GB/T27518-2011
西尼罗病毒病检测方法
DiagnosticofWestNileVirusinfections
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2012-03-01
- 文件格式PDF
- 文本页数10页
- 文件大小381.84KB
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西尼罗病毒病检测方法
国家标准 GB/27518一2011 西尼罗病毒病检测方法 Diagn0sticofwestnilevirusinfeetions 2011-11-21发布 2012-03-01实施 国家质量监督检监检疫总局 发布 国家标准花管理委员会国家标准
GB/T27518一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由农业部提出
本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口
本标雅起草单位;中华人民共其和国北京出人境检验检疫局,北京百欧赛地生物工程技术开发中心 本标准主要起草人:杨秀娟、孙福军、丁若愚、田茵、田睿、王飞、杨静
GB/T27518一2011 西尼罗病毒病检测方法 范围 本标准规定了西尼罗病毒的反转录聚合酶链反应(ReverseTranseription一PolymeraseChainRe action,RT-PCR)、蚀斑减少中和试验(PlagueReductionNeutralizationTest,PRNT和西尼罗病毒的 分离方法
本标准适用于易感动物的西尼罗病毒病的检测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T6682 缩略语 下列缩略语适用于本文件
ABTsdiammonium2,2'-aznobis(3-ethylbenzothiazoline6-sulfonate);2,2'-连氮基-双-(3-乙基苯 并二氢嚓陛味-6-碱酸)二铵盐 AMV,鸟类成怕细胞白血病病毒(avianmyeoblastosisvirus) BSA牛血清白蛋白(bovine.serum.allbumin CPE;细胞病变效应(eytopathiceffecct eDNA;互补DNAcomplementaryDNA) DEPC:焦碳酸乙二酯(diethylpyrocarbonate DNAdeoxyribonucleicacid:脱氧核糖核酸 dH,O;双蒸水doubledistilled nsphate)含有dCTP.,dGTP,dATP,dlTTP四 ucleosidetripho dNTP脱氧核苷酸三磷酸(deoxy-ribonuc 种脱氧核糖核苷 EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacidD 6-FAM:6-基荧光素(6-carboxyfluorescein HIEPES;胫乙基呱嗓乙硫磺酸(N-2-hydroxye ethylpiperazine-N-ethane-st tulphonieacid MEM:基础培养基(minimaessentialmedium) oigo dT;多聚T再加上一小段随机碱基(儿个碱基)构成的引物,用于RT-PCR PBS;磷酸盐缓冲生理盐水(pho hosphatebelancedsolution PFU.蚀斑形成单位(plaqueformingunits) laguereductionneutralizationtest PRNT:蚀斑减少中和试验(pl RNA;核糖核酸(ribonucleieaeid inhibitor RNasin;核酸酶抑制剂(RNAenzyme is-acetate-EDTATris) TAE醋酸盐EDTA(trit
GB/r27518一2011 Taq酶;耐热DNA聚合酶(the hermusaquaticuspolymerase) TAMRA;四甲基罗丹明(carboxytetramethylrhodamine) TRIzol;一种新型总RNA抽提试剂(trizolreagent),可以直接从细胞或组织中提取总RNA Vero细胞非洲绿猴肾细胞 wNV:西尼罗病毒(westnilevirus 试剂 4.1水;符合GB/T6682中一级水的规格,用DEPC处理以除掉RNA酶
4.2TRLol试剂或其他等效的商品化RNA抽提试剂
有3AMV递转录辫.2U/L,一20C保作,不要反复冻随或温度刚烈变化 4.45×AMVBuffer:AMV逆转录酶的缓冲液
RNasin;20U/uL,-20c保存,不要反复冻融或温度剧烈变化
4.5 Oligo(dT):RT-PCR的引物
10×TaqBuffer:Taq的缓冲液
4.8Taq酶;一20C保存,不要反复冻融或温度剧烈变化
4.9dNTP三磷酸脱氧核糖核背,含dCTP,dGTP,dATP、dTTP各10mmoL/L 4.10琼脂糖;电泳级
4.11三叙甲烧,分析纯 4.12异丙醇;分析纯,使用前预冷到一20C
4.1375%乙脖 4.14Ps.121C高压15min后,无菌加人青霉素和链霉素至10o0U/mL. 415TAE,24.2区Tis碱、5.7g冻乙酸.0.5mol几EDTA(pH8.0)10nL,加水定容至100nL,使 用前作50倍稀释,用盐酸调节pH值至7.5一7.8.
4.16wNV标准毒株、,wNV阳性对照与wNV阴性对照
4.17MEM细胞培养基
418Vero绷胞
胎牛血清
D 细胞维持液;含2%一3%胎牛血清、青霉素和链霉素分别为100U/mL的无菌MEM
4.21中性红水游液中性红粉0.1g用去离子水定容至100ml.plH7.4高压除菌或0?4m逃膜过 滤,无菌分装于褐色瓶内,4C保存备用
4.222倍浓度不含中性红MEM液;10倍浓度不含酚红的MEM20ml,胎牛血清4mL,青霉素和链 霉素各10000U(4g),去离水定容至100ml,0.22Am滤膜过滤,pH7.27.4,4C保存备用
4.23不含中性红的营养琼脂;使用前配制20g/1琼脂糖水浴融化后保持在43C45C,加人等量 已加温至43C45C的2倍浓度不含中性红MEM液,充分混合均匀,保存在43C45C水浴中 备用
4.242倍浓度含中性红MEM液:10倍浓度不含酚红的MEM20mL.,胎牛血清4mL.,青霉素和链霉 素各10000U(4g),中性红水溶液6mL,去离子水定容至100mL,0.22丝m滤膜过滤,pHH7.27.4. 4C保存备用
4.25含中性红的营养琼脂;使用前配制20g/儿琼脂糖水浴融化后保持在43C45,加人等量已 加温至43C45C的2倍浓度含中性红MEM液,充分混合均匀,保存在43C45C水浴中备用
4.260.1%过氧化氢
4.27BSA:一般是在购置PCR试剂中带的,是在反应时保持酶活性的
不是必须的
不用自己配置
GB/T27518一2011 也可不加人反应中 4.280.5mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液;碳酸钠0.32g,碳酸氢钠0.586g,加水溶解,定容至 200mL
4.29抗马IgM
5%脱脂奶粉5【的脱脂奶粉济于100mL的PIS缓冲液中 4.30 4.310.05%tween-20;吐温一20.
4.32辣根过氧化物酶结合的抗黄病毒单克隆抗体
4.33Rnase;RNA酶(RNApolymerase)
器材和设备 5.124孔细胞培养板 5. 2 96孔细胞培养板
.3 -氧化碳培养箱
5 二 5.4普通冰箱和超低温冰箱;规格2笔8C,一20C，一80c
5.5研磨器/研钵 5.6离心机(规格>1500g 5.7荧光RT-PCR检测仪 5.8PCR仪. 5.9可调移液器 .10电泳仪 5. 5.11细胞瓶
5.12微型滤器;装有0.22Am滤膜,121C高压15min
5.135%脱脂乳封板
wV的分离 o 实验室生物安全要求 实验室生物安全要求按照附录A执行
样本采集 疑似死于西尼罗病毒病的动物可考虑采集血液、血清、脑脊液或组织,其中组织样品可优先采取脑 组织和神经组织,其次可采集肾,脾和肝组织
进行血样采集时避免使用阻碍PCR反应的肝素,可用抗凝剂DTA采血
6.3样本运输与储存 血清样本应冷藏,24h内运送至实验室血清标本可在4C存放1周,长期保存置一20C或以下)
其他样本送至实验室后,病毒分离样本应尽快进行接种分离,48h内进行接种的可置于4C保存,如未 能接种应置一70C或以下保存,避免反复冻融
6.4样本处理 取感染样本送专业实验室检测,样本的储存和运输应保持在低于一70C中
组织样本取1g2g在无菌研磨器或研钵中,加5mL~10mL含10%胎牛血清的PBS溶液,磨
GB/r27518一2011 碎,冻融2次一3次,3000g离心10min,上清液用微型滤器过滤后备用
血液样本直接冻融2次3次,用含10%胎牛血清的PBSs溶液稀释10倍,3000g离心10min ,上 清液用微型滤器过滤后备用
脑脊液样本用含10%胎牛血清的PBS溶液稀释5倍~10倍,3000g离心l0min,上清液用微型滤 器过滤后备用
6.5病毒分离 处理好的样本悬液接种至已80%90%满度单层Vero细胞,24孔细胞培养板每孔加0.2mL 0.3mL,l00ml.细胞瓶每瓶加1ml2ml,5%二氧化碳培养箱中37C吸附1h~2h,倾去病理材料 悬液,加人细胞维持液,5%二氧化碳培养箱中37C吸附3d5d,连续观察细胞病变(CPE),如出现典 型CPE,可用RT-PCR,PRNT进行病原鉴定;盲传3代后如未观察到CPE,判为病毒分离阴性
wNV的检测 引物与荧光探针 7.1.1荧光RT-PCRE基因扩增引物与探针 引物1;5'TCAGCGATCTCTCCAcCAAAG3'(NTl160)
引物2s'ccGTcAcGcAcGTTTGTcATTGc:s'(NT129) TaqMan探针;5'-TGcccGAccATGGGAGAAGcTc3'(NT1186).5'端标记FAM,3端标记 TAMRA
7.1.2荧光RT-CRNsI基因扩增引物与探针 引物1:5'-GGCAGTTCTGGGTGAAGTCAA-3'NT31ll). 引物2;5'cTccGATTGTGATTGcTTcGT3'(NT3239. TaMn探针:'TGT ACGTGGCCTGAGACGCATACCTTGT-3'NT3136),5'端标记 FAM,3'端标记TAMRA
7.1.3套式RT-PCR外源引物 引物l;5'-TTG;TGTTGG;CTCTC'TTGGCGTTCTT-3'(NT233-257)
引物2:s'cAGccGANcAccAcTGGAcATTcATA-3(NTIG50y 扩增片段大小;407bp
7.1.4套式RT-PCR内源引物 引物1:5'-CAGTGCTGGATcGATGGAGAGG3'NT287-308)
引物2.s'cGccGATTGATAMGcACTcGT-sNT370.3 扩增片段大小;l03bp
7.2模板RNA提取 血清、,血液,脑脊液等液体样品直接取200AL于1.5mL离心管中编号备用;组织样品取2g于无 菌研钵中磨碎,加人10mlPBS混匀,4C中3000g离心15min,取200L.上清于1.5mL离心管中 编号备用
在1.5mL离心管中加人被检样品、阴性对照、阳性对照各200AL,加人TRIzol试剂600L,再加
GB/T27518一2011 人三氯甲炕200L,混匀,4C中12000g离心15min,取上清加人一20预冷的异丙醇400AL,混匀 4C中12000g离心15min,轻轻倾去上清液,加人75%乙醉600Al洗涤,4C中12000离心15min, min10min 轻轻倾去上清液,室温干燥5 ,加人DEPC水20l溶解RNA,冰上保存备用
提取的 n RNA最好在2h内进行RT-PCR扩增,若需长期保存,应放置一70C冰箱
7.3反转录 在PCR管中依次加人5×AMVBuffer4Al,dNTP(各10mmol/I)2Al,RRNase20U.Oligo(dT 0pmol.AMV逆转录酶10U,RNA模板5LDEPC水至20L.,瞬间离心,43C反转录1h后,立即 迅速冷却至4C,瞬间离心,分装,立即用于荧光PCR或套式PCR,或于一80C保存备用
7.4荧光PCR 采用25L反应体系,在R毛细管或PR反应管中依次加人I0xTBdfer2.5AL.INTP(备 2.5mmol/I)3 lL.镶化镇(Mkcl.)(c5mmalL)5.5,L.引物(7.1.1或了.1.2)(c20 丛mol/L各 0.5山、TaMan探针(在荧光PCR引物中已标出(I0gmolL)1L.TaDNA聚合酶0.25 4l、BSA 闪g/L)1LcDNA(逆转录后的产物)5L.dlH.0至25L
瞬间离心后于定量CR仪进行PCR 5 扩增
扩增条件;95预变性5nmin后,95C15s,601min,45个循环,每次循环结束后检测每管 扩增的荧光值
7.5套式CR 在PCR管中依次加人10×TaqBulffer5aL,dNTP(各2.5mmol/L.)4l、氯化镁(MgCl, 4mol/L)各0.5l、TaqDNA聚合酶0.25L,cDNA或外源 mmdl/L)4L.外源引物(7.L.a.D0 (25 引物扩增产物5l.dlH0至50AL
瞬间离心后进行PCR扩增
扩增条件.95C预变性5min后 94C45s,56C45s、72C1nmin,35个循环,72C延伸10min 取15L扩增产物用18g儿琼脂糖 电泳观察结果
如果观察到特异性扩增条带,扩增产物用超纯水稀释至100倍~1000倍后用,作为内 源引物扩增模板,如果未观察到特异性扩增条带,扩增产物直接作为内源引物扩增模板
内源引物扩增的反应体系配制方法参照外源引物扩增反应体系进行,扩增条件;95C预变性5minm 后,94C45s,58C45s、72C1min,25个循环,72C延伸5min
取15AL扩增产物用20g/1.琼脂 糖电泳观察结果
7.6结果判定 7.6.1荧光PCR 阴性对照无C值(每个反应管内的荧光信号达到设定的阀值时所经历的循环数),并且无扩增曲 线;阳性对照Ct值应小于30.0,并出现典型扩增曲线
否则,试验结果无效
在试验结果成立的前提下,如果样品的C值小于37,且出现典型扩增曲线为阳性,Ct值3745为 可疑,无C值且无扩增曲线为阴性
7.6.2套式PCR 阳性对照的PCR产物电泳后,出现一条特异性条带;阴性对照PCR产物电泳后没有条带,试验结 果成立;否则,结果不成立
在试验结果成立的前提下,如果样品PCR扩增产物经过电泳检测后,出现特异性目的片段者为阳 性;无特异性扩增片段者为阴性
3 7.6. 样品结果判定 7.6.3.1样品同时用E基因和NS基因进行荧光PCR后,结果均为阳性者判定为含有西尼罗病毒 核酸
GB/r27518一2011 7.6.3.2样品同时用E基因和NSI基因进行荧光PCR后,结果均为阴性者判定为不含有西尼罗病毒 核酸 7.6.3.3样品同时用E基因和NS基因进行荧光PCR后,其中之一结果均为阴性者,用套式PCR再 次进行检测,结果为阳性者判定为含有西尼罗病毒核酸,结果为阴性者判定为不含有西尼罗病毒核酸
7.6.4荧光PCR和套式PCR的外源引物扩增可采用等效的一步法RT-PCR试剂盒进行检测,其操作 和结果判定根据试剂盒的说明书进行,但应优化引物和TaqMan探针浓度,确保检测的特异性和灵敏 度与本标准的方法等效
7.6.5 应用荧光RR和套式PcR检测西尼罗病毒核酸结果为阳性者,必要时应对扩增产物进行核散 序列分析验证
蚀斑减少中和试验(PRNT 8.1操作程序 8.1.1病毒培养 wNV标准毒株接种至处于对数生长期80%一90%满度非洲绿猴肾(Vero)细胞,37C吸附1h 后,弃去病毒液,加人细胞维持液,5%二氧化碳培养箱中37C培养3d~4d,待70%一80%细胞出现 CPE,一20C冻融2次,分装,一80C冻存备用
8.1.2PrU测定 保存病毒用MEM连续10倍稀释,接种于80%90%满度单层Vero细胞的96孔板,每个稀释度 接种8孔,100nL/孔,同时设8孔细胞对照,每孔加人MEM100L.5%二氧化碳培养箱中37C孵育 1h~2h，弃去孔内病毒液,加人不含中性红的营养琼脂100L/孔,5%二氧化碳培养箱中37C培养 4.5d,加人含中性红的营养琼脂100L/孔.5%二氧化碳培养箱中37C避光培养,12h后观察CPE 计算病毒的PFU
8.1.3蚀斑减少中和试验 待检血清、标准阳性血清和标准阴性血清用MEM做连续2倍稀释后,加人等体积50l含有 100PFU的病毒悬液,充分混匀,37C作用1h后,将血清与病毒混合液接种至80%一90%满度单层 Vero细胞的96孔板,每个稀释度接种8孔,100AL/孔
同时将稀释好的50L中100PFU的病毒悬 液做10倍,100倍.1000倍稀释接种80%一90%满度单层Veo细胞的96孔板,每个稀释度接种4孔 8孔,100l/孔,作为病毒回归对照
稀释好的50L中100PFU的病毒悬液接种4孔一8孔 100L/孔,作为病毒对照
MEM接种4孔8孔,100AL/孔,作为细胞对照
所有处理好的细胞于 5%二氧化碳培养箱中37C孵育1h2h,弃去孔内液体,加人不含中性红的营养琼脂100AL/孔,5% 二氧化碳培养箱中37C培养4.5d,加人含中性红的营养琼脂100AL/孔,5%二氧化碳培养箱中37C 避光培养,12h后观察CPE,按Reed.Muench方法计算血清的中和效价
2 结果判定 8 8.2.1回归对照的病毒浓度为每50AlL30PFU~300PFU范围内,并且标准阴阳性对照血清的抗体 效价在1个滴度误差范围内,试验成立,试验结果成立的条件下方能判定样品的结果,否则,试验结果不 成立,查找原因,并重做试验 8.2.2待检样品中和效价大于等于1:10者判为阳性
GB/T27518一2011 IgM捕获ELISA 实验步骤 0.5mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗马lgM作为捕获抗体包被平底96孔ELISA板每孔 100Al;包被板在4C湿盒中孵育过夜
使用前,用含有0.05%吐温一20的0.01MpH7.2PBS洗板 两次,每孔用200L300AL;用PBS新配制的5%脱脂奶粉封板,每孔加300L,并在室温中孵育 60min， 孵育后,移去封闭液,并用PBS洗板3次;被检和对照血清用PBS作1:400稀释(脑脊髓液作 1;2稀释),每份样品加双排孔(每份样品共加4个孔),每孔50plL,包括用和样品同样方法制备的对照 阳性和阴性血清;盖上板并在37C湿盒中孵育75min;移去血清,并用PBS洗板3次;用PBS稀释病 L病毒抗原到每份被检血清和对照血清 毒和正常抗原,加50 排孔中,并加50AL正常抗原到每份被 检血清和对照血清的第二排孔中;盖上板,并在4湿盒中孵育过夜;移去孔中抗原,并用PBs洗板 用PS稀释辣根过氧化物酶结合的抗黄病毒单克隆抗体,每孔加50L;盖上板,并在37C孵育 3次 60min;移去结合物,并PBS洗板6次;每孔加50L新配制的ABTs底物和过氧化氢(0.1%),在室温 中孵育30min
结果判定 在405nm测光密度值,如果含有病毒抗原的被检样品孔的光密度至少是含病毒抗原的阴性血清 对照孔的光密度的两倍,并至少是含有对照抗原的被检样品平行试验孔的光密度的两倍,该被检样品被 认为是阳性
1 结果判定 10.1组织,血,脑脊液或其他体液中分离到西尼罗病毒,说明动物感染了wNV
10.2组织、血、脑脊液或其他体液中用RT-PCR检测到西尼罗病毒基因.判定为西尼罗病毒RT-PCR 检测结果阳性,或判定为西尼罗病毒基因检测结果阳性
说明动物感染了wNV
10.3lgM捕捉ELISA检测到西尼罗病毒lgM抗体,判定为西尼罗病毒IgM捕捉:L.IsA结果阳性
说明动物感染了wNV
10.4lgM捕捉ELISA结果判定为可疑,并用蚀斑减少中和试验检测到西尼罗中和抗体,判定为西尼 罗病毒抗体检测结果阳性
说明动物感染了wNV
GB/T27518一2011 附录 A 规范性附录 实验室生物安全要求 PRNT;所有操作在BsL-3实验室中进行,操作人员防护、所有使用物品和废弃物按BSsL-3要求 进行
A.2病毒分离:所有操作在BSL3实验室中进行,操作人员防护、所有使用物品和废弃物按BsL-3要 求进行
A.3PCR;前期所有操作在Bsc(生物安全柜)内进行,病毒裂解液加人后可转移至生物安全2级 (BSL-2)实验室进行操作
动物尸体解剖;所有操作在SL-3实验室中进行,操作人员防护,所有使用物品和废弃物按BSL-3 要求进行
A.5其他有关西尼罗病毒的操作;前期所有操作在BsC内进行,能有效灭活病毒的去垢剂或病毒裂解 液加人后,方可转移至BSL-2实验室进行操作
注;BsL3;生物安全3级实验室,IBsl-2;生物安全2级实验室,BsCc;生物安全柜
西尼罗病毒病检测方法GB/T27518-2011
西尼罗病毒病是一种严重的传染病，已经在全球范围内发生了多次大规模爆发。因此，及早检测和诊断显得尤为重要。GB/T27518-2011是一种适用于西尼罗病毒病检测的方法，该方法基于反转录聚合酶链式反应技术，可以快速、准确地检测出西尼罗病毒。
GB/T27518-2011方法包括两个步骤：第一步是提取样品中的核酸；第二步是通过特异性引物和探针引导下的反转录聚合酶链式反应技术，扩增目的基因片段并进行检测。该方法具有高灵敏度和高特异性，并且可以同时检测多个样品。
GB/T27518-2011方法的优点在于可靠性高、检测结果准确、快速且具有较高的灵敏度和特异性。此外，该方法操作简单、易于推广，适用于各种类型的实验室和野外条件下的检测和诊断。
总结来说，GB/T27518-2011方法为西尼罗病毒病的检测提供了一种准确、快速和可靠的方法，对于保障公共卫生和动物健康具有重要意义。
