国家标准 GB/T29582一2013 花生矮化病毒检疫鉴定方法 Deteetioamdidentifieatimofpeamtstuntxirus 2013-07-19发布 2013-12-06实施国家质量监督检监检疫总局发布国家标准花管理委员会国家标准
GB/T29582一2013 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标淮起草单位上海出人境检验检疫局、深圳出人境检验检疫局、厦门出人境检验检疫局本标准主要起草人:于翠、杨翠云、印丽萍、郑耘、廖富荣、郑建中、易建平
GB/T29582一2013 花生矮化病毒检疫鉴定方法范围本标准规定了花生矮化病毒检疫鉴定方法本标准适用于活体植物材料,包括无性繁殖材料、组培苗,种子和苗木中花生矮化病毒的检测规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样花生矮化病毒基本信息中文名;花生矮化病毒英文名:Peanutstuntvirus" 名 i;groundnutstuntvirus;peanutstuntcueumovirus;robiniamosaicvirus;cloverblotch virus;peanutcommonmosaicvirus 写:PSV 缩属雀麦花叶病毒科Bromoviridae,黄瓜花叶病毒属Cucumoirus 花生矮化病毒的其他信息参见附录A 方法原理利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(doubleantibodysandwichenzyme-linked 1y,DAs-EL1SA)、体外反转录和体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应 immunosorbentassa (reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)进行检测鉴定仪器设备、设施、用具和试剂 5.1仪器 PCR仪、超净工作台、电子天平(Q.001g)电泳仪、电泳槽、,凝胶成像系统电子透射显微镜、水浴锅、高速冷冻离心机、一80C超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉,涡旋振荡器 5.2设施隔离温室(10C一30C) 5.3用具可调式微量移液器(2L、,10aL、100aL、,200aL、1000aL,5000aL.)及相应的无RNase吸头、无 RNase离心管、PCR管和研钵等
GB/T29582一2013 5 试剂病毒检测试剂盒、Trizol,焦碳酸二乙酯(DEPC)、液氮、三氯甲烧、异戊醉、异丙醇,乙醉醇、B-疏基乙醇.AMV反转录酶、TuqDNA聚合酶,.DNA分子标记,澳化乙锭、琼脂糖、澳酚蓝等血清学和分子生物学试剂配制参见附录B 注:除有特殊说明外,所有试验用试剂均为分析纯或生化试剂 6 检测 PSV的症状根据寄主植物和病毒株系的不同而变化，自然感染的植物症状是持久的在花生 .)上有不同程度的矮化、节间缩短、叶片变小、轻斑驳、豆荚畸形 Arachishypogaealinn. 在菜豆 PhaseolusvulgarisLinn.上,小三叶表现褪绿斑驳和花叶,而有些栽培种的小三叶变长,不能长成正常的叶片;烟草(NicotianatabccumLinn.),表面严重的斑驳,整株植物褪绿,或有褪绿斑并有橡树叶状的叶片;羽扇豆(LupiwsmicranthusGuss.),叶片、花器畸形,植株矮化当寄主植物表现症状时,可根据症状采样;当寄主植物无症状时,则可以按SN/T2122中规定的抽样方法进行鉴定鉴定流程有多种方法可对PsV进行检测鉴定免疫电镜是一种快速方法,但是仅能对少量病毒含量高的样品进行检测,且需要透射电镜这样的贵重仪器 PT-PCR作为单一方法能够快速灵敏地进行检测但是需要实验室人员具备相当的专业技能 ELISA方法是一种快速、,简单易学且需试验设备最少的方法但是某些株系由于血清学关系远而可能被漏检通常初筛时,根据样品量的多少选择ELISA或 RT-PCR方法具体操作流程可参照图1 鉴定样品是否带毒应两种或两种以上的方法相互验证年寄主植物样品锅击 DAs-ELISA检测 RI-CR检测两种方法均为阳性两种方法检测只有一种方法检渊均为阴性结果为性样品不带sv 样品带有两v 免疫电镜或接种试险至少一种力达两种力法检测校测结果阳性结果均为阴性图1PSV鉴定流程图
GB/T29582一2013 7.2双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAs-ELISA 对种苗叶片或由种子催生长出的第一对真叶研磨,并按植物组织重量和抽提缓冲液1;10的比例稀释,制备的汁液分别盛装于离心管中,低速离心后吸取上清液待用于ELISA检测具体检测步骤见附录C 7.3RT-PCR检测植株叶片或种子液氮研细,取0.1g用于提取植物总RNA RT-PCR具体操作步骤见附录D. 生物学检测在室温(20一25C)条件下,栽种于检疫隔离温室中的昆诺藜或苑色黎,菜豆,普通烟、豇豆番茄等鉴别寄主植物第一对真叶长出后可作为指示植物用于摩擦接种对经DAs-ELIsA或RT-PCR检测阳性的植株或种子,加人适量接种缓冲液研磨成汁液后接种指示植物当任意一种指示植物出现如下描述症状时,即可判定接种成功览色藜或昆诺藜(Cheodiumamaranticolor,c.guimoa);接种叶出现褪绿斑,后系统叶出现褪绿斑和花叶 b菜豆(PhaseolusulgarisLinn);褪绿或局部坏死斑,系统褪绿花叶或仅有花叶症状(不同栽培种上的症状也不同) 普通烟(N.tabacum):接种叶上有直径5mm~10mm的线黄绿色环,系统感染的新叶上有褪绿区; 豇豆(Vigaunguiculata):第一叶接种后的4d5d产生褪绿斑,2d3d后小三叶表现脉明和向上束起，番茄(LycoersiconesculentumLinn);表现为类似感染黄瓜花叶病毒或番茄不孕病毒所引起的蕨叶的叶片呈带状 7.5免疫电镜检测按照SN/T1840中的方法进行电镜观察病毒粒子形态在免疫电镜下如观察到直径为29nm的病毒球状粒子,即可判定免疫电镜结果阳性结果判定当DAS-ELISA结果阳性,且同时7.3,7.4或7.5中任一结果为阳性时,可判定样品携带有花生矮化病毒;当RT-PCR结果阳性,且同时7.2、7.4或7.5中任一结果为阳性时,也可判定样品携带有花生矮化病毒样品与记录结果保存 9.1经检验确定携带花生矮化病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核如种子保存在干燥条件下,其他情况取试验样品保存在一20C冰箱中,有条件的保存在-80C冰箱中更好做好登记和标记工作记录包括:样品来源、种类,取样人员,试验的时间、地点、方法和结果,检验检疫员的签字等酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值,生物学测定应有鉴别寄主的症状照片,RT-PCR检测应有电泳结果照片及序列测定分析
GB/T29582一2013 附录A 资料性附录花生矮化病毒其他信息 A.1寄主范围 PsV自然侵染大豆、花生、菜豆、刺槐、烟草,豌豆以及三叶草等多种豆科牧草 A.2为害症状 PsV影响寄主植物的整个生长期典型症状为节间缩短,叶片变小,褪绿,畸形;在某种程度上,中期感染的症状与番茄斑萎病毒属引起的症状相似早期感染的植株几乎不产生种子或种子不明显 PsV的症状根据主寄植物和病毒株系的不同而变化自然感染的植物的症状是持久的 A.3分布地区欧洲法国、匈牙利、意大利、波兰、西班牙亚洲:印度,日本,朝鲜半岛,的河北、山东,河南、江苏等省非洲;摩洛哥、苏丹美洲;美国 A.4传播方式 A.4.1介体传播 PsV可由蚜虫以非持久性方式传播介体的获毒时间不到1min.传毒时间不到1min,无潜伏期病毒不传给幼蚜在试验条件下易摩擦接种 A.4.2种子传毒可通过花生种子传给下一代植株,PsV从花生的种子传给幼苗的百分率低(大约0.1%) 大豆是否可种传该病毒,目前还无定论,有报道种传率可达3%4%,也有报道不种传尚无其他植物种子传播PsV的报道 A.4.3其他传染源在美国,病毒可在白三叶草,烟草,菜豆上越冬,这几种植物是感染源 A.5粒体形态 PsV粒体为等轴对称二十面体,直径29nm.
GB/T29582一2013 A.6基因组 PSV基因组为三分体基因组,每个病毒粒子包裹有单分子的RNA，或RNAg,或者RNA，和 RNA 存在广泛的株系分化现象,根据分子遗传亲缘关系将PsV划分为三个亚组
GB/T29582?2013 ? B ?? ? B.110PBs?(pl7.4 80 ?(NaCl g (KH,PO 2g 1.5g" (NaHPO ?(KCD) 2g -20(Tween-20 5ml 900mL.?,?(HCI)pH7.4,10001 ml B.2???(pH7.4 (NaSO. 1.3 38 ??PVP) 20g (NaN. 0.2s g -20(Tween-20) 20mL 900mL1PST,?(HcCI)pH7.4,1000ml B.3建?(plH9.6 ?(Na.cO. 1.59g 2.93 ?(NaHcO) g ?900mL?,?(HCI)pH9.6,1000ml B.4??建?(plH7.4 800mL 1PBST? ???(BsA) 20 PVP(?2400040000 g ???1000mL B.5pNPP)?H9.8 97ml (NaN, 0.2g ?600mL??,?(HCD)pH9.8,??1000mL
GB/T29582?2013 B.6??? (NaOH)120g1000mL.??,?3mol/ B.7??TAE50 ??(Tris) 242g 52.1ml ?EDTA,0.5mol/L 100ml ????1TAE B.8??(EB)?(10g/L λ? 20mg ?? 20ml
GB/T29582一2013 c 附录规范性附录双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAs-ELIsA C.1检测 C.1.1根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上,包括2个阳性对照孔、2个阴性对照孔、2个空白对照孔和多个待检测样品孔待测样品孔重复两次 C.1.2每孔加人100AL的PsV的包被抗体溶液,封口膜包好,37C孵育2h4h或4冰箱过夜) C.1.3将酶联板孔中溶液控干,用200A的1×PBST洗涤液洗涤酶联板3次,每次3min,然后在干净毛巾或滤纸上扣干 C.1.4将100Al制备的待测样品溶液加人到设计的待检测孔中,对照孔中也各加人100L相应的阴性对照、阳性对照和空白对照封口膜包好,37C孵育2h3h(或4C冰箱过夜). 洗涤,步骤同C.1.3 C.1.6用酶标抗体稀释缓冲液按照要求稀释酶标抗体,每孔加人100L酶标抗体溶液,封口膜包好，并于37孵育2h4h C.1.7洗涤,步骤同C.1.3 C.1.8将pNPP溶于底物缓冲液中,使最终浓度为1mg/mL 每孔加人100L配好的底物溶液,室温孵育0.5h~2h 必要时每孔加人50A的3mol/儿氢氧化钠溶液终止反应 C.1.9酶标仪405nm波长下检测各孔的吸收值并记录 C.2结果判定质量控制要求;缓冲液孔和阴性对照孔的oD值小T.1,阴性对照孔的oD值小T0. C.2.1 时,按0.05计算阳性对照有明显的颜色反应,孔的重复性以样品OD值的平行允许率控制,按照式(C.1)进行计算: OD一OD. P= ×100% C.1 OD千OD.又1 式中: 平行允许率 OD -重复样品1的OD值; OD -重复样品2的OD值当重复检测样品OD值平行允许率(P)小于20%时,判定检测结果有效 C.2.2若满足不了C.2.1的质量要求,则不能进行结果判定 C.2.3在满足了C.2.1的质量要求后,则按如下原则作出判定样品OD/阴性对照OD值明显大于2,结果判定为阳性; 样品ODs/阴性对照OD值在闵值附近,判为可疑样品,需重做一次或者用其他方法进行验证; 样品OD/阴性对照OD值明显小于2,判为阴性
GB/T29582一2013 附录D 规范性附录 RT-CR检测方法 D.1植物总RNA提取 D.1.1取0.1g样品,液氮研细,加人1mlTrizol,混匀,倒人1.5mL离心管中 D.1.2加人0.2mL三氯甲婉,猛烈振荡15s,4C11000r/min离心10min,小心吸取上层无色水相到新离心管中 D.1.3加人等体积异丙醇,混匀,-20C静置10min,4C12000r/min离心15min,保留沉淀 D.1.4加人1ml75%冷乙醇,悬浮沉淀,4C8000r/min离心10min,干燥沉淀 D.1.5加人30LDEPCH.,O,溶解沉淀(必要时,55C一60C水浴10min,加速溶解),存于-80 备用注;或者按照商品RNA提取试剂盒进行操作 D.2引物序列正向引物PsV-1F:5'GCTcATGcTAGAGAGcTccG3’;反向引物PsV-1R:5'GAAGGGAT- TcGCTGATGcTC3' 扩增片断长度约550bp D.3反转录利用提取的RNA在CR管中进行反转录首先加人3L模板RNA,1山下游引物(204nmol/L). 8AL水混合后70C温育5min;立即置于冰上,2min后加人4ALAMV缓冲液、1AL.dNTP 10mmol/L)、llAMV反转录酶(10U/L),1l，RNA酶抑制剂(40U/L),42反应1h 也可采用RT-PCR一步法试剂盒,操作步骤按使用说明进行注:如不立即进行PCR扩增,应将逆转录产物置于一20保存 D.4核酸扩增 PCR反应体系见表D.1,每个样品设2个平行处理反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整检测时以含花生矮化病毒材料的eDNA或含有花生矮化病毒目标片断的质粒作为阳性对照,以健康植物材料作为阴性对照,以水代替模板作为空白对照表D.1RT-PCR反应体系名称储存液浓度终浓度加样量/l PCR缓冲液 2.5 dNT 2.5mmol/L 200Mmol/儿L 上游引物 0Mmol/L 0.2mol/1 0.5 下游引物 0.5 10mol/1 0.24mol/1
GB/T29582一2013 表D.1(续储存液浓度终浓度加样量/AL 名称 5UA Tu酶 0 .05U/l. 0.25 cDNA 1.5 无菌水 17.75 25 总体积 D.4.1PCR反应循环参数普通PCR反应参数见表D.2,不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整表D.2普通RT-PCR反应参数扩增条件循环次数变性延伸 94C,30、 944min 58C，30 30 72C，10min 72C，45s D.4.2rCR扩增产物的电泳检测用电泳缓冲液(1×TAE)配制2.0%的琼脂糖凝胶(55C60C时加人溴化乙锭至终浓度为 0.54g/mL,也可在电泳后进行染色) 在电泳槽中加人电泳缓冲液,使液面刚刚没过凝胶将9a PCR扩增产物,加1l10×上样缓冲液上样恒压(5V/em一6V/em)电泳40min~50min 凝胶成像系统中观察电泳结果,拍照并记录结果 D.5结果判定如果阴性对照和空白对照未出现条带,阳性对照出现预期大小的条带,样品未出现预期大小的条带,则可判定样品为花生矮化病毒阴性如果阴性对照和空白对照未出现条带,阳性对照出现预期大小的条带,样品出现预期大小条带,可通过测序的方式进一步确认如果PCR产物序列与花生矮化病毒的序列同源,则可判定样品为花生矮化病毒阳性,若序列不同源,则可判定样品为花生矮化病毒阴性也可通过荧光PCR的方式进一步确认 10

花生矮化病毒检疫鉴定方法GB/T29582-2013

一、引言

花生（学名：Arachis hypogaea L.）是我国重要的经济作物之一，但花生矮化病毒严重影响了花生的产量和品质。为保障我国花生生产安全，必须对花生矮化病毒进行有效的检疫鉴定。

二、花生矮化病毒检疫鉴定方法GB/T29582-2013

GB/T29582-2013《花生矮化病毒检疫鉴定方法》是我国针对花生矮化病毒制定的标准，该标准规定了花生矮化病毒检疫鉴定的技术要求、鉴定方法和结果判定等内容。

根据该标准，花生矮化病毒检疫鉴定主要包括样品采集、RNA提取、RT-PCR扩增、测序分析和结果判定等步骤。其中，RT-PCR扩增是最为关键的环节，其特异性和灵敏度对于检测结果具有重要影响。

根据GB/T29582-2013的规定，RT-PCR扩增需要使用两对引物进行扩增，分别是VPg-F/VPg-R和CP-F/CP-R。其中VPg-F/VPg-R用于检测花生矮化病毒的5'非翻译区VPg基因，CP-F/CP-R用于检测花生矮化病毒的外壳蛋白基因。

在RT-PCR扩增过程中，需要注意引物的选择、反应条件的优化和阴性对照的设置等问题。此外，在测序分析中，需要针对扩增产物进行准确的测序，并结合数据库比对和序列分析等多种手段对检测结果进行综合判断。

三、总结

通过GB/T29582-2013规定的花生矮化病毒检疫鉴定方法，可以对花生矮化病毒进行快速、准确的检测和鉴定，从而有效地保障我国花生生产的安全和质量。