国家标准 GB/T36871一2018 猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重RI-PCR检测方法 MultiplexRT-PCRtodetecporeinetransmissiblegastroenteritis virus poreineepidemicdiarrheavirusandporeinerotavirus 2018-09-17发布 2019-04-01实施国家市场监督管理总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/36871一2018 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由农业农村部提出本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口本标准起草单位:华中农业大学、动物卫生与流行病学中心本标准主要起草人;何启盖、库旭钢、张坤、陈芳洲、范盛先,孟宪荣、陈品、姜雯、陈焕春
GB/36871?2018 ?θ??к ?RT-PCR? Χ ?涨?θ?(porcinetransmissiblegastroenteritisvirusTGEV) ?к(poreineepidemicdiarrheavirusPEDV)?(poreinerotavirusPoRV)? RT-PCR? ??θ??к??? 2 ?? TGEv;?θ?(porcinetransmissiblegastroenteritisvirus) PEDV:?к(poreineepidemicdiarrheavirus) PoRV;?(poreinerotavirus) RT-PCR;??-????(reversetranseriptionpolymerasechainreaction) PBs;λ?(phosphatebufersaline) s-acetate-ethylenediaminetetraaceticacidbuffer TAE??(tris7 TCID;??mediantissuecultureinfeetivedose) RNA;?(ribonucleicacid) DE:PC;?(diethylpyrocarbonate) ?豸 й涨,???RNA???RNA?? 3.1 3.1.1?? 3.1.2?? 3.1.3??в 3.1.4rCR? 3.1.5???? 3.1.6?? 3.1.7?? 3.1.8 C8C? 2 3.1.9 20C? 3.1.10??(0.5AL~10AL10AL?50L20L?200AL100AL~1000L?) 3.2? 3.2.1?,±档
GB/T36871一2018 3.2.2PBS(见附录A),常温保存 3.2.31×TAE(见附录A),常温保存 3.2.4Trizol. l,4C8C保存 3.2.5异丙醇,4C8C保存 3.2.6DNA分子量标准,4C8C保存 3.2.7DEPC处理水(见附录A),4C8C保存 3.2.8阳性对照(PEDV、TGEV和PoRV分别经Vero细胞、PK-15细胞和MA-104细胞传代,病毒含量分别为25TCIDm/mL,50TCID.n/mL,50TCID/mL),-20C保存 3.2.9阴性对照(Vero细胞、PK-15细胞和MA-104细胞悬液),-20C保存 3.2.10RNA反转试剂盒，一20C保存 3.2.11多重RT-PCR方法中使用的各种引物对见附录B) 引物干粉及稀释引物保存于一20C 3.3耗材 3.3.1Eppendorf(EP)管 3.3.2PCR管 3.3.3吸头 3.4实验室分区检测实验室要有相应的生物安全设施和不同功能分区,如样品处理区、核酸提取区、核酸电泳区、结果观察区各功能区要有专用的试剂和实验材料,不可交叉使用样品的采集、处理、存放及运输 4.1样品采集和处理 4.1.1生物安全及采样要求 4.1.1.1生物安全要求样品采集及处理过程中应带一次性手套、口罩防护帽,个人防护参见NY/T541 4.1.1.2采样要求应采集出现腹泻症状12h24h内猪的粪便、肛门拭子样品或剖检猪的小肠;母猪可采集乳汁(初乳最佳) 采集母猪乳汁前要对乳房外表消毒;采集病变小肠时,先结扎拟采集肠道区域两端后,再剪取该组织(防止肠内容物流出),将其全部放人样品袋内每个样品要单独采集和分装,避免交叉污染样品避免接触甲醛或高温,以免降低检出率 4.1.2粪便样品用洁净的药匙和其他物品,刮取适量新鲜粪便,放置于EP管或其他洁净容器中 4.1.3肛门拭子样品 4.1.3.1 采集方法将灭菌的医用棉签插人门(以棉签棉花部分全部插人肛门为准),同一方向转动3次,确保充分获取粪便
GB/36871一2018 4.1.3.2样品处理将肛门拭子放在盛有0.8mL灭菌PBSs的无菌EP管中,涡旋或振荡10min,反复冻融2次，4C 条件下14600×g离心10 1,取上清转人新的EP管中,编号备用 min 4.1.4肠道样品 4.1.4.1 采集方法选择充血、出血肠壁变薄含多量水样粪便等病变明显的小肠组织提取模板前,用无菌剪刀剪取约0.5cm×0.5cm,作为待检样品 4.1.4.2样品处理加人0.8mL~1.0mL的PBS混匀,组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨,将组织混悬液转人无菌 EP管中,反复冻融2次,4C条件下14600×片离心10min,取上清转人新的无菌EP管中,编号备用 4.1.5母猪乳汁 4.1.5.1采集方法用无菌EP管收集母猪产后乳汁2.0ml3.0ml 4.1.5.2样品处理将乳汁转移到无菌EP管中,反复冻融2次,4C条件下14600×离心10min n,取上清转人新的 EP管中,编号备用 4.2存放与运输采集的样品与冰块或干冰一起放人保温壶或保温箱,密封,在保温壶和保温箱外喷洒来苏尔或季铵盐类消毒液,尽快送到实验室检测采集或处理的样品在4C8C条件下保存应不超过24h;若需长期保存,应放置于一80C冰箱,避免反复冻融操作方法 5.1样品RNA的制备(Irizol法或RNA提取试剂盒 5.1.1取1.5mL灭菌EP管,分别加人待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品各200AL,加人1nmL Trizol溶液,剧烈振荡,静置5min 5.1.2加人200从L，飘仿,振荡,冰上静置7min 5.1.34C下,l4600×尽离心10min,取上清600L,加人等体积异丙醇混匀后,冰上静置10min 4下,l4600×离心7nmin,弃上清,加人800L75%的冷乙醇;9800×离心5 min 5.1.4弃上清,自然干燥5min,加人20AlLDEPC处理水溶解沉淀,即为RNA模板注:可使用商品化的RNA提取试剂盒,按其操作步骤提取RNA 5.2反转录(eDNA的合成) 配制反转录反应体系,每管加人5.1.4中制备的RNA模板16ML和4L5×RNA反转录反应混合液含Buffer,dNTP,M-ML.VRNA酶抑制剂、通用反转录引物等),37C水浴15min或置于PCR 仪中3715min,反应结束后,经8515、灭活反转录酶,即为cDNA,直接用于PCR扩增或一20
GB/T36871一2018 冻存备用 5.3多重PCR扩增 PCR扩增体系配制如下引物工作浓度均为10Mmol/L 各种试剂添加完后充分混匀,瞬时离心,使反应液全部集中于管底试剂体积(L) 2×PCR扩增MIX 12.5 PEDVP1/P2 各0.2 各0.4 TGEVP3/P4 PoRVP5/P6 1.0 各 5.3 灭菌双蒸水 cDNA 4.0 25.0 共计 1min,72C1min,35个循环,最后72C RcR扩增条件;94亿预变性 mim后,94C50s,5c 延伸10min 扩增反应结束后取出产物置于4C8c 5.4扩增产物的电泳检测 5.4.1称取适量琼脂糖配置浓度为1.5%的琼脂糖溶液,充分溶化后按1:10000加人祺化乙锭或新型核酸染料澳化乙锭替代物,倒人胶槽制备凝胶板 5.4.2在电泳槽中加人1×TAE,使液面没过凝胶取8aL扩增产物加到各凝胶孔;取5ALDNA分子量标准物(DL2000Marker)加到另一凝胶孔中 5.4.3电泳,待染料移行到凝胶4/5距离,停止电泳 5.4.4将电泳好的凝胶放到紫外透射仪或凝胶成像系统上观察,判定结果并做好记录结果判定 6 6.1试验成立条件含PEDv、TGEV和PoRV阳性对照材料,PCR扩增产物电泳后，同时出现大小约为663bp、 528p和333bp的特异性条带,阴性对照材料无任何扩增产物(见图C.1),则试验结果成立;缺少任何条扩增产物或大小不符,则试验不成立 6.2结果判定 6.2.1检测结果分类在试验成立的前提下,被检样品中可出现PEDV、TGEV和PoRV等3种病原的三重感染、二重感染、单独感染(阳性)和均不感染(阴性)的结果 6.2.2阳性结果 6.2.2.1 三重感染出现大小约为663bp,528bp和333bp的3条特异性条带,判定为PEDV、TGEV和PoRV三重感染阳性(必要时基因测序,序列参见附录D)
GB/36871一2018 6.2.2.2二重感染出现大小约为663p和528bp的特异性条带,判定为PEDV和TGEV二重感染阳性;出现大小约为663bp和333bp的特异性条带,判定为PEDV和PoRV二重感染阳性;出现大小约为528bp 和 333bp特异性条带,判定为TGEV和PoRV二重感染阳性 6.2.2.3单独感染仅出现大小约为663bp或528bp或333bp的特异性条带,判定为PEDV或TGEV或PoRV单独感染阳性 6.2.3阴性结果未出现大小约为663bp,528bp和333bp的特异性条带,判定为PEDV、TGEV和PoRV均不感染阴性)
GB/T36871一2018 附录 A 规范性附录) 试验试剂和溶液的配制 A.10.01mo/LpH7.2)PBs NaCl 8.0g KH,PO. 0.2g NagHPO 2.9g KCI 0.2g 加蒸馏水至1000mL,调pH值至7.27.4,121C高压灭菌30min,冷却后室温保存备用 A.21×TAE Tri碱 24.2g 5.7mL 冰乙酸 10.0mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 加蒸水至100mL,使用时用蒸馏水作50倍稀释,即为1×TAE A.3DEPC处理水用0.1%DEPC处理后的蒸僧水,经121C30min高压灭菌,或直接购买无RNA酶的无菌水
GB/36871一2018 附录 B 规范性附录猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR引物序列猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR引物序列见表B.1 表B.1猪传染性胃肠炎病毒、,猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重-CR引物扩增序列引物名称引物序列扩增片段大小参考毒株序列 5'-TTcGiGTTCTATTCCCG;TTGATG-3" PEDVP1 PEDVM基因 AY974335 663bp PE:DVP2 5'-CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC-3 5'-TTAAAAcTc(GcTATCGcATG;G;-3' TGEVP3 TGEVN基因 DQ443743 TGEvP4 5'-TcTTGTCACATcAccTTTAcCTGC-3" (528bp PoRVP5 5'-CcCCGG;TATTGAATATACCACAGT-3 PoRVVP7基因 DQ786577 (333bp PoRVP6 5'-TTTCTGTTGGCCACCCTTTAGT-3
GB/T36871?2018 ? C 淶??) ?θ??к?RI-PCR?? ?θ??к?RT-PCR???C.1 Size:bp 2000 1000 663bp 750 -528bp 500 333bp 250 100 ?: M -DNA?(DL2000Marker); -PEDv?TGEV?PoRv -PEDVTGEV; 3 -PEDv?PoR TGEV?PoRV; PEDV TGEV; -PoRV; ?? ?c.1?θ??к?RT-CR??
GB/36871一2018 附录D 资料性附录猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重RT-CR扩增序列 D.1猪传染性胃肠炎病毒(IGEw)RI-PCR目的N基因扩增序列如下 ACAAACTcGCTATcGCATGGTGAAGGGCCAAcGTAAAGAGCTTcCTGAAAGGTGGTTCTTG TACTACTTAGGTACTGGACCTCATGCAGATGCCAAA GTcTGGGTTGcCAAGGATGGTGcCATGAAC ATAATGAATCCAAAGCTTTGAAATTCGATGGTAA TTCTAAATCTAAAGAACGTAGTAACTCTAAGACAAGAGATACTACACCTAAGAATGAAAA CAAACACACCTGGAAGAGAACTGCAGGTAAAGGTGATGTGACAAGA D.2猪流行性腹泻病毒(PEDV)RT-PCR目的M基因扩增序列如下 TTCTATTCCCGTTGATGAGGTGATTCAACACCTTAGAAACTGGAATTTCACATGGAATAT CATACTGACGATACTACTTGTAGTGCTTCAGTATGGCCATTACAAGTACTCTGTGATCTTG TATGGTGTTAAGATGGCTATTCTATGGATACTTTGGCCTCTT GGCGCAGC TTGGTGG1 ￥TGATGG GCCGACAGGTCTGCATT TCCTTAG TGGTACATT(GCT'TGT AAAGTCAATTACC TAATTTcGTcACAGTcGc GTcTACGGAcGTG;TTGGTcGTTcA GTcAATGCTTCATcTGGCACTGGTTGGGcTTTcTATGTACGGTCAAAACAcGGcG.ACTACT CAGCTGTGAGTAATccGAGTGcGGTTcTcACAGATAGTGAGAAAGTGcTTcAT D.3猪轮状病毒(PoRV)I-PCR目的VP7基因扩增序列如下 GGTATTGAATATACCACAGTTTTAAcCTTTTTGATATCAGTTGTATTATTGAATTACATA CTTAAATCATTAACCAGAATAATGGACTTCATCATTTACAGATTTCTTCTCATTATAGTT ATACTGTCACCATTTCTTAACGCACAAAATTATGGAATAAAcCTTCCAATTAC'TGGATCAN ATGGATACTcCATATGCGAACTcGACACAAGAAGAAGTGTTCCTAACATCAACTTTATGc TTATACTATcCAACTGAAGCTGcGACACAAATAAATGACAATTcGTGGAAAGATACACTT TCTCAGCTATTTTTAACTAAAGGGTGGCCAACAG

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR检测方法GB/T36871-2018

GB/T36871-2018标准是由国家质量监督检验检疫总局和标准化管理委员会共同发布的标准，该标准主要针对猪传染性胃肠炎病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）、猪流行性腹泻病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）和猪轮状病毒（Porcine Rotavirus，PoRV）三种病毒的多重RT-PCR检测方法进行了规定。

1. 猪传染性胃肠炎病毒（PEDV）

PEDV是一种高度具有传染性的病毒，会引起猪的急性胃肠炎，严重时甚至会导致死亡。GB/T36871-2018中规定了一种针对PEDV的多重RT-PCR检测方法，该方法基于不同保守区域的扩增实现对PEDV的检测，并结合内参基因对检测结果进行验证，具有较高的准确性和灵敏度，同时还可以在短时间内完成检测，提高了检测效率。

2. 猪流行性腹泻病毒（TGEV）

TGEV是另一种引起猪胃肠道疾病的病毒，与PEDV类似，也具备高度传染性。GB/T36871-2018中规定的多重RT-PCR检测方法可以有效地检测出TGEV的存在，并且具有较高的特异性和灵敏度。

3. 猪轮状病毒（PoRV）

PoRV是一种常见的猪病毒，可引起猪的腹泻等症状。GB/T36871-2018中规定的多重RT-PCR检测方法可以对PoRV进行高效准确地检测，同时还可以区分出不同亚型的PoRV，有助于对疫情进行更为精准的控制。

总的来说，GB/T36871-2018标准中规定的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR检测方法具有较高的准确性、特异性和灵敏度，能够在较短时间内完成对这三种病毒的检测，有助于及时发现和控制这些病毒所引起的疫情，保障猪养殖业的稳定发展。对于养殖户来说，应该选择正规的检测机构进行病毒检测，并采取相应的防控措施，避免疫情扩散和蔓延。

总之，GB/T36871-2018标准中规定的多重RT-PCR检测方法为猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的检测提供了科学的依据，为相关领域的技术研究和实践应用提供了支持。