水中微囊藻毒素的测定

水中微囊藻毒素的测定

国家标准 GB/T20466一2006 水中微囊藻毒素的测定 Determinationofmicroeystinsinwater 2007-01-01实施 2006-08-24发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T20466一2006 水中微囊藻毒素的测定 范围 本标准规定了高效液相色谱法和间接竞争酶联免疫吸附法测定水中微囊藻毒素(环状七肽)的条件 和详细分析步骤 本标准适用于饮用水,湖泊水、河水,地表水中微囊藻毒素的测定 样品中微囊藻毒素的检出限;高效液相色谱法和酶联免疫吸附法均为0.14g/L 微囊藻毒素的分子式,分子质量及结构式 2.1分子式 微囊藻毒素-RR(MC-RR):C;HNOe,微囊藻毒素-YR(MC-YR):CaHNO,微囊藻毒素- LR(MCLR):CHNO 2.2分子质量 MC-RR1038.2，McYR;1044.0，MC-LR:994.5 结构式 D.Glu CH COOH Mdha CH ADD OCH CH D-Ala H aHC iiR CoOH DMeAsp MCRR、,MC-YR、MC-LR中的R和R，见表1 表1C-RR,McC-YR、C-LR中的R和R 微囊藻毒素名称 R R MCRR L-Arg l-Arg MC-YR l-Tyr l-Arg MCLR LL.eu l-Arg 高效液相色谱法 方法提要 微粪藻毒素在波长238nm下有特异的吸收峰 不同的微粪藻毒素异构体在高效液相色谱中有不 同的保留时间,与标准微囊藻毒素的保留时间相比较,可确定样品中微囊藻毒素的组成 依据出峰面 积,计算水样中微囊藻毒素的含量 试剂和溶液 3. 2 除非另有规定,仅使用分析纯试剂、蒸馏水或去离子水
GB/T20466一2006 3.2.1甲醇;色谱纯 3.2.220%(体积分数)甲醉醇溶液;20m甲醉(3.2.1)与80mL水混合 3.2.350%体积分数)甲醇溶液50mL甲醇(3.2.1)与50ml.水混合 3.2.4磷酸二氢钾溶液(0.05mol/L);称取0.68g磷酸二氢钾,用水溶解,定容至100mL 3.2.520%(体积分数)磷酸溶液;20mL磷酸与80ml水混合 .2.6三第乙酸cTF;色请纯 3.2.7磷酸盐缓冲溶液,用20%(体积分数)磷酸溶液(3.2.5)将磷酸二氢钾溶液(3.2.4)调至pH3.0. 3.2.8淋洗溶液;10mL水;10mL20%(体积分数)甲醇溶液(3.2.2). 3.2.9洗脱游液(酸化甲醉溶液),用甲醇(3.2.I)将0.1ml三氟乙酸(3.2.6)定容至100nL 3.2.10微囊藻毒素标准品;微囊藻毒素-L.R(MCLR),微囊藻毒素-RR(MCRR)、微囊藻毒素-YR MC-YR),纯度不低于95% 微囊藻毒素标准储备液;分别称取微囊藻毒素标准品(3.2.10)MCLR.MC-RR、MC-YR各 3.2.11 L甲醉(3.2.1)溶解,再用纯水定容至50 0.5mg(按实际含量折算),用500 mL,一20C保存 此标准 储备溶液的浓度约为104g/ml 标准系列溶液,用20%体积分数)甲醉(3.2.2)将微囊藻毒素标准储备溶液(3.2.11)分别稀 12 释至约0.00 /ml,0,1 1/'al.02l.0 /l.l/'l.醒/mLS/l.10we/mL(临 4g 用时配制 3.3仪器和设备 3.3.1不锈钢筛500目 3.3.2不锈钢或玻璃杯式滤器.250mL 3.3.3抽滤瓶,带真空系 3.3.4谁膜.GF/C玻璃纤维谴膜和0.5pm乙酸纤维醋谴膜 3.3.5C固相萃取小柱:Seppak柱，500mg/6m 3.3.650ml玻璃注射器、100ml玻璃注射器或sPE固相萃取装置 3.3.7旋转燕发器或吹氮浓缩器 3.3.8涡旋混合器 3.3.9高效液相色谱仪;配有紫外可见光检测器 3.3.10色谱柱;C反相柱,柱长250mm,内径4.6mm,填料粒经5Am 3.4分析步骤 3. .4.1水样的采集和保存 用采水器采集1500ml一2000ml水样(水样采集后,应在4h内完成以下前处理步骤) 用 00目的不锈钢筛(3.3.1)过滤,除去水样中大部分浮游生物和悬浮物 取过滤后的水样1200ml于 玻璃杯式滤器(3.3.2)中,依次经滤膜(3.3.4)减压过滤 准确量取1000mL滤液置于棕色试剂瓶中 注:如减压过滤后的水样不能立即分析,可置于玻璃容器中,在一20C保存,30d内分析完毕 水样的富集和洗脱 3.4 2 C.,固相萃取小柱(3.3.5)预活化 3.4.2.1 用玻璃注射器吸取10mL甲醉(3.2.1)注人C固相萃取小柱(自然滴下) 当甲醉液面接近小柱 上层饰片时,加人10ml一15ml纯水活化(活化过程,不应使c,固相草取小桂变干,萃取小柱中应始 终充满液体) 连接50mL或100mL玻璃注射器,或连接SPE固相萃取装置(3.3.6) 微囊藻毒素的富集和洗脱 3.4.2. 2 将1000mL.水样滤液(3.4.1)依次注人50mL玻璃注射器、100mL玻璃注射器或sPE固相萃取 中,使水样滤液流经预先活化的c固相摹取小柱(3. 4.2.1)进行富集(控制流速为 装置3.3.6 8mL/min~10mL/min) 富集完毕,依次用淋洗溶液(3.2.8)淋洗C固相萃取小柱 再用10mL洗
GB/T20466一2006 脱溶液(3.2.9)洗脱微囊藻毒素(萃取过程,不应使C固相萃取小柱变干,萃取小柱中应始终充满液 体) 洗脱液收集在玻璃容器中 保留富集后的水样,用于再次富集 3.4.2.3再次富集和洗脱 按3.4.2.2的操作步骤,再次富集、洗脱 注:有条件的实验室可选择较大柱容量的C固相萃取小柱,只需对水样富集、洗脱一次 3.4.3定容 将两次洗脱液混合,在40c下用旋转蒸发器或吹氮浓缩器(3.3.7)浓缩至干 用1nnmL甲醇 3.2.1)分两次(第一次、第二次各0.5mL)溶解浓缩至干的物质,用涡旋混合器(3.3.8)充分涡旋混合 lnmin 用尖嘴吸管取出,小股氮气流吹干(或离心干燥),加50%体积分数)甲醉溶液(3.2.3)定容至 00AL 此步骤均应在玻璃容器中操作 3. .4.4测定 3.4.4.1色谱条件 色谱柱温度:40C; 流动相:甲醉(3.2.1)与磷酸盐缓冲溶液(3.2.7)按体积比57;43)混合 流速:lmL/min; 检测器;紫外可见光检测器波长238nm 3.4.4.2定量 用进样器分别吸取10L标准系列溶液(3.2.12),注人高效液相色谱仪(3.3.9) 在上述色谱条件 3.4.4.1)下测定标准系列溶液的响应峰面积 以响应峰面积为纵坐标,标准系列溶液的浓度为横坐 标,绘制标准曲线或计算回归方程 吸取10试样(3.4.3)注人液相色谱仪,在上述色谱条件(3.4.4.1)下测定试样的响应峰面积(应 在仪器检测的线性范围内) 依据测定的响应峰面积,在标准曲线上查出(或用回归方程计算出)水样中 微囊藻毒素的含量 在上述色谱条件(3.4.4.1)下,MC-RR,MC-YR.MC-LR的保留时间分别约为8.8min9.5min、 0.6min. 在上述色谱条件(3.4.4.1)下,标样及水样中微囊藻毒素的色谱图见图1和图2. 0.014 0.012 0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 minn 图1微囊藻毒素(MC-RR、MC-YR、MC-LR)标样色谱图
GB/T20466一2006 0.080 0.070 0.060 0.050 a.040 0.030 0.020 0.010 0.000 0.010 2.00 4.00 6.00 8.00 10.0o 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 min 图2水样微囊藻毒素色谱图 3.5结果计算 水样中微囊藻毒索的含量(x)以s/儿表示,拨式()计算 ×V x，= 式中 X 分别代表MCRR,MC-YR,MC-LR的浓度,单位为微克每升(4g/L); 从标准曲线上查出的微囊藻毒素(MCRR.Mc-YR.McLR)的含量,单位为微克每毫升 g/'mL) 水样定容体积数,单位为毫升(mL) -采集水样的体积数值,单位为毫升(mL) 计算结果应表示到小数点后两位 3.6允许差 同一水样,两次平行测定结果之差,不得超过平均值的10% 间接竞争酶联免疫吸附法 4.1方法提要 水中的微囊毒素经离心或过滤处理后与一定量的特异性抗体反应,多余的游离抗体则与酶标板内 的包被抗原结合 加人酶标记物和底物显色,与标准微囊藻毒素比较,计算水样中微囊藻毒素的含量 4.2试剂 除非另有规定,仅使用分析纯试剂、燕馏水或去离子水 4.2.1抗微囊藻毒素(MC-LR)的单克隆抗体;杂交瘤技术制备,经亲和层析纯化. 4.2.2人工抗原:MC-LR-牛血清白蛋白结合物(MC-LR-BSA 4.2.320%(体积分数)乙醇溶液;20mL乙醇与80mL水混合 .24标准稀释液称取0.0a《明胶相o.1《叠氮化的,用水游解,定容至10ml 4.2.5微囊藻毒素(MCLR)标准系列溶液;称取适量微囊藻毒素MC-LR)标准品(3.2.10),用20% 体积分数)乙醇溶液(4.2.3)配制成MC-LR含量为0.5mg/mL的溶液 再用标准稀释液(4.2.4)稀
GB/T20466一2006 释至MC-ILR含量为104g/mL的溶液 继续配制MC-IR含量分别为0.1g/L0.2g/L0.5g/L、 lg/L24g/几的标准系列溶液 4.2.6牛血清白蛋白(BsA);生化试剂 4.2.7酶标二抗;辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠lgG 4.2.8磷酸盐缓冲溶液pHH7 4):分别称取0 2g磷酸氢二钾、2.9 g磷酸氢二钠 居飘化纳.0.2层飘化娜,混合,用水游解,定容至100mL. Na,HPO12H.O)8.0 4.2.9乙酸钠溶液(0.1mol/L)称取1.36g三水合乙酸钠,用水溶解,定容至100mL 4.2. 10 乙酸溶液(1mol/L);量取5.88mL冰乙酸,加水定容至100mL 硫酸溶液(1mol/L);量取55.6mL浓硫酸，沿玻棒缓缓注人约200mL.水中,搅拌,冷却至室 温,加水定容至1000mL 12包被溶液:称取1mg人工抗原(4.2.2),溶解于1000mL磷酸盐缓冲溶液(4.2.8)中 4.2. 13 封闭溶液;称取0.5g明胶,加少量磷酸盐缓冲溶液(4.2.8),加热溶解,冷却后定容至1000mL 4.2.14洗涤溶液(PBS-T):量取0.5ml吐温-20,用磷酸盐缓冲溶液(4.2.8)定容至1000ml 4.2. 15 抗体稀释溶液;称取0.5明胶,加少量洗涤溶液(4.2.14),加热溶解,冷却后定容至1000ml 4.2. 二抗溶液1体积抗体稀释溶液(4.2.15)与5000体积酶标二抗(4.2.7)混合 16 4.2.17底物缓冲溶液;用乙酸溶液(4.2.10)调整乙酸钠溶液(4.2.9)的pH为5.0. 4.2.18底物储备溶液;称取10mg四甲基联苯胺(TMB),溶于1mL二甲基亚硕(DMsO)中 9 底物溶液;量取100aL底物储备溶液(4.2.18),加2l30%过氧化氢和10m底物缓冲溶 液(4.2.17) 临用时配制 4.3仪器 4.3.1不锈钢筛.500目 4.3.2高速离心机 4.3.3电动振荡器 4.3.4酶标仪;内置450nm滤光片 4.3.5培养箱可控温度,37C 4.3.6酶标微孔板96孔 4.3.7微量加样器及配套吸头 分析步骤 4.4.1水样的采集和保存 可按4.4.1.1或4.4.1.2操作 4.4.1.1采集约5mL水样,用500目的不锈钢筛(3.3.1)过滤于玻璃杯式滤器(3.3.2)中(除去水样 中大部分浮游生物和悬浮物),再经滤膜(3.3.4)减压过滤,保留滤液 采集约5m水样,用500目的不锈钢筛(3.3.1)过滤(除去水样中大部分浮游生物和悬浮 4.4.1. m.取上请液保留 物),取1ml滤液置于离心管中,用高速离心机离心(9000r/min)3min 注，如减压过滤或离心后的水样不能立即分析,可置于玻璃容器中,在一20C保存,30d内分析完毕 44.2测定 4.4.2.1包被酶标微孔板 将包被溶液(4.2.12)加人酶标微孔板(100L/孔),4C下放置过夜 封闭酶标微孔板 2 4.4.2. 用洗涤液(4.2.14)洗涤3次放置过夜的酶标微孔板(每次洗涤3min),加人封闭溶液(4.2.13)封 闭酶标微孔板(200L/孔),37C下放置2h,或4C下放置过夜 4.4.2.3抗原抗体反应 以下操作同时进行 量取500l抗微囊藻毒素(MCLR)的单克隆抗体(4.2.1)和500L微囊藻毒素标准系列溶 a 液(4.2.5中的0.14g/L溶液)于1.5mL试管中,混合后用电动振荡器(4.3.3)振荡,室温静
GB/T20466一2006 置30min 按以上操作配制其余反应液 这些反应液用于制作微囊藻毒素标准抑制曲线 b量取500AL抗微囊澡毒素(MCLR)的单克隆抗体(.2.1)相500AL水样(4)于1.5nmil 试管中,混合后用电动振荡器(4.3.3)振荡,室温静置30min 此反应液用于测定水样中微囊 藻毒素的含量 4.4.2.4竟争反应 用洗涤液(4.2.14)洗涤3次封闭过的酶标微孔板每次洗涤3min),滴加抗原抗体反应溶液 4.4.2.3)(100L/孔) 不同浓度做两次平行试验 37C或室温放置90nmin 在酶标微孔板的适当 孔位滴加抗体稀释溶液(4.2.15),作为阴性对照 4.4.2.5二抗溶液与抗微囊藻毒素(MCLR)的单克隆抗体反应 用洗涤液(4.2.14)洗涤3次竟争反应后的酶标微孔板(每次洗涤3min),滴加二抗溶液(4.2.16) 100L/孔),37C或室温放置30min 4.4.2.6显色及显色后吸光度的确定 用洗涤液(4.2.14)洗涤5次经4 4.2.5反应的酶标微孔板(每次洗涤3mim) 滴加底物溶液 L/孔)37C或室阖放嚣15min一20mn，显色 滴加1mdl/L硫酸(4.2.11) 4.2.19)(100 50L/孔),终止显色反应 30nmin内,用酶标仪(4.3.4)在450nm处,测定显色后的吸光度 4.4.2.7定量 取经4.4.2.6测定的标准系列溶液的吸光度平均值与水样吸光度平均值,按式(2)分别计算标准系 列溶液吸光度(或水样吸光度)与阴性对照试验的比值(XY.),其数值以%表示 x=oR D×100 式中 X -标准系列溶液吸光度(或水样吸光度)与阴性对照试验的比值,% OD -标准系列溶液的吸光度平均值与水样吸光度平均值; 水样吸光度平均值 OD. 以X，为纵坐标,不同标准系列溶液浓度的对数为横坐标,绘制标准曲线或计算回归方程 依据测 定水样的吸光度,在标准曲线上查出或用回归方程计算出)样品中微囊藻毒素的含量 4.5结果计算 水样中微粪藻毒素的含量(x,)以g几.表示,按式(3)计算 X，=c，×V 式中 X水样中微囊藻毒素的含量,单位为微克每升(ug/L); e---从标准曲线上查出的微囊藻毒素含量,单位为微克每升(4g/L); 水样的稀释倍数 V， 计算结果应表示到小数点后两位 4.6允许差 同一水样,两次平行测定结果之差,不得超过平均值的10% 测定结果的保证与控制 每一测定批次,应使用已知量的样品做测定结果的控制试验
GB/T20466一2006 参考文献 高效液相色谱法 [1]L.awtonL.A.，EdwardsC.,CoddG.A Extractionandhighperformanceliquidchromato graphicmethodforthedeterminationofmieroeystinsinrawandtreatedwaters Analyst 1994,119(7):1525-1530. [2]IkawaM. PhillpsN.，HaneyJ.F.,etal InterferenrceeyplastiesadiivesintheHPL determinationofmieroeystin-LRand-YR.Toxicon，1999，37(6):923-929. [[3]RamananS.，Tar angJ..velayudhanA lIolation.andpreparativepurifieationofmicroeystin ChromatogrA,2000,883(1):103-112 variants 间接竞争酶联免疫吸附法 rmmetrieprotenphosphataseinhiition.assay" [1]AnJ.,Carmichaelw.w.Useofacolor "anden- of andnodularins Toxicon， linkedimmunosorbentassayforthe zyme study microcystins 1994，32:l1495-1507 Rivasseau RacaudP. DeguinA.，etal EvaluationofanELISAKitfortheMonito [[2] stins(CyanobacterialToxins)inwaterandAlgaeEanvironmentalSamples ofMieroeyst ring Environ.Sei.Technol.,1999，339):1520-l527 Kirsti E JaanaK etal DetectionofMicro with [3]JarkkoR. ocystins protelinphosphatase inibitionassay，high=performance y-UVdetectionandenzyme-linked liquidchromatogFphy immunosorbentassaycomparisonofmethodsAnalyticaChimieaActa，2002，466 213-231