GB/T38580-2020
微生物诱变育种技术规范
Technicalspecificationformutagenesisbreedingofmicroorganisms
- 中国标准分类号（CCS）A21
- 国际标准分类号（ICS）07.080
- 实施日期2020-03-31
- 文件格式PDF
- 文本页数9页
- 文件大小505.86KB
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微生物诱变育种技术规范
国家标准 GB/T38580一2020 微生物诱变育种技术规范 Iechniealspeeifieationformutagenesisbreedingofmieroorganisms 2020-03-31发布 2020-03-31实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/38580一2020 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由标准化研究院提出并归口 本标准起草单位:清华大学、洛阳华清天木生物科技有限公司、标准化研究院
本标准主要起草人:张肿、邢新会、李梅、剪兴金、王立言,郭肖杰、张乐乐、马爱进
GB/38580一2020 微生物诱变育种技术规范 范围 本标准规定了微生物诱变育种要求和证实方法
本标准适用于细菌、放线菌、酵母和霉菌等微生物的紫外、等离子体和化学诱变育种
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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GB15193.19食品安全国家标准致突变物、致畸物和致癌物的处理方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
3.1 菌种strains 面向工业,农业、食品、医药等用途,在发酵过程中发挥生理代谢作用的微生物
3.2 诱变mutagenesis 通过人为的措施诱导遗传物质产生突变的方法
3.3 微生物诱变育种mutagenesisbreedngofmierorganisms 以人工诱变手段诱发微生物遗传物质发生突变,并从突变群体中筛选出所需要的突变株,进而培育 成新品种的育种方法
要求 41人员 试验人员应熟悉基本微生物操作,在开展相关试验前应充分了解使用微生物、诱变剂存在的风险和 安全操作规范,试验过程中做好相应防护
4.2设施与环境 具有能开展基本微生物试验的实验室或车间,配备相关水、电、气等基础设施;实验室生物安全等级 需满足所诱变微生物的要求
4.3诱变材料 4.3.1 总则 诱变材料应遵循以下原则
GB/T38580一2020 单个、,分散的细胞,宜呈悬浮状态 a b 细胞核越少越好,最好是单核; c 按照菌种类型选择合适的培养条件,保证菌种具有旺盛的活力 d 诱变材料制作过程应在超净工作台中进行,所加试剂和溶液应提前进行灭菌或过滤除菌操作
4.3.2菌悬液 将菌种接种至合适的培养基中,培养至对数生长期,离心收集菌体,用无菌生理盐水洗涤两次,再用 适量生理盐水重悬使菌体浓度调整到1×10'CFU/ml1×1o'CFU/ml 4.3.3抱子悬浮液 将菌种接种至固体平板或斜面上培养至产生大量抱子;用生理盐水洗脱并离心收集
用生理盐水 洗涤两次,再用适量生理盐水重悬并通过机械振荡使其充分分散;过滤除掉菌丝体
最后用生理盐水悬 浮得到均匀的袍子悬浮液,并将其浓度调整到1×10CFU/ml~1×10'CFU/ml
4.3.4菌丝悬浮液 将菌种接种到合适的培养基中培养至产生大量生长旺盛的菌丝,取一定量菌液并离心收集
用生 理盐水洗涤两次,再用适量生理盐水重悬并通过机械振荡使菌丝断裂,过滤除去未断裂的菌丝
最后用 生理盐水悬浮得到均匀的菌丝悬浮液,并将其浓度调整到1×10CFU/mL~1×10CFU/mL
4.3.5原生质体悬浮液 将菌种接种到合适的培养基上,培养获得大量新鲜菌丝或袍子,收集菌丝或袍子
用渗透压稳定剂 洗涤两次并重悬,向重悬液中加人一定量破壁酶,在最适条件下酶解,定时取样于显微镜下观察原生质 体释放情况
酶解完成后过滤除去未酶解的菌丝,离心收集原生质体,用渗透压稳定剂洗涤原生质体三 次,并将其浓度调整到1×10CFU/ml~1×10'CFU/ml
诱变育种操作 4.4.1紫外诱变 紫外诱变育种操作要求如下 参数设定宜选择如下参数,紫外线波长260nm,紫外灯功率10w一30w,照射距离10em~ a 30 cm
细菌、原生质体,链霉菌袍子悬浮液照射时间宜选择10s一90s,酵母、霉菌袍子悬浮 minl0min
液照射时间宜选择1 对于不同的微生物样品和诱变要求应优化选择合适的 参数
b 提前20min30min开紫外灯
诱变材料应置于带无菌搅拌子的玻璃平皿中,边照射边搅拌
每个样品需设三个重复,取相同的诱变材料作为阴性对照,不照射紫外光 d 诱变后所有步骤应在暗室红光灯下操作
处理完成后的材料和阴性对照应避光冰浴1h一2h
诱变后样品材料和阴性对照应进行梯度稀释,吸取合适稀释度的菌液涂布固体平板,避光培养 g 至产生单菌落
应统计诱变和阴性对照平板菌落数,计算诱变致死率
4.4.2常压室温等离子体诱变 常压室温等离子体诱变育种操作要求如下:
GB/T38580一2020 参数设定;宜选择如下参数,照射功率100w~120w,照射距离2mm,工作气体流量10L/min. a 细菌,原生质体、链霉菌抱子悬浮液照射时间宜选择30s一5min,酵母、霉菌袍子悬浮液照射 6min
时间宜选择1min~ b) 每个样品应设三个重复,取相同的诱变材料作为阴性对照,阴性对照不照射等离子体
c 照射结束后,应立即把照射过样品放人准备好的预先加人培养基的无菌离心管中,混合均匀
d)处理完成后的材料和阴性对照应做梯度稀释,选择稀释度合适的菌液涂布固体平板,培养至产 生单菌落
应统计诱变和阴性对照平板菌落数,计算诱变致死率
4,4.3 化学诱变 化学诱变要求如下 化学诱变剂的选择:宜根据诱变材料和诱变要求选择合适的化学诱变剂,常用的化学诱变剂及 a 其配制方法参见附录A和附录B. b 化学诱变剂浓度:不同微生物常用诱变剂浓度及处理时间参见附录C
在诱变材料中分别加人不同浓度梯度的诱变剂工作液,混匀后处理不同时间
如需要应再加 人反应终止液终止反应,离心,弃掉上清,用无菌去离子水洗涨诱变处理过的菌体
每个诱变剂量组或每个处理时间组应设三个重复,阴性对照组不加人化学诱变剂,以加人等量 无菌水代替
处理完成后的材料和阴性对照应做梯度稀释,选择稀释度合适的菌液涂布固体平板,培养至产 生单菌落
应统计诱变和阴性对照平板菌落数,计算诱变致死率
化学诱变剂使用后应按GB15193.19的方法进行处理
g 证实方法 5 诱变结果以致死率表示,致死率按式(1)计算 Ce-C LR ×100% 式中: LR 致死率; 阴性对照平板菌落数; Ce 试验组平板菌落数
C
GB/T38580一2020 附 录 A 资料性附录) 化学诱变剂种类、作用机制及常用化学诱变剂 化学诱变剂的种类、作用机制及常用化学诱变剂见表A.1
表A.1 化学诱变剂种类 作用机制 常用诱变剂 5-澳尿嗜(5-BU 5-氟尿嗜(5-FU C鼠杂尿喘呢(GND 碱基类似物 代替DNA中的正常碱基 2-氨基嗦岭(2-AP) 6-疏基噪吟(6-MP 8-氮鸟噪吟(8-NG 亚硝基乙基脉 亚硝基肌 硫酸二乙酯 对DNA分子中碱基 炕化剂 的烧基化修饰 碗酸(碱酸)酯类 甲基硕酸甲酯 甲基硕酸乙前 丫橙 移码诱变剂 移码突变 原黄素 氧化类诱变剂 DNA碱基氧化损伤 亚硝酸(及其盐 机制尚不清楚 金属离子 离子
GB/38580一2020 录 附 B 资料性附录 常用化学诱变剂配制方法 B.1亚硝基服(NIG 配制方法如下 一pH6.0磷酸缓冲液;分别配制0.2mol/L的NaHPO2H.0溶液,0.2mol/几的NaH,PO 2H0溶液前者取出12.3mL,后者取出87.7ml.,两者混合即得pH6.0的磷酸缓冲液
1mg/mL亚硝基呱溶液;称取50mg亚硝基呱,用5mL丙酮溶解,4C保存
用之前向其中 加人45mlpH6.0磷酸缓冲液,振荡使其充分溶解,过滤除菌
诱变终止剂:0.07mol/LpH8.6磷酸氢二钠缓冲液
取磷酸二氢钠2.507g,溶于100mL无 菌水中,过滤除菌
B.2 亚硝酸钠(NIr) 配制方法如下: -pH4.5醋酸缓冲液;称取醋酸钠18g,冰醋酸9.8mL于1L烧杯中,加人少量蒸僧水溶解,移 人1000mL容量瓶中定溶,充分混匀过滤除菌,4C保存备用
-0.1mol/L亚硝酸钠溶液取亚销酸钠0.69g,溶于100mL无菌水中,过滤除菌
使用时与 pH4.5的醋酸缓冲液以1;2的体积比混合后使用
-诱变终止剂:25%的NaS,O溶液
称取4gNagS.O5H.O,溶解于6mL蒸水中
放 置在4C冰箱中备用,使用时过滤灭菌
与诱变液的体积比为l1. B.3硫酸二乙醋(DEs) 配制方法如下 硫酸二乙酯不溶于水,溶于乙醉或乙髅半衰期短,在30条件下半衰期为1h,所以需要现用 现配
取0.5mLDES溶解于4.5mL无水乙醉中,配制成10%的储备液,过滤除菌
B.4甲基磺酸乙酯EMS 配制方法如下 pH7.0的磷酸缓冲液;称取K,HPO3H,o9.39g与KHHPO3.5g,加蒸僧水定容至1o000mL 过滤，121C灭菌15min或115C灭菌30min; 准确称取5.408区EMS粉末于10mL容量瓶中,先加人GmLpH7.0的磷酸缓冲液溶解,后 定容至10mL,配成5.0nmol/L的母液,4C保藏,临用前过滤除菌
GB/T38580?2020 ? C ??) ???? ?????C.1 C.1 ? ? ? ?? ?? С 0.05mol/1 30min 27 76.6% ?? ??ù 0,025mol/L 10min 75.4% ? ??ù C 99.9% 30min 30 2mg/ml ? ?ù 0.025mol/ 89.8% (NIT) 4min ? ? 0.025mol/IL 10min?20minm 85%95% 2526 ? ?? 0.05mol/1 20min 85.7% ?? ???? 0.025mol/L 78.56% 26 25min ? ??ù 2mg/ml 20min 99.7% 30C ? ??? 28 0.5mg/ml 40min 25.93% ? (NTG) ??? 73.47% 30min 30C 0.4mg/ml ? ?? 76.54% 30 C mg/ml 40min ? ?? 85.36% mg/ml 45min ?? 1% 60min 99% 30C ? ??ù 1% 30C 40min 80.2% DES) ? ?ù 0.02% 100% 28 60min ?
GB/T38580?2020 C.1) ? ? ? ?? ?? C 0.5% 20min 65% 42 ? ??? DES) 1% 30 60min 93.1% ? 1% ?? 45min 96.13% 28 ? C 0.4mol/L ?? 60min 70%80% 20 EMS ?? 1.2% 3d 83.2% 37 ? 0.2% 36.57% ?? 28
微生物诱变育种技术规范GB/T38580-2020详解
随着科技的发展，微生物诱变育种技术得到了广泛应用。为了规范这一领域的发展，国家发布了微生物诱变育种技术规范GB/T38580-2020。
什么是微生物诱变育种技术？
微生物诱变育种技术是指通过诱导微生物基因突变，筛选出具有良好特性的突变株，再经过培养和筛选得到新品系的育种技术。
GB/T38580-2020的主要内容
GB/T38580-2020主要包含以下内容：
- 术语和定义
- 诱变剂
- 处理条件
- 诱变剂加入
- 处理方法
- 突变株分离、筛选和鉴定
- 诱变育种材料的质量要求
- 诱变效果评价
- 诱变育种技术应用
- 诱变育种技术报告编写和审查
GB/T38580-2020的意义
GB/T38580-2020的发布，对于规范微生物诱变育种技术的发展、提高诱变育种技术的质量和效率具有重要意义。同时，该规范的实施还将促进相关企业和机构建立完善的质量管理体系，保证产品和技术的可靠性和安全性。
总结
微生物诱变育种技术是一项十分重要的育种技术，其应用领域广泛、效果显著。GB/T38580-2020的发布，将会极大地推动微生物诱变育种技术的发展，为相关企业和机构提供更加严格和规范的标准与指导。
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