牛和猪脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮残留量的测定液相色谱-紫外检测法

牛和猪脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮残留量的测定液相色谱-紫外检测法

国家标准 GB/T20753一2006 牛和猪脂肪中醋酸美仑孕酮醋酸氯地孕酮 和醋酸甲地孕酮残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 Methodforthedetermminationofmelengestrolacetate，chlormadinone acetateandmegestrolacetateresiduesinbowineandporeinefat LC-UVDetectionMethod 2007-03-01实施 2006-12-31发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20753一2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由秦皇岛出人境检验检疫局提出 本标准由国家质量监督检验检疫总局归口 本标准起草单位:秦皇岛出人境检验检疫局、上海出人境检验检 疫局 本标准主要起草人;庞国芳、唐毅锋方晓明、王传现、姜维 本标准系首次发布的国家标准
GB/T20753一2006 牛和猪脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮 和醋酸甲地孕酮残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 范围 本标准规定了牛和猪脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮残留量的液相色谱测定 方法 本标准适用于牛和猪脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮残留量的测定 本标准的方法检出限:醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮均为0.010g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分;总则与定义 GB/T6379.1一2004,Iso5725-1,1994,IDT GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,ISO5725-2;1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一1992,neqISO3696;1987) 原理 脂肪样品经微波融化,用乙睛提取,皂化后,经丙基型固相萃取柱净化,C色谱柱分离,紫外检 测,外标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为优级纯,水为GB/T6682规定的一级水 乙睛色谱纯 4.2甲醇;色谱纯 4.3乙酸乙酯;色谱纯 正己烧;色谱纯 4.5氧化镁(MgCl 6H.O). 4.6氢氧化钠 盐酸 4.8乙酸乙酯十正己婉(1+19):量取10m乙酸乙酯(4.3)与190ml正己烧(4.4)混合 乙酸乙酯十正己烧(1十4);量取40mL乙酸乙醋(4.3)与160mL正己烧(4.4)混合 44 10盐酸溶液:0.2% 移取2.0ml盐酸(4.7)与水混合至1L 4 .11氯化镁溶液1.0mol/L 称取20.3g氯化镁(4.5),用水溶解并定容到100mL 4.12氢氧化钠溶液:0.1mol/L 称取1.00g氢氧化钠(4.6),用水溶解并定容到250 ml 4.13乙睛十水(65十35):量取650mL乙睛(4.1)与350mL水混合,摇匀,脱气,待用
GB/T20753一2006 .14标准物质:醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮,纯度>97% 4. 4.15标准储备溶液10004g/mL 准确称取醋酸美仑孕酮,醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮(4.14)标 准物质各0.0500g于50ml容量瓶中,用甲醇(4.2)溶解并定容至刻度 标准储备溶液于4C保存,可 使用1年 4.16混合标准溶液I:100g/ml 分别吸取10.0ml.醋酸美仑孕酮醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮 标准储备液(4.15)于100mL容量瓶中,用甲醇定容 该混合标准溶液于4C保存,可使用1年 4.17混合标准溶液I:;1.0g/ml 取1.0mL.混合标准溶液I(4.16)于100ml.容量瓶中,用甲醉定 容 该混合标准溶液于4C保存,可使用6个月 4.18混合标准工作溶液;分别吸取10L,20L,40L,80L,l00L.混合标准溶液I(4.17)添加到 80AL,970l.950AL.910AL.890L的乙睛十水(65十35)(4 13)中,再加人10AL盐酸溶液 mL混 (4.10),混匀,得到浓度为0.010g/ml0.020 04E/ml.0.o0e/" /ml,0.080g/mL 和0.104g/ 合标准工作溶液,该溶液当目制备 使用前分别用5mL乙酸乙酯和6mL正己烧淋 4.19氮丙基固相萃取柱或相当者3mL,500nm mg 洗,保持柱体湿润 4.20滤膜:0.2 2Am 仪器 5.1高效液相色谱仪;配有紫外检测器 5.2分析天平;感量0.1mg和0.01g 5.3氮气浓缩仪. 5.4固相萃取装置;配有真空泵 5.5低温离心机一5C至室温,最大转速5000r/minm 5.6液体混匀器 5.7恒温水浴 5.8微波炉 5.9移液器;10l~100l 和100l~1000l 试样的制备与保存 试样制备 把大约5g的猪或牛脂肪组织切成小块,然后放人底部塞有玻璃棉的漏斗中,将漏斗放人150m 的烧杯中,将烧杯置于微波炉内 使用最大功率,加热30s一60s,如果脂肪没有融化,可在间隔30s~ 60s以后重复加热30s一60s,直到有液体脂肪流出,通过漏斗滴人烧杯中 根据需要熬制的脂肪量， 可重复加热 把熬制好的脂肪油放人样品瓶中,密封,并做上标记 6.2试样保存 如果熬制好的脂肪液体不立刻测定,则将熬制好的脂肪样品置于一18C冰柜中,冷冻保存 测定步骤 7.1提取 称取2g脂肪样品,精确到0.01g,置于50mL具塞离心管中,加人5mL乙晴,于60C水浴中保持 3 min,使固体脂肪融化 用液体混匀器(5.6)涡旋1min,于一5C以3500r/min离心7min,吸取上清 液至15mL具塞聚丙烯离心管中,再向沉淀物中加人5ml乙睛重复提取一次,合并上清液 向合并的 乙晴提取液中加人2mL正己婉,涡旋1min,于一5C以3500r/min离心5min,弃去正己烧层,乙晴相 再用2mL正已烧重复洗涤一次,弃去正己浣层 乙睛提取液于60c用氮气浓缩仪吹干
GB/T20753一2006 7.2皂化 向乙睛提取液(7.1)中依次加人4mL正己婉、1ml氢氧化钠溶液(4.12)和0.5mL氧化镁溶液 4.ll),于液体混匀器上快速混匀10s,在60C水浴中保持15min,于一5C以3500r/min离心5min 吸取上清液至15m玻璃离心管中 向沉淀物中再加人4ml，正己炕,混匀,于60C水浴中加热 5min后,于一5C以3500r/min离心5min,合并上清液 于60C用氮气浓缩仪吹干,用1.0mL 正 己烧溶解残渣,待净化 7.3净化 将上述样液(7.2)移人暂丙基固相萃取柱中(4.19),用2mL正己烧分两次润洗玻璃试管,洗液也 移人固相萃取柱中 待样液流出后,依次用5mL 正己烧和6ml乙酸乙酯正己炖溶液(4.8)淋洗固 相萃取柱,淋洗液流出后,固相萃取柱抽干2min,最后用3.5mL乙酸乙酯十正己烧溶液(4.9)洗脱,洗 脱液收集于另一15ml 玻璃离心管中,于60C用氮气浓缩仪吹干 残余物用990L乙腊十水(4.13) 涡旋溶解,静止15min后,加人10L盐酸溶液(4.10),混匀,过0.2m滤膜后,供液相色谱测定 7.4测定 7.4.1液相色谱条件 色谱柱:KromasilCs,5Am,250mm×4.6mm(内径)或相当者; a b)预柱:C,54m.12.5mm×4.6mm(内径); 流动相:乙晴十水(65十35); c 流速:1.0mL/nmin; d 柱温;35C; 检测波长;292nm; fD 进样量;40L g 7.4.2液相色谱测定 用混合标准工作溶液(4.18)分别进样,以标准工作溶液浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标 准工作曲线 用标准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕 酮的响应值均应在仪器测定的线性范围内 在上述色谱条件下,醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲 地孕酮标准物质的液相色谱图参见图A.1 7.5平行试验 按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定 7.6回收率试验 阴性样品中添加标准溶液,按7.1一7.3操作,测定后计算样品添加的回收率 结果计算 结果按式(1)计算 1000 X=c×一X 1000 式中 试样中被测组分残留量,单位为毫克每千克(mg/kg) 从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度,单位为微克每毫升(ug/mL); 试样溶液定容体积,单位为毫升(mL); m -最终试样溶液所代表的试样质量,单位为克(g). 精密度 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,重复性和再现性的值
GB/T20753一2006 以95%的可信度来计算 9.1重复性 在重复性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,试样中被测物的含 量范围及重复性方程见表1和表2. 表1牛脂肪中三种孕酮的含量范围及重复性和再现性方程 化合物名称 含量范围/nmg/ke) 重复性限" 再现性限R 醋酸美仑孕酣 0.0100.050 r=0.1338m+0.2532 R=0.2093m 0.0100.050 r=0.1246m R=0.1341m 醋酸氧地孕阴 醋酸甲地孕酮 0.010~0.050 r"=0.0857m R=0.1228m 注:m为两次测定结果的算术平均值 表2猪脂肪中三种孕酮的含量范围及重复性和再现性方程 化合物名称 含量范围/mg/kg) 重复性限r 再现性限R 醋酸美仑孕- 0.0100.050 r=0.6518m R=0.6771m 醋酸氯地孕酮 0.0100.050 r=0,0458m十1.0587" R=0.0617m十1.2235 醋酸甲地孕阴 R=0.0763十1.0742 0.0100.050 "=0.0590m十0.7958 注，"为两次测定结果的算术平均值 如果两次测定值的差值超过重复性限r,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 再现性 在再现性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,试样中被测物的含 量范围及再现性方程见表1和表2
GB/T20753?2006 ? A ?? ???? ???????????,?A.1 0.0008 0.0006 0.0004 0.0002 ? 0.0000 -0.0002 -0.0004 0.00.002.003.004.05.00.07.00?.009.00o.00I.002.0013.001401.0 1/min -?г" -?; -г? ?A.1???????????
GB/T20753一2006 附 录 B 资料性附录 回收率 本方法中三种孕酮添加浓度及其平均回收率的试验数据,见表B.1 表B.1三种孕酮添加浓度及其平均回收率的试验数据(=10) 化合物名称 添加浓度/mg/kg) 平均回收率/(% 0.010 91.8 醋酸美仑孕 0.020 87.4 0.050 88.8 0.010 89,l 醋酸氯地孕酌 0,020 86," 0.050 89.0o 0,010 88.1 醋酸甲地孕酮 0.020 89.6 0.050 90.2