GB/T15670.14-2017
农药登记毒理学试验方法第14部分：细菌回复突变试验
Toxicologicaltestmethodsforpesticidesregistration—Part14:Bacterialreversemutationtest
- 中国标准分类号（CCS）B17
- 国际标准分类号（ICS）65.100
- 实施日期2018-02-01
- 文件格式PDF
- 文本页数15页
- 文件大小1.14M
以图片形式预览农药登记毒理学试验方法第14部分：细菌回复突变试验
农药登记毒理学试验方法第14部分：细菌回复突变试验
国家标准 GB/T15670.14一2017 部分代替GB/T15670-1995 农药登记毒理学试验方法 第 14部分:细菌回复突变试验 Iosieologiealtestmethodsforpestiecidesregistration Part14:Bacterialreversemutationtest 2017-07-12发布 2018-02-01实施 中华人民共利国国家质量监督检验检疙总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T15670.14一2017 修改了剂量和分组的内容(见7.2,1995年版的14.3.4); -修改了结果判定的内容(见8.2,1995年版的14.3.8)
本部分由农业部提出并归口
本部分起草单位;农业部农药检定所
本部分主要起草人:肖杭、环飞、张丽英、陶传江
本部分所代替标准的历次版本发布情况为 GB/T156701995
GB/T15670.14一2017 农药登记毒理学试验方法 第14部分:细菌回复突变试验 范围 GB/T15670的本部分规定了细菌回复突变试验的基本原则,方法和要求
本部分适用于为农药登记而进行的细菌回复突变试验
术语和定义 2 下列术语和定义适用于本文件
2.1 回复突变试验reersemtatontest 利用一组鼠伤寒沙门氏菌和/或大肠杆菌检测引起细菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的 需要某种氨基酸的菌株(分别为组氨酸或色氨酸)成为不需要外源性供应氨基酸的菌株的突变,即是由 营养缺陷型回变到野生型
2.2 碱基置换型致突变物basepairsubstitutonmutagens 引起DNA分子中一个或多个碱基对置换的物质
在回复突变试验,此改变可能发生在细菌基因 组的原突变部位或另一个部位
2.3 移码型致突变物frameshiftmutagens 引起DNA分子增加或丢失一个或多个碱基对的物质
试验目的 检测受试物的诱变性,预测其遗传危害和潜在致癌作用的可能性
试验概述 细菌回复突变试验利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌来检测点突变,涉及DNA的一个或儿个碱基 对的置换、,插人或缺失
原理是通过观察试验菌株在缺乏所需要氨基酸的培养基上的生长情况,检测试 验菌株是否恢复合成必需氨基酸的能力,评价受试物诱发突变的能力
培养基和试剂 注:培养基成分或试剂至少应是化学纯,无诱变性
避免重复高温处理,选择适当保存温度和期限,如肉汤保存于 4C不超过6个月,其他详见下述各培养基及溶液说明
GB/T15670.14一2017 5.1营养肉汤培养基 牛肉浸膏 5 g 氯化钠 5 g 10 胰 陈 g 2.6g 磷酸氢二钾(K
HPO
3H.O) 1000mL 加蒸水至 加热溶解,调节pH至7.4,分装后0.103MPa,20min灭菌,保存期不超过6个月
5.2营养肉汤琼脂培养基 1.5g 琼脂粉 加营养肉汤培养基至 100mL 加热溶解,调节pH至7.4,0.103MPa,20min灭菌
5.3底层培养基即最低营养培养基 5.3.1Voge-Bonner(V-B)培养基 柠檬酸(CH,O;H.O 2.0g 磷酸氢二钾(K.HPO 10,0g 磷酸氢铵钠(NaNHHPO4H.O 3.5g 硫酸镁(Mgso7H.o) 0.2g 200ml 加蒸谣水至 逐个将化学物在少量蒸水中单独溶解后,硫酸镁水溶液在最后缓慢加人,加蒸水至200mL
0.103MPa,20nmin灭菌,4C保存备用
5.3.220%葡萄糖溶液 葡萄糖 20.0g 加蒸馏水至100mL,0.055MPa,20min灭菌
5.3.31.5"%底层琼脂培养基 琼脂粉 15 加蒸水至 700mL V-B培养基 200mL 20%葡萄糖溶液 100mL 首先将前两种成分于0.103MPa下高压灭菌20min后,再加人后两种成分,充分混匀倒底层平板
按每皿25mL(相对于90mm平皿)制备平板,冷凝固化后倒置于37C培养箱中24h,备用
5.4顶层培养基 5.4.1顶层琼脂 琼脂粉 3.0g 2.5g 氯化钠 500 加蒸僧水至 nml
GB/T15670.14一2017 0.103MPa,20min高压灭菌
5.4.20.5mmol/儿组氨酸-生物素溶液 12.2 D-生物素(相对分子质量244 mg 上-组氨酸(相对分子质量155) 7.8mg 或L-盐酸组氨酸(相对分子质量192) 9.6mg 加蒸水至100mL,贮于4C冰箱中 5.4.3顶层培养基制备 加热融化顶层琼脂,临用时每100mL顶层琼脂中加10mL0.,5mmol/1组氨酸-生物素溶液(大肠 杆菌则需配制0.5mmol/L色氨酸-组氨酸-生物素溶液),分装在三角烧瓶中,0.103MPa,20min灭菌
用时融化分装小试管,每管2mL,在45C水浴中保温
5.5s9辅助因子(混合液试剂)的配制 5.5.1盐溶液[1.65mol/L氯化钾(KCI)+0.4mol/L氯化镁(MgCI 6.15 氯化钾(KCI g 氯化镁(MgCl,6H.O) 4.07g 燕水 50ml 0.103MPa,20min高压灭菌或滤菌
5.5.20.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4) 磷酸氢二钠(Na;HPO)(14.2g/500mlL) 440ml mL 确酸二复钠(NaHro,H.o13.8g/50o 60mL 0.103MPa,20min高压灭菌或滤菌
辅酶-I(氧化型)溶液 5.5.3 准确称取辅酶-I,用无菌蒸溜水帝解配制成0.025molL溶液,低温保存(一20C以下). 5.5.4葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液 称取葡萄糖-6-磷酸钠盐,用无菌蒸馏水溶解配制成0.05mol/L,低温保存(一20C以下)
5.610%s9混合液配制 每10mL.由以下成分组成,临用时配制: 6.0mlL 磷酸盐缓冲液(0.2mol/LpH7.4) 0.2mL MgCl-KCl盐溶液 葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液(o.05nmol/L) 1.0ml 辅酶-l溶液(o.025nmol/L) 1.6ml 肝S9 1.0ml 无菌蒸馏水 0.2ml 混匀,置冰浴中待用
5.7 活化系统(大鼠肝s9)的诱导和制备 选健康雄性成年SD大鼠或wistar大鼠,体重200g左右
将多氯联苯(Aroelorl254或国产PCB
GB/T15670.14一2017 五氯)溶于玉米油中,按500mg/kg体重一次腹腔注射,5d后处死动物,处死前12h禁食,但可自由 饮水
苯巴比妥钠和8綦黄酮结合也可做为诱导剂,健康雄性大鼠体重200g左右,经口或腹腔注射 80mg/kg体重苯巴比妥钠和80mg/kg体重8-茶黄酮,连续3d
处死前16h停止饮食,但可自由饮 水
由于化学物质经腹腔注射,容易引起肝脏形成外膜,不易剥离,推荐使用经口灌胃的方式
处死动物后取出肝脏称重,用新鲜冰浴的0.15mol/儿氧化钾溶液连续冲洗肝脏数次,以去除抑制 微粒体酶活性的血红蛋白
每克肝(湿重)加0.15mol/L 氯化钾溶液3mlL,连同烧杯移人冰浴中,用消 毒剪刀剪碎肝脏,在玻璃匀浆器(低于4000r/min. ,往复1min2min)或组织匀浆器(20000 r/min， lmin)中制成肝匀浆
以上操作需注意无菌和局部冷环境
将制成的肝匀浆在低温(o C)高速离心机上,以9000离心10min,吸出上清液为S9组 分,分装于无菌冷冻管或安中,每安2ml左右,最好用液氮或干冰速冻后置一80C低温保存
上述全部操作均在冰水浴中和无菌条件下进行
制备肝S9所用一切手术器械、器皿等,均经灭菌 消毒
S9制备后,其活力需经诊断性诱变剂进行鉴定
S9制成后,经无菌检查,蛋白含量测定(L.owry法),每毫升蛋白含量应不超过40mg,因过量蛋白 将会抑制回复突变率,并经间接致癌物诱变剂)鉴定其生物活性合格后贮存于深低温或冰冻干燥,保存 期不超过1年
5.8特殊试剂和培养基的配制 氨节青霉素溶液(8mg/mL):称取三羚氨节青霉素80mg,加人0.02mol/L氢氧化钠溶液 5.8.1 10mL,无菌配制,保存于4C冰箱
5.8.20.1%结晶紫溶液称取结晶紫10mg,加10mL无菌水
四环素溶液(8mg/mL);称取四环素40mg,加人0.02mol/儿盐酸溶液5mL,保存于4C冰箱 5.8.3 用于四环素抗性试验和氨乍青霉素-四环素平板
5.8.4L-组氨酸溶液和0.5mmol/L.D-生物素溶液;称取L-组氨酸404.3mg和D-生物素12.2mg,分 别溶于100mL燕僧水,0.103MPa,20min灭菌,保存于4C冰箱
5.8.5氨节青霉素平板(用作TA97、TA98、TA100菌株的主平板)和氨节青霉素-四环素平板(用作 TA102菌株的主平板),每1000mL由以下成分组成: 底层培养基 980ml 组氨酸水溶液 10m 0.5mmol/L生物素 6ml 0.8%氨卡青霉素溶液 3.15mL 0.8%四环素溶液 0.25mL 四环素仅在使用对四环素有抗性的TA102时加人
以上成分均已分别灭菌或无菌制备
5.8.6组氨酸-生物素平板(组氨酸试验用),每1000mL由以下成分组成: 底层培养基 984ml 10 组氨酸水溶液 ml 0.5mmol/L生物素 6ml 以上成分均已分别灭菌
5.8.7二甲基亚碱(DMsO);:0.103MPa,20min灭菌
GB/T15670.14一2017 菌株及其鉴定与保存 6.1试验菌株 6.1.1推荐使用鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102作为四株标准测试菌株
TA97和TA98可以检测各种移码型致突变物;TAl00可检测碱基置换型致突变物;TAl02能检测出 其他测试菌株不能检出或极少检出的某些诱变剂,如甲陛、各种过氧化氢化合物和丝裂霉索C等交联 剂
一般用来测试受试物诱变性时,应通过上述四个菌株的检测
必要时可增加TA1535、TA1537 TA97a,大肠杆菌wP2uvrA或大肠杆菌wP2uvrA(PKM101)任一菌株
试验菌株的基因型和检测类 型见附录A中A.1 6.1.2 也可采用下列的菌株组合:鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TAl00、TA102和TA1535,其中 TA97可用TA97a或TA1537替换,TAl02可用大肠杆菌wP2uvrA(PKM101)或WP2uvrA替换
6.2菌株的鉴定 6.2.1应进行菌株鉴定的情况 菌株特性应符合细菌回复突变试验的要求,见A.2
突变型菌株的某些特性易丢失或变异,遇到下 列情况应鉴定菌株的基因型 在收到培养菌株后; a b 当制备一套新的冷冻保存株或冷冻干燥菌株时; 当每皿自发回变数不在正常范围时 c d)当对标准诱变剂丧失敏感性时 e 初次投人使用前
6.2.2增菌培养 在营养肉汤培养基中接种贮存菌株培养物,于37C振荡(100次/min)培养10h或静置培养16h 备用
6.2.3组氨酸缺陷型和色氨酸缺陷型的鉴定 6.2.3.1加热融化底层培养基两瓶(一瓶不加组氨酸，一瓶加组氨酸),不加组氨酸者每100ml.培养基 中加0.5 mmol/儿D-生物素0.6mL;加组氨酸者每100ml培养基中加人L-组氨酸(每100ml.中含 404.3mg)1mL和0.5mmolLD生物素0.6mL冷却至50C左右,各倒两个平皿
6.2.3.2接种:取有组氨酸和无组氨酸培养基各一皿,按菌株号顺序各取一白金耳菌液划线(直线),接 种在培养基表面,37C培养48h
6.2.3.3结果;所有菌株TA97、TA97a、TA98、TA100,TAl02、TA1535、TA1537)在有组氨酸培养基 平皿表面各长出一条菌膜,无组氨酸培养基上除自发回变菌落外无菌膜,说明受试菌株确为组氨酸缺 陷型
6.2.3.4色氨酸缺陷型的鉴定:在培养基上,倒上含有大肠杆菌wP2uvrA、大肠杆菌WP2uvrA PKMl01)的顶层培养基,再加极微量的结晶-L色氨酸,置37C培养12h一24h后观察结果
在加色 氨酸的区域生长,可见一白色圆形菌昔,表明其对色氨酸的依赖 6.2.4脂多糖屏障缺陷型的鉴定 6.2.4.1加热营养肉汤琼脂培养基
GB/T15670.14一2017 6.2.4.2接种;取菌液0.1ml
移人平,迅速将营养肉汤琼脂培养基(50C)适量倒人平皿.,混匀,平放 凝固
将无菌滤纸一片放人已凝固的培养基平皿中央,用移液器在滤纸片上滴加0.1%结晶紫溶液 10L,37C培养24h,每菌做一个平皿
6.2.4.3结果;阳性者在滤纸周围出现一个透明的抑制带,说明存在rfa(深粗型)突变
这种变化引起 某些大分子物质进人细菌体内并抑制其生长
TA97、TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535和 TA1537均有抑制带,野生型鼠伤寒沙门氏菌没有抑制带
6.2.5R因子的鉴定 6.2.5.1加热营养肉汤琼脂培养基,冷却至50C左右,适量倒人平皿中,平放凝固,用移液器吸0.8%氨 芹青霉素10L,在凝固的培养基表面沿中线涂成一条带,待氨节青霉素溶液干后,用接种环与氨乍青 霉素带相交叉划线接种要鉴定的菌株,并且接种一个不具有R因子的菌株作为氨青霉素抗性的对照 个平皿可同时鉴定几个菌株),37C培养24h
6.2.5.2结果;菌株TA97、TA97a、TA98、TA100、TA102和大肠杆菌wP2uvrA(PKM101)经过24h 培养,在氨节青霉素带的周围依然生长不受抑制,即有抗氨节青霉素效应,证明它们带有R因子
6.2.6四环素抗性的鉴定 6.2.6.1用移液器各吸5AL10AL.0.8%四环素溶液和0.8%氨节青霉素溶液,在营养肉汤琼脂培养 基平皿表面依中线涂成一条带,待四环素和氨节青霉素干后,用接种环与四环素和氨节青霉素带相交叉 划线接种TA102和一种有R因子的菌株(作四环素抗性的对照),37C培养24h 6.2.6.2结果:TA102菌株生长不受抑制,对照菌株有一段生长抑制区,表明TA102菌株有抗四环素 效应,其他菌株均无四环素抗性
6.2.7uvrB修复缺陷型的鉴定 在营养肉汤琼脂培养基表面用接种环划线接种需要的菌株
6.2.7.1 6.2.7.2接种后的平皿一半用黑纸覆盖,在距15w紫外线灭菌灯33cm处照射8s,37C培养24h 6.2.7.3结果:对紫外线敏感的菌株(TA97、TA97a、TA98、TA100、TA1535、TA1537和wP2uvrA)仅 在没有照射的一半生长,具有野生型切除修复酶的菌株TA102仍能生长
自发回变率的测定 6.2.8 6.2.8.1准备底层培养基平皿
6.2.8.2融化顶层培养基,每管2mL,在45C水浴中保温
6.2.8.3在每管顶层培养基中分别加人待鉴定的测试菌株的菌液0.1ml,每株两份,轻轻摇匀,迅速将 此试管中的内容物倾人已固化的底层培养平皿中,转动平皿,使顶层培养基均匀分布,平放固化,37C 培养48h计数菌落数
6.2.8.4结果;每一株的自发回变率应落在正常范围内
6.3菌株保存 鉴定合格的菌种应保存在深低温(如-80C)或加人9%色谱级二甲基亚碱作为冷冻保护剂,液氮 条件下(-196C),或者冷冻干燥制成干粉.4C保存
除液氮条件外，一般不超过两年,主平板贮存在 4C,2个月后丢弃,TA102主平板2周应该丢弃
GB/T15670.14一2017 试验方法 7.1受试物配制 受试物的溶剂首选无菌双蒸水.,不溶于水的或水溶性低的受试物,首选二甲基亚碱(每平皿加人二 甲基亚碱的量不得超过0.4mL),选用其他溶剂须说明理由
7.2剂量与分组 7.2.1剂量设计原则 对可溶性无细菌毒性的受试物,推荐的最高试验剂量是5mg/皿或5AL/;否则,受试物最高剂 量应为细菌毒性的剂量或出现沉淀,沉淀不应干扰菌落计数
最低剂量可考虑为0.1lg/皿
评价含有 潜在致突变杂质的受试物时,试验剂量可高于5mg/皿或5L/I
每一受试物至少设5个剂量组,可 按0.5g/皿一50004g/皿剂量设定,也可根据预试验结果按等比组距设定需要的浓度范围
7.2.2对照组设定 每次试验都应包括同时进行的有或无代谢活化的菌株特异性阳性对照和阴性(溶剂)对照组
7.2.2.1 阳性对照应选择适当的剂量,以证实每次试验的有效性
7.2.2.2阳性对照物根据菌株的类型选择,见附录B. 7.2.2.3试验应包括阴性(溶剂)对照组,阴性对照组的处理方法除无受试物外其他处理与剂量组相同
试验也应包括空白对照组,除非历史资料证实所选择的溶剂无毒性或无致突变作用
7.3试验方法 注包括平板掺人法、预培养平板掺人法及点试法
7.3.1平板掺入法 增菌培养;将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内,37C振荡(100次/min) 培养10h至对数增长期,每毫升不少于1×10'个活菌数,培养瓶可用黑纸包裹,以防光线照射细菌
底层培养基平皿,每个剂量加S9及不加S9均做3皿
融化顶层培养基分装于无菌小试管,每管2mL,在45C水浴中保温
在保温的顶层培养基中依次加人测试菌株新鲜增菌液0.1ml,然后加0.1ml受试物和0.5mL灭 菌缓冲液(需活化时则加人10%S9混合液0.5mlL),再混匀,迅速倾人底层培养基上,转动平皿使顶层 培养基均匀分布在底层上,平放固化,37C培养48h观察结果
7.3.2预培养平板掺入法 预培养对某些受试物可取得较好效果,因此可根据情况确定是否进行预培养
在加人顶层琼脂前 先进行以下预培养步骤;在试验中,将受试物0.1ml(需活化时另加人10%S9混合液0.5mL)和菌液 0. ml,在37C培养20min,或在30C中培养301 min 1,然后再加2mL顶层琼脂,其他同上述平板掺 人法 7.3.3点试法 增菌培养;将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内,37C振荡(100次/min 培养10h至对数增长期,每毫升不少于1x10个活菌数,培养瓶可用黑纸包裹.以防光线照射细菌 底层培养基平m,每个剂量加S9及不加S9均做3皿
融化顶层培养基分装于无菌小试管,每管2mL,在45C水浴中保温
GB/T15670.14一2017 在水浴中保温的顶层培养基中加人测试菌株增菌液0.1mL(需活化时另加人10%S9混合液 0.5ml),混匀,迅速倾人底层培养基上,转动平皿,使顶层培养基在底层上均匀分布
平放固化后取无 菌滤纸圆片(直径6" ),小心放在已固化的顶层培养基的适当位置上,用移液器取适量受试物(如 mm 10AL)点在纸片上,或将少量固体受试物结晶加到纸片或琼脂表面,37C培养48h观察结果
8 试验结果和评价 8.1试验结果 应报告受试物各剂量组、阳性对照组、阴性溶剂)对照组、空白对照组的各个平板回变菌落数,均数 及标准差
8.2试验结果的评价 8.2.1以直接计数培养基上回变菌落数的多少而定
如在背景生长良好条件下,测试菌株TA1535、 TAl537及大肠杆菌的受试物组回变菌落数等于或大于阴性对照组的平均数值的3倍,其他测试菌株 的受试物组回变菌落数等于或大于2倍阴性对照组回变菌落数,并有剂量-反应关系,可判定为阳性结 果;若某一测试点菌落数增加是可重复的并有统计学意义的结果,也可判定为该受试物诱变试验阳性
8.2.2阳性结果不要求证实,可疑的结果应进行证实试验,阴性结果需要进行证实试验
如果认为阴 性结果不需要进行证实试验,应提供依据
进行证实试验时应考虑改变研究参数,如剂量间距、试验方 法(平板掺人法或预培养平板掺人法)和代谢活化条件等
8.2.3如在受试物点样纸片周围长出较密集的回变菌落,与空白对照相比有明显区别者,可初步判定 该受试物诱变试验阳性,但应该用掺人法试验来确证
8.2.4细菌回复突变试验的阳性结果表明受试物对鼠伤寒沙门氏菌和(或)大肠杆菌的基因组诱发了 点突变
阴性结果表明,在试验条件下,受试物对测试菌株不诱发基因突变
试验报告 9 试验报告至少应包括以下内容 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号; a 试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况 b 试验开始和结束日期、试验项目负责人,试验单位技术负责人、签发日期; c 试验摘要 d 受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号(CAs号)(如已知)、代码(如有、纯度(或含量) e 剂型,生产日期(批号),理化性质,配制所用溶剂和方法; 选择的试验菌株名称,菌株特性; f 剂量和组别,包括选择剂量的原则或依据,剂量和组别 日 h 试验条件和方法,包括主要仪器设备、细菌染毒途径,染毒方案代谢活化系统及所用诱导剂、 试验方法,操作步骤、阳性对照物名称等; D 试验结果:;以文字描述和表格逐项进行汇总,样品对测试菌株的毒性、平皿上是否有沉淀、各剂 量组回变菌落数的均数和标准差、同时进行的阴性和阳性对照组结果,同一受试物应包括活化 和非活化的试验结果,剂量单位为4g/皿,特殊例外; 试验结论:给出受试物在试验条件下是否有致突变作用的结论,必要时对有关问题进行讨论 j k)原始记录保存情况的说明
GB/T15670.14一2017 录 附 A 规范性附录 试验菌株的基因型、检测类型及鉴定标准 试验菌株的基因型和检测类型 A.1 试验菌株的基因型和检测类型见表A.1
表A.1试验菌株的基因型和检测类型 菌株 组氨酸突变部位 突变类型 其他基因标志 检测类型 hisD6610 fla,AvrB,pKM101 TA97 CCC区域十4 移码突变 TA97a hisD661o ccc区域十4 rfa,AuvrB,pKM101 移码突变 TA98 hisD3052 rfa,AuvrB,pkKM101 CG区域一1 移码突变 碱基置换(主要检测攻 TAl00 hisG46 AT-GC rla,AuvrB,pKM101 击G;C碱基的化学 物),部分移码突变 碱基置换主要检测攻 TA102 his(G428 Gc-AT fh,K.won 击A;T碱基的化 兴 物,部分移码突变 碱基置换(主要检测攻 TA1535 hisG46 AT-GC rfa,AuvrB 击G:C碱基的化学 物),部分移码突变 hisC3076 CC区域+1 rla,AuvrB TA1537 移码突变 A.2试验菌株鉴定的判断标准 试验菌株鉴定的判断标准见表A.2
GB/T15670.14一2017 表A.2试验菌株鉴定的判断标准 脂多糖屏障R因子(氨节urB切除修复 菌株 氨基酸缺陷" 四环素抗性" 缺损 青霉素抗性" 缺损" TA97 TA97a TA98 TAl00 TAl02 TA1535 TA1537 E.coliwP2uvrA E.coliwP2uvrA(pKM101 E.coliwP2(pkM101 氨基酸缺陷;“十"表示需要氨基酸
脂多糖屏障缺损;“+”表示抑制带
R因子(氨芋青霉素抗性);“”表示具有R因子,“一-”表示不具有R因子
urB切除修复缺损“十”表示无修复能力,“-"表示有修复能力
四环素抗性;"“+"表示具有四环素抗性,“-”表示不具有四环素抗性
0
GB/T15670.14一2017 附录 B 规范性附录) 诱变剂的选择及试验结果 B.1推荐用于点试和掺入平板的诱变剂 推荐用于点试和掺人平板的诱变剂见表B.1
表B.1推荐用于点试和掺入平板的诱变剂 方法 S9 TA97 TA98 TAl00 TAl02 敌克松 敌克松 叠氮钠 敌克松 点试 2-氨基劫 2-氨基芬 2-氨基坊 敌克松 叠氮纳 敌克松 敌克松 2-氨基苟 2-氨基勿 2-氮基勿 注:“十”表示加人S9,“一”表示未加人S9
B.2诱变剂在点试中的试验结果 诱变剂在点试中的试验结果见表B.2
表B.2诱变剂在点试中的试验结果 剂量 S9 诱变剂 TA97a TA98 TAl00 TA102 N 4g 柔毛霉素 5.0 叠氮钠 .0 十十十十 十十十十 1CR-191 1.0 丝裂霉素C 2.5 nh nh Inh 2,4,7-三硝基坊铜 0.l + 十十十 4硝基-磷-苯撑二胺 20.0 十十 +十十 -硝基咋啾-N-氧化物 10.0 + x 十十 十十 十十 甲基碱酸甲酯 2.0(Al 十十 +++ 敌克松 50.0 十十十十 ++十 2-氨基坊 20.0 +十 + 十十 黄曲霉毒素B1 1.0 甲基硝基亚硝基肌 2.0 十十十 注每M回变菌落数(扣除自发回变)的符号一表示一20;十表示20- -100;十十表示100~200;十十十表示 200500;十十十十表示>500
柔毛霉素和叠氮钠溶解在水中,其他所有化合物溶解在DMSO中
用PCB 诱导的大鼠S9(20L/m)活化2-氨基坊
柔毛霉素在点试中产生最低效应,应作平板掺人试验
ICR-191 指2-甲氧基-6氧代-9-[3-(2-氧乙基)氨基丙胺]吓唁2盐酸;Inh指因诱变剂毒性引起的生长抑制
GB/T15670.14一2017 B.3诱变剂在平板掺入中的测试结果 诱变剂在平板掺人中的测试结果见表B.3 表B.3诱变剂在平板掺入中的测试结果 每皿回变菌落数 剂量 诱变剂 S9 4g/皿 TA97a TA98 TA100 TA102 47 124 3123 592 柔毛霉素 6.0 叠氮钠 1.5 76 3000 186 CR-191 1.0 640 63 185 链黑霉素 0.25 Inh Inh Inh 2230 丝裂霉素C 0.5 lnh Inh lnh nh 2.4.7-三硝基劳铜 0.2 8377 8244 400 16 216o 599 798 4硝基-磷-苯撑二胶 20.0 528 292 4220 287 4硝基咋琳-N-氧化物 甲基碱酸甲醋 1.0(L 174 23 2730 6586 敌克松 50.o 2688 1198 183 895 2-氨基坊 10.0 1742 6194 3026 261 苯并[]芭 1.0 337 143 936 255 注:所列数值代表his十回变菌落数值,取自剂量-反应的线性部分,对照值已扣除,用PCB诱导的大鼠肝S9 20Lm)活化2氨基坊,苯并[a]茫
Inh;指链黑霉素在无毒性范围(小于0.25g)内没有检出诱变性， 每0,0054g在TAl00引起的回变菌落数小于70;丝裂霉素对uvrB菌株是致命的
农药登记毒理学试验方法第14部分：细菌回复突变试验GB/T15670.14-2017
细菌回复突变试验是通过观察细菌在不同浓度的化合物下的生长情况，来评估该化合物对基因突变的诱发作用。这个试验可以检测到可能存在的致癌、致突变等潜在危险。
细菌回复突变试验被广泛应用于农药登记的毒理学评价中。GB/T15670.14-2017是我国颁布的农药登记毒理学试验方法标准，其中就包括了细菌回复突变试验方法。
该试验要求使用一种特殊的细菌品系，通常是沙门氏菌或者大肠杆菌。在试验中，将该细菌品系分别接种于含有不同浓度化合物的琼脂平板上，观察其生长情况，并计算出最大耐受浓度(MTC)和最小致突变浓度(MEC)等参数。通过这些参数可以评估化合物对基因突变的诱导作用，从而判断其潜在危险性。
需要注意的是，细菌回复突变试验只是毒理学评价中的一个环节，其结果仅为初步筛查。在后续的评价过程中，还需进行动物实验、人体暴露评价等更为全面的评价，以确保农药的安全性。
