCR产物序列与香石竹环斑病毒的序列同源,则可判定样品为香石竹环斑病毒阳性,若序列不同源,则可判定样品为香石竹环斑病毒阴性
GB/T31787一2015 附录 D 规范性附录实时荧光RI-PCR方法 D.1实验步骤 D.1.1 引物和探针序列引物序列:上游引物:CRSV-F-163:5'-TTACCTGGCGCGCACTATT-3'; 下游引物:CRSsV-R-163:5'-GCTCTTGAGTATGAGAGCAAG-3’ 探针序列;FAM-5'CAGCAAcCAGAACCG3’-TAQMAN-MGB. D.1.2eNA合成可通过对样品进行RNA提取,再反转录获得ecDNA,操作方法见B.2.2和B.2.3;也可以通过抗体吸附样品中的病毒粒子,直接反转录获得cDNA,操作方法见c.2.2和c.2.3 D.1.3实时荧光PCR反应体系实时荧光R反应体系见表D.1l,每个样品设2个平行处理并设阳性对照,阴性对照和空白对照,以含有香石竹环斑病毒的cDNA为阳性对照;以健康植物材料的cDNA作为阴性对照;以水代替 DNA模板作为空白对照每种对照各做2个平行管表D.1实时荧光PCR反应体系试剂名称终浓度 10×PCR反应缓冲液 MMgC 3.0mmol/L dNTP 0.2mmol/L 上游引物 0.4Amol/L 下游引物 0,4mol/1 1U ruDNA聚合刚探针 0.24mol/I DNA模板 14l 补H.0至 25小 D.1.4实时荧光PCR反应参数反应条件;预变性94C10min,94C15s,60C40s,72C40s,共40个循环本反应条件适用于AB17500型荧光PCR仪,如使用其他荧光PCR仪,可根据仪器性能进行适当调整操作方法按照仪器的使用说明进行,反应结束后保存各项数据和图像 1o
GB/T31787一2015 D.2结果判定 D.2.1阅值设定值设定根据仪器噪音情况进行调整,或以闵值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点,结果显示阴性为准 D.2.2质控标准阳性对照的Ct值应<30.0,并出现典型的扩增曲线否则,此次实验结果无效阴性对照和空白对照无Ct值 D.2.3结果判定在阳性样品和阴性样品Ct值正确的情况下,进行以下判定: -待测样品的Ct值为40或无Ct值时,则判定结果阴性 -待测样品的Ct值小于或等于35时,则判定结果阳性; 待测样品的C值小于40而大于35时,应重新进行测试,如果重新测试的Ct值为40时,则判定结果阴性如果重新测试的Ct值小于40而大于35时,则判定结果阳性

香石竹环斑病毒分子生物学检测方法GB/T31787-2015

香石竹环斑病毒是一种常见的植物病毒，广泛分布于世界各地。该病毒会感染多种植物，如香石竹、勿忘草、番茄等，导致植株叶片出现环形斑点，在重度感染下还会引起植株畸形、凋萎等严重症状，对农业生产造成很大影响。

为了更好地控制香石竹环斑病毒的传播，开发出一种高效、准确的检测方法非常必要。目前，基于分子生物学的检测方法已经成为主流。其中，PCR和ELISA技术是两种被广泛使用的方法。

PCR技术检测香石竹环斑病毒

PCR技术是一种通过扩增目标序列使其达到可以检测的水平的方法。基于PCR技术的分子生物学检测方法具有高灵敏度、高特异性和快速性，能够准确、迅速地检测出香石竹环斑病毒。

具体操作步骤如下：

提取植物组织总RNA：从叶片或芽组织中提取总RNA，用琼脂糖凝胶电泳或纳米分光光度计检测RNA的完整性和纯度。
合成cDNA：将总RNA逆转录得到cDNA，反应体系包括RNA模板、随机引物、dNTPs、M-MLV逆转录酶、RNase抑制剂和逆转录缓冲液。
PCR扩增：在cDNA模板基础上进行PCR扩增反应，反应体系包括cDNA模板、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、引物和dNTPs。
检测扩增产物：将PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳或其他方法进行检测。

ELISA技术检测香石竹环斑病毒

ELISA技术是一种基于抗原-抗体反应的检测方法，具有高灵敏度、高特异性等特点。相比PCR技术，ELISA技术操作简单、快速、易于批量化，因此被广泛应用于香石竹环斑病毒的检测。

具体操作步骤如下：

制备抗原：将从感染植物中提取的病毒颗粒进行纯化和浓缩，制备成ELISA检测的抗原。
涂布抗原：将制备好的病毒抗原溶解在适当的缓冲液中，涂覆在微孔板上固定。
加样本：将待检样本加入到微孔板中，并充分混合，使其与固相抗原发生反应。
添加检测抗体：加入经过标记的检测抗体，使其与已结合在固相抗原上的目标病毒抗原形成复合物。
洗涤：通过洗涤步骤去除未与固相抗原结合的物质，保留目标病毒抗原和检测抗体的复合物。
添加底物：加入含有酶标记的底物，使其与检测抗体形成反应，生成可检测信号。
测定结果：通过检测底物反应产生的颜色或荧光等信号来判断样本是否为阳性，从而确定是否存在香石竹环斑病毒。

综上所述，基于PCR技术的分子生物学检测方法和基于ELISA技术的免疫检测方法是目前常用的香石竹环斑病毒检测方法。选择合适的检测方法对于准确快速地检测出香石竹环斑病毒、控制其传播非常重要。