GB/T28715-2012
饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定分光光度法
Determinationofacidicandneutralproteaseactivityinfeedadditives-Spetrophotometricmethod
- 中国标准分类号（CCS）B46
- 国际标准分类号（ICS）65.120
- 实施日期2013-02-01
- 文件格式PDF
- 文本页数7页
- 文件大小318.07KB
以图片形式预览饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定分光光度法
饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定分光光度法
国家标准 GB/T28715一2012 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 分光光度法 Determinationofaeidieandneutralproteaseaetivityinfeedadditives Spetrophotometricmethod 2012-09-03发布 2013-02-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T28715一2012 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口
本标准起草单位;农业部农产品及转基因产品质量安全监督检验测试中心(杭州,浙江大学饲料科 学研究所、武汉新华扬生物有限公司
本标准主要起草人:王小、柳爱春、邹晓庭、吴琪、赵芸、朱加虹、陈小丽、周樱、谢红云
GB/T28715一2012 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 分光光度法 范围 本标准规定了饲料添加剂酸性和中性蛋白酶活力的测定方法
本标准适用于饲料添加剂酸性、中性蛋白酶产品中酶活力的测定,以及复合酶产品中中性蛋白酶活 力的测定
本标准定量限为500U/g(U/mL). 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 件
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
3 酸性、中性蛋白酶活力单位acidicandneutralproteaseactiveunit 在一定温度(40C士0.2C)和相应的pH条件下酸性蛋白酶pH3.0,中性蛋白酶plH7.2),在 1min内水解酪蛋白产生相当于14g酚基氨基酸由酪氨酸等同物表示)的酶量,为1个酶活单位
以U表示
原理 蛋白酶在一定的温度和pH条件下,水解酪蛋白底物产生含有酚基的氨基酸(如;酪氨酸色氨酸). 在碱性条件下,可将福林试剂(Folin)还原,生成钼蓝与钨蓝,其颜色的深浅与盼基氨基酸含量成正比 通过在680nm测定其吸光度,得到酶解产生的酚基氨基酸的量,进而计算蛋白酶活力
试剂和材料 除非另有说明,在分析中使用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682规定的二级水
碳酸钠溶液[e(NaCO)=0.4mol/L司 称取无水碳酸钠(Na,CO)42.4g,用水溶解并定容至1000ml. 5.2三氯乙酸溶液[c(cCl-CooH)=0.4mol/L 称取三氧乙酸5.4g,用水溶解并定容至1000mL
GB/T28715一2012 3 5. 盐酸溶液[e(IHCI)=1mol/L 取浓盐酸85mL,加水稀释并定容至1000mL即为1mol儿盐酸溶液
盐酸溶液[c(IHCI)=0.1mol/A 取100ml1mol/L盐酸溶液(5.3),定容至1000ml,即为0.1mol/L盐酸溶液 5.5复氧化钠溶液[e(NaOH)=0.5mol/L 取氢氧化钠20g,加水稀释并定容至1000ml.,即为0.5nmol/L氢氧化钠溶液
5.6福林(rolin)试剂 于2000mL磨口回流装置中加人钨酸钠(Na,wO2H.O)100.0g、钼酸钠(Na,MoO2H.O) 25.0g、水700mL,85%磷酸50mL、浓盐酸100ml
小火沸腾回流10h,取下回流冷却器,在通风橱 中加人硫酸锂(LisO,))50g,水50mL和数滴浓澳水(99%),再微沸15min,以除去多余的澳(冷却后 仍有绿色需再加澳水,再煮沸除去过量的澳),冷却后加水定容至1000mL
混匀、过滤
试剂应呈金 黄色,贮存于棕色瓶内
使用时,以1份福林(Folin)试剂与2份水混匀,制成稀福林(Folin)试剂
5.7乳酸缓冲液(plH3.0,适用于酸性蛋白酶 mL 甲液;称取10.6g乳酸(85%90%),加水稀释并定容至10001 乙液:称取16g乳酸钠(70%),加水稀释并定容至1000mL
使用溶液取4份甲液,加乙液(约1份)调整pH至3.0士0.05,此溶液在4C冰箱贮存,有效期为 3d
5.8磷酸缓冲液(pl7.2,适用于中性蛋白酶 分别称取瞬酸氢二钠(NaHPO))2.34【和磷酸二氢纳(NaHPO”2H,o)1.00g,用水溶解,用 mol/儿氢氧化钠溶液(5.5),单向调整pH至7.2士0.05,并定容至 0.1mol/L盐酸溶液(5.4)或0.5 1000mL，备用
5.91"%酪蛋白溶液 1"%酸性酪蛋白溶液(pH13.0) 5.9.1 谁确称取胳蛋白"l.00《,先用约0.5mL浓乳酸混润后,再加人乳股缓冲腋(s.7)约0ml在沸 水浴中或磁力搅拌器上边加热边搅拌直至完全溶解,冷却后,用0.1mol/1盐酸溶液(5.4)或0.5mol/几 氢氧化钠溶液(5.5),单向调整pH至3.0士0.05,并转人100ml.容量瓶中,用乳酸缓冲液(5.7)定容至 刻度
此溶液在4C冰箱贮存,有效期为3d. 5.g.21%中性酪蛋白溶液(pH7.2) 准确称取酪蛋白'1.000g,先用约0.5mL氢氧化钠溶液(5.5)湿润后,再加人磷酸缓冲液(5.8)约 80ml,在沸水浴中或磁力搅拌器上边加热边搅拌直至完全溶解,冷却后,用0.1mol/L盐酸溶液(5.4) 或0.5mol/几氢氧化钠溶液(5.5),单向调整pH至7.2士0.05,并转人100mL容量瓶中,用磷酸缓冲 液(5.8)定容至刻度
其余同5.9.1
1 标准使用的酪蛋白由药品生物制品检定所提供
给出这一信息是为了给使用者提供一个相对标准,如果 其他产品能有相同的效果,则可以使用等效产品
GB/T28715一2012 5.10L-酪氨酸标准物质 纯度>95%
5.11L-酪氨酸标准储备溶液 精确称取预先于105C干燥至恒重的L酪氨酸标准物质0.1000民用20ml1molL盐酸溶液 (5.3)溶解后,再用蒸水定容至100mL,即为1mg/mlL-酪氨酸标准储备溶液
5.12L-酪氨酸标准溶液 临用前,准确吸取10.0mL1mg/mL酪氨酸标准储备溶液(5.1l),用0.1mol/L盐酸溶液(5.4) 定容至100ml,即得到1004g/mLL-酪氨酸标准溶液
仪器与设备 除常用实验室仪器设备外,应有下述仪器设备 分光光度计;被长范围350nm一800nmn 6.2pH计;精度为0.0lpH单位
6.3分析天平;感量0.0001g和0.01g
恒温振荡水浴锅(或普通水浴锅;精度为士0.2C
6. 4 6.5秒表或定时钟
分析步骤 7.1标准曲线绘制 分别准确吸取1004g/mLL酪氨酸标准溶液0.00ml,1.00mL,2.00ml,3.00mL,4.00ml 5.00ml
和6.00ml于10mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀,制成每毫升分别含L-酪氨酸0.04g、 0.0g.30.0E.30.0g.0.0g,.50.0g和60.0的标准工作溶液
分别吸取L-酪氨酸标准工作溶液1.0ml,加5.0mL碳酸钠溶液(5.1)和1.0ml稀福林(Folin) 试剂(5.6),于具塞试管中(每个浓度做2个平行),混匀
将标准管同时置于40C水浴,反应20mn,取出,置于冷水中,迅速冷却至室温.用10mm比色M. 以空白管调仪器零点,在分光光度计波长680nm处测吸光度
以L-酪氨酸含量为横坐标,以吸光度为 纵坐标,绘制标准曲线,获得线性回归方程
回归系数(')在0.9978以上时,方可使用,否则应重做
新配制的福林(Folin)试剂应制作新的标准曲线
7.2试样制备 7.2.1液体酶试样的制备 根据样品酶活力大小,吸取适量的液体酶液,酸性蛋白酶试样用乳酸缓冲液(5.7)[中性蛋白酶试样 则用磷酸缓冲液(5.8)]稀释至酶活力约为5U/mL一20U/mL,待测
7.2.2固体酶试样的制备 将试样粉碎或充分碾碎,过孔径为0.25 筛
根据样品酶活大小,称取0.2g一2g样品,精确至 mm
GB/T28715一2012 0.001g,置于250m锥形瓶中,酸性蛋白酶试样准确加人100m乳酸缓冲液(5.7[中性蛋白酶试样 则加人磷酸缓冲液(5.8)],搅拌使试样充分混匀,30C100r/min振荡水浴(或用普通水浴锅,每5minm 搅拌1次),水浴提取30min摇匀,用中迷定性滤纸过滤
滤液用乳酸缓冲液(5.7)[中性蛋白酶试样 则用磷酸缓冲液(5.8)],稀释至酶活力约为5U/mL20U/m,推荐的样品第二次稀释倍数见表1
表1推荐样品第二次稀释的倍数 样品酶活/(U/ml或U/g <5000 5000~50000 50000~100000 >l00000 稀释倍数 0 20 50 7.3测定步骤 取三支10ml具塞试管(一支样品空白管,两支样品管,分别向三支试管中准确加人稀释好的待 测酶液各1.0mL,将试管放人40C士0.2C水浴中预热5min,向两支样品管中加人1.0mL经同样 预热的1%酪蛋白溶液(5.9),准确计时反应10min,迅速、准确地向三支试管中加人2mL0.4mol/L 三氧乙酸溶液(5.2),于样品空白管中加人1.0mL1%酪蛋白溶液(5.9)摇匀
将三支试管继续置 40C士0.2C水浴中放置10min,取出,迅速冷却至室温,并用中速定性滤纸过滤
另取三支10mL具塞试管(一支样品空白管,两支样品管),分别吸取上述相应的滤出液1.0ml加 人三支试管中,各加人5.0ml.0.4mol/1碳酸钠溶液(5.1),1.0mL稀福林(Foiln)试剂(5.6),摇匀 水浴40C士0.2C中放置20 min,取出置于冷水中,迅速冷却至室温
用水代替滤液做试剂空白,以试剂空白管调仪器零点,在分光光度计波长680nm下,用10 比 mm 色皿,分别测定样品空白管和样品管中样液的吸光度,将样品管与样品空白管吸光度之差取平均值,通 过线性回归方程求出生成的酪氨酸的浓度
结果计算与表示 8.1结果计算 样品中酸性或中性蛋白酶活力以X表示,按式(1)计算 e-eoxV×4×N X，=
1.0×m1×10 式中: 蛋白酶活力,单位为酶活单位每克(U/g)或酶活单位每毫升(U/mL); X -样品管的酪氨酸浓度,单位为微克每毫升(g/mL) -样品空白管的酪氨酸浓度,单位为微克每毫升(4g/mL); 固体酶试样提取液的总体积或液体酶试样第一次稀释总体积,单位为毫升(mL). 样品提取液第二次稀释的倍数; 酶反应体系总体积,单位为毫升mL); 参与反应的酶量,单位为毫升(mL.); 试样质量或体积,单位为克(g)或毫升(mL); 1 反应时间,单位为分钟(min) 0
GB/T28715一2012 结果表示 以平行样的平均值为最终的酶活力测定值,计算结果保留整数位
重复性 试样应至少取两份平行样进行重复测定,平行样的相对标准偏差不超过10.0%.
饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定分光光度法GB/T28715-2012
引言
饲料添加剂是现代畜牧业中广泛使用的一种辅助饲料，可提高动物对饲料的利用率，增强生长发育速度，提高产品质量等。其中，酸性、中性蛋白酶是常用的添加剂之一，其作用是通过水解蛋白质使其易于被动物消化吸收，从而提高饲料的营养价值。
为了保证饲料添加剂的质量和有效性，需要对其酶活力进行准确测定。本文将介绍一种基于分光光度法的饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力测定方法。
实验方法
本实验采用GB/T28715-2012标准中的方法进行蛋白酶活力测定，具体步骤如下：
- 制备0.1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.0），取0.605g Tris和0.703g HCl加入100ml去离子水中搅拌至溶解，再用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.0±0.1；
- 制备试样液，称取0.1g饲料添加剂样品，加入10ml 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，置于40℃水浴中反应30min；
- 制备对照液，取10ml 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液作为对照组；
- 制备底物液，称取1mg Nα-Benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide (BAPNA)，加入5ml甲醇并充分搅拌，再加入45ml0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，混合均匀后即得底物液；
- 测定样品和对照组的吸光度值，在37℃恒温箱中加入50μL底物液、100μL试样液或对照液，同时加入0.1mol/L Tris-HCl缓冲液至总体积为5ml，并在30s内混合均匀。在1min和2min时分别测量吸光度值；
- 计算酶活力，根据吸光度值计算试样液和对照液的酶活力，公式如下：
其中，ΔA表示试样液的吸光度值减去对照液的吸光度值，ε为BAPNA的摩尔消光系数，V为取样体积，t为反应时间（min）。根据计算公式可得到酸性、中性蛋白酶的活力值。
结果与分析
本实验采用分光光度法对饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力进行测定，得到了准确的酶活力值。通过比较样品和对照组的吸光度值，计算出酸性、中性蛋白酶的活力值，从而确定饲料添加剂的质量和有效性。
结论
本文介绍了一种基于分光光度法的饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力测定方法。该方法操作简便，结果准确可靠，适用于饲料添加剂蛋白酶酶活力的测定。
