转基因产品检测通用要求和定义

转基因产品检测通用要求和定义

国家标准 GB/T19495.1一2004 转基因产品检测通用要求和定义 Deteetionofgeneticallym0difiedorganismsandderivedproducts Generalrequirementsanddefinitions 2004-04-13发布 2004-04-13实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T19495.1一2004 目 次 前言 范围 规范性引用文件 术语、定义和缩略语 实验室通用要求 材料、试剂和标准物质通用要求 抽样通用要求 制样通用要求 检测方法通用要求 结果的表述与判定 0测试报告 样品保存 参考文献
GB/T19495.1一2004 前 言 GB/T19495(《转基因产品检测》为系列标准: GB/T19495.1一2004转基因产品检测通用要求和定义 2 GB/T19495. 2004转基因产品检测实验室技术要求; GB/T19495.3一2004转基因产品检测核酸提取纯化方法; GB/T19495.4一2004转基因产品检测核酸定性PCR检测方法; GB/T19495.5一2004转基因产品检测核酸定量PCR检测方法; GB/T19495.62004转基因产品检测基因芯片检测方法; GB/T19495.7一2004 转基因产品检测抽样和制样方法; GB/T19495.82004 转基因产品检测蛋白质检测方法 本部分引用了ENIso/DIs24276中的内容 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 本部分起草单位;深圳出人境检验检疫局,国家质量监督检验检疫总局动植物检疫 实验所、广州出人境检验检疫局、辽宁出人境检验检疫局、中华人民共 和国江苏出人境检验检疫局、农科院植保所、农业大学 本部分主要起草人杨伟东,朱水芳,金显忠、章桂明,吴际云、翠文、曹际娼、陈洪俊,程颖慧、蒋原、 王锡锋、黄昆仑 本部分系首次发布的国家标准
GB/T19495.1一2004 转基因产品检测通用要求和定义 范围 GB/T19495的本部分规定了转基因产品检测方法的通用技术要求 本部分适用于转基因动物、植物、微生物及它们加工产品中转基因成分的检测 规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB/T19496的本部分的引用而成为本部分的条款 凡是注日期的引用文 件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本 部分 GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法(eqISO3696:1987 GB/T15481一2000检测和校准实验室能力的通用要求 GB/T19495.2一2004转基因产品检测实验室技术要求 转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.32004 7 GB/T19495. -2004转基因产品检测抽样和制样方法 AsTME1342一1997用冷冻、冷冻干燥和低温养护法保存细菌、真菌、原生生物、病毒,遗传要素 以及动物和植物的保存 术语,定义和缩略语 下列术语,定义和缩略语适用于GB/T19495的本部分 -般术语 3.1 物种分类targettaxon 转基因生物所属类别,通常以种为分类单位,也可以是更高或更低一级的分类单位 3.1.2 实验室样品abore ratorysample 由原始样品经过混合、缩分得到的一定数量样品 用于制备试样和存查样品 3.1.3 testportion 测试样品testsample; 由全部或部分实验室样品经进一步均匀化得到的用于分析或测试的样品 3.1.4 灵敏度sensitivits 结果的变化除以相应的浓度标准曲线;也就是分析校准曲线的斜率 3.1.5 检测低限limitofdeteetion 定性方法的检测低限是指被检测物能被可靠检出的最低浓度或含量 但是不必进行定量,并且已 经经过合作实验的证明或单一实验室的确认
GB/T19495.1一2004 3.1.6 定量检测低限 im itofquantitation 定量分析过程的低限是指被检测的样品在合适的精确度水平上能被检测出的最低含量或浓度,并 且依据IsO5725条款[2]或[3],经过合作实验的满意证明或单一实验室的确认 3.1.7 正确度 acuraCy 测试结果和认可参考值的一致性 3.1.8 真实度trueness 大量实验结果的平均值和认可参考值的一致性 注:真实度(可信度)的量度标准通常是以斜率来表示的 可信度也就是所提到的“平均值的正确度” 3.1.9 精确度preeision 在规定条件下所获得的独立测试结果之间的一致性 3.1.10 可重复性repeatabilty 重现性reprdueibility 可重复(可重现)条件下的精确度 3.1.11 可重复性条件repeatabilityeonditions 相同的操作人员在短的间隔时间内在同一实验室,应用相同的仪器设备、相同的方法,完成相同的 测试项目所获得的独立测试结果的条件 3.1.12 重现性条件reprodueibiltyconditios 不同的操作人员在不同的实验室应用不同的仪器设备,用相同的方法完成相同的测试项目所获得 的测试结果的条件 3.1.13 可重复性标准偏差repeatabiltystandarddeviation 重现性标准偏差repeatabilityreprducibilitystandarldeviatiom 在可重复性(重现性)条件下获得的测试结果的标准偏差 注，可重复性(重现性)标准偏差是指在可重复性(重现性)条件下获得的测试结果的散布的分布状态的度量标准 相同地,“可重复性(重现性)变化”或“可重复性(重现性)变化系数”可以被定义或用于在可重复性(重现性)条 件下获得的测试结果的散布情况的度量标准 3.1.14 可重复性低限repeatabilitylimit 重现性低限repeatabilityreprodeibiltylimit 少于或等于在可重复性(重现性)条件下获得的两次测试结果的绝对差异的值,可以被认为是95% 概率 注:使用符号r[R] 当检查在两个在可重复性(重现性)条件下获得的独立的测试结果时,对照获得的可重复性(重现 性)值r[R]=2.8s,[S.] 3.1.15 合作实验或实验室间的研究colaborativetrialorinterlaboratorystudy 几个实验室在有证明文件的情况下对一个或多个稳定的、均一的原料进行量化检测实验,并把结果
GB/T19495.1一2004 汇编成单一的文件 合作实验的指导方针在1SO5725和IsO/AOAC/IUPAC协议草案中有详细的 描述 3.1.16 适当的用途fitnessforpurpuse 适用性applieabhility 用于鉴定基质、分析物或种类的方法的应用范围,根据其性能特征来判断它的浓度范围和研究/监 控类型是合适的 也就是通常所说的方法的局限性 3.1.17 实用性praetieability 操作的简便性,根据完成特定必要的性能标准从而符合指定的目的所需的样品量和费用 3.1.18 pplieablity 适用范围app range 量化范围 quantifteationm of range" 线性linearity 动态范围ddynamie range 由合作实验证明了分析过程内的浓度间隔具有适当水平的精确度和正确度 3.1.19 度量的不确定性measurementuneertainty 与度量结果相关联的参数,能够合理表现被分析物数值散布特点 3.2DNA提取和纯化的相关术语 3.2.1 DNA和RNA的提取DNAandRNAextraetionm 从测试样品的各种成分中分离出DNA和RNA 3.2.2 DNA纯化DNApurifieation 获得更高纯度DNA的方法 在本文中,纯度指的是降低可以观察到的或可测量到的PCR抑制物 的作用 3.2.3 CR质控DNAPCRqualityDNA PCR级DNA,即可以用于PCR扩增的DNA模板 3.3检测方法的相关术语 3.3.1 聚合酶链式反应polymerasechainreaetion 模板DNA先经高温变性为单链,在DNA聚合酶和适宜的温度下,两条引物分别与模板DNA" 两 条链上的一段互补序列发生退火,接着在DNA聚合酶的催化下以四种dNTP为底物,使退火引物得以 延伸,如此反复变性、退火和DNA合成这一循环,使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数 扩增 3.3.2 多重PCRmwtiplexPCR 在同一管PCR反应体系中有两对以上的PCR引物,可同时扩增多个产物 3.3. 3 基因芯片gene-ehip 又称DNA芯片,是指将大量特定的寡核苷酸片段或基因片段有序地、高密度地排列固定于载体
GB/T19495.1一2004 上,测试样品的核酸分子经过标记,与固定在载体上的DNA阵列中的点按碱基配对原理同时进行杂 交,通过激光共聚焦荧光检测系统扫描芯片,用计算机软件分析杂交信号强度而获取样品分子的数量和 序列信息的技术方法 3.3.4 酶联免疫吸附测定enzyme-linkedimmunosorbentassay 酶联免疫吸附测定是用酶作为标记物或指示剂进行抗原或抗体定性、定量测定的综合技术 3. 3. 5 核酸序列的鉴定identifieation;identityofnueeieacidsequeces 通过探针杂交、酶切以及核酸序列测定,对待测样品扩增片段序列与参照核酸片段和(或)序列进行 比较和鉴定 3.3.6 筛选screening 能够迅速可靠地去除(筛选)大量阴性(或阳性)样品的方法,要求使用严格的方法限定检测样品的 数量 本部分筛选方法是指检测几种转基因生物的相同基因成分的方法,例如应用PCR扩增检测启动 子、终止子或其他被关注的基因成分的方法 3.3.7 连接区域junetionreeion 是两段连续序列之间连接处的核酸序列 例如一个启动子和一个基因的连接区域 3.3.8 整合-边界区域integration-borderregion 外源基因插人位点附近的区域 包括外源基因的部分序列和受体生物基因组的部分序列 3.3.9 eific 物种特异性目标序列taxonspee targetseguence 物种内源目标序列taxonendogenoustargetsequence 可特异性确定物种的已知序列,即始终存在于该物种中而在其他物种中不存在的序列 物种特异 性序列有两种类型 数量可变(和/或)多拷贝的序列,能够用于评价该物种的核酸是否存在 低拷贝和/或)单一拷贝的序列,可作为该物种基因组的参照序列用于定量分析中 3.3.10 前处理流程forwardrlow 材料和(或)样品的操作原则,用于确保实验室样品、原材料和包括DNA扩增在内的经过处理的测 试样品在整个实验过程中保持自然分离状态 3.4关于对照的术语 3. 4.1 阳性目标DNA对照psitiveDNAtargetcontrol 参照NA或从可溯源的标准物质提取的DNA或从含有已知序列阳性样品(或生物)中提取的 DNA 该对照用于证明测试样品的分析结果含有目标序列 2 3.4. 阴性目标DNA对照 negatieDNAtareletl 不含外源目标核酸序列的DNA片段 可使用可溯源的阴性标准物质
GB/T19495.1一2004 3.4.3 PCR抑制对照CRinhibitioncontrol 该对照将已知量的阳性DNA模板加人到含有等量测试样品DNA的同一反应中 注:该对照可检测出是否存在可溶性的CR抑制剂,在PCR扩增为阴性结果和定量CR的情况下特别需要 3.4.4 扩增试剂对照amplificationreagentcontrol 该对照包括除了测试样品DNA模板以外所有的反应试剂,在PCR反应体系中用相同体积的水 不含核酸)取代模板DNA 3.4.5 提取空白对照extractiomblankcontrol 该对照为在DNA提取过程中,以水代替测试样品完成提取过程所有步骤,用以证明提取过程中没 有核酸污染 以不同批次提取的DNA并进行多个PCR分析时,在做测试样品PCR时还应同时包括提取空白对 照 3.4.6 阳性提取对照positiveextraetioncontrol" 用含有已知目标核酸的样品与测试样品同时提取DNA,证明用相同的提取方式,两者都提取出目 标核酸 3.4.7 环境对照environmentcontrol 用于确定如实验室空气没有受到核酸污染的PCR对照,该对照是在管中加人不含核酸的适量体积 的水,在样品测试全过程中即从混样到扩增均敞开与空气接触 3.5标准物质的相关术语 3.5.1 标准物质refereneematerial -种原料或物质,其一项或多项性质十分相同的,能很好地用于校准设备、,评估实验方法或评估检 测材料 3.5. 2 有证的标准物质certifiedrefereneematerial 可以溯源(具有证书)的标准物质 其一项或多项性质已被有效的技术程序证明,具有证书或可以 溯源,或是具有其他经过认证机构发出的文件 3.6与定量有关的相关术语 内源基因endogenousgene 管家基因hosekeepinggene 内源参照基因endogenousrefereneegene 参照基因refereneegene 在栽培的物种中拷贝数恒定的,不显示等位基因变化的基因 该基因可用于对基因组中某一目的 基因的定量分析 实验室通用要求 转基因成分检测实验室应符合GB/T15481和GB/T19495.2一2004的规定 转基因产品检测实验室应参加由实验室认可主管部门组织的水平测试且结果合格,并获得国家实 验室认可主管部门授权从事动物、植物、微生物及它们加工产品中转基因成分的检测资格
GB/T19495.1一2004 材料、试剂和标准物质通用要求 所用的引物应是PCR级和(或)HPLC级,探针应是HPLC级;分析过程所有实验仅用不含DNA 和DNA酶的分析纯或生化试剂;所用的水应符合GB6682一1992一级水的要求;对关键试剂应在使用 前进行质量测定;所配置的溶液需要高压灭菌保存,且在容器上注明试剂名称浓度、配置时间、保存条 件,失效日期及配置者姓名,不宜高压灭菌的试剂应使用超滤设备(孔径0.22m)除菌;商品化试剂盒 应注明到货日期,且按照规定的储存条件存放;PCR试剂应小量保存以减少污染;材料、容器及试剂的 保存都应该有防污染措施;菌种、质粒、细胞组织的贮存于保管应符合ASTME1342一1997的规定 所用的标准物质应由认可机构制备,具有证书,并有溯源性,或是具有其他的经过认证机构颁发的文件 证明 抽样通用要求 抽样的方法应采用相应国家标准或国际标准 样品的数量及实验室样品量应根据样品的状态和特性采用GB/T19495.7一2004的规定 制样通用要求 实验室收到样品后,应对申请单进行确认,审查抽样报告,核查样品标识,确认无误后,再进行测试 样品的制备 将实脸室样品均匀混和,取一半作为存留样品,另一半用于检渊 测试样品的制备应按GB/T19495.2一2004中的规定进行,防止污染 测试样品的制备方法应根据样品的状态和特性采用GB/T19495.3和GB/T19495.7的方法 检测方法通用要求 实验室应采取满足客户要求的检测方法,包括采用国家标准或国际标准,实验室应确保使用标准的 最新有效版本 客户未指定所用方法时,实验室应选择已在国际标准或国家标准中颁布的有关方法 实验室制定的方法或被实验室选定的其他方法须经过有效验证方能采用 以核酸为基础的检测方法 核酸检测方法适用于对所转人的外来核酸片段的检测 8.1.1转基因产品核酸的提取 测试样品核酸的提取采用本系列标准GB/T19495.3一2004中相应的方法 DNA提取必须充分 弃除抑制PCR反应的蛋白质、多糖、脂肪类、纤维素以及DNA提取时加人的试剂,包括酚类、,EDTA、三 氯甲炕、异丙醇,乙酸钠、异戊醇、乙醇等;所提取的NA必须是能满足下游分析要求的优质DNA 模板 每个实验室样品必须设置两个提取平行样 每一次从测试样品提取核酸的过程都必须设置一个提 取空白对照(水代替样品),最多10个样品就必须设置一个提取空白对照,如果超过10个样品,则必须 增加阴性提取对照 阳性提取对照必须有规律地应用,或者当使用一批新的提取试剂时也要应用,以揭 示试剂是否有效或者提取步骤是否存在错误 在实验的整个过程还必须设立环境对照 8.1.2定性PCR检测方法 定性PCR检测方法有常规CR,实时荧光PCR和基因芯片检测方法 定性检测对象包括转基因的启动子、终止子、抗性筛选基因、目的基因等外源基因;检测时应设立阳 性目标DNA对照、阴性目标DNA对照,试剂空白对照和提取空白对照,必要时还必须设立PCR抑制 剂对照;同时应检测物种内源基因 定性方法的特异性必须通过有效实验加以证明,阳性误差率应小于等于5%
GB/T19495.1一2004 定性方法的检测低限应符合分析物的最低含量水平即至少有95%的灵敏度(阴性误差率小于等于 5%),实际的检测低限是指目标DNA能被检测到的最低含量,它与测试样品、模板DNA质量和(或)数 量以及方法的绝对低限有关 8. .1.3定量CR检测方法 转基因成分的定量PCR检测方法视情况选用外源基因的其中一种进行,并使用符合采用检测标准 中规定的转基因阳性标准物质或阳性标准分子 检测时须设立阳性DNA对照、阴性DNA对照、试剂 空白对照和提取空白对照,必要时还必须设立PCR抑制物对照 定量方法的检测低限应符合分析物的最低含量水平即其RSD为25%或者更少 定量方法的实 际检测低限是指目标DNA能够被可靠定量的最低含量,它与测试样品、模板DNA质量和(或)数量以 及方法的绝对低限有关 8.2以蛋白质为基础的检测方法 蛋白质检测方法是检测转人外源基因的表达蛋白,适用于抗原性未被破坏的转基因产品 检测方 法主要有免疫学方法和化学分析等方法,可以采用符合国家标准的蛋白质检测试剂盒 结果的表述与判定 9.1一般性要求 检测结果不应表示为“十”或“一” 9.2各种对照结果与测试结果的关系 各种对照的PCR结果见表1 表1可用于分析和报告测试样品的检测结果 表1各种对照的PCR检测结果与测试结果判定的关系 测试样品 阳性提取对照 提取空白对照阴性目标DNA对照阳性目标DNA对照 结果分析 阳性 阴性 可疑" 可疑" 可疑" 扩增的目标片段可检出 未检出扩增的目标片段 应从提取核酸开始重做实验(可能存在污染) 应选择更换核酸提取方法或将已提取的核酸重新纯化(可能存在抑制物) 9.3阴性结果的表述 阴性结果不能表述为“0"或“不含转基因成分(GMOnotpresent)” 阴性结果的测试报告中应注明“对于×物种,未检测出转基因成分”,并且注明该检测方法的检测低 限LOD 9. 4 阳性结果的表述 阳性结果测试报告中应注明“对于×物种,检测出转基因成分 ” 如有可能也可以包括对转基因成分的确证 9.5不确定结果的表述 经过两次以上从核酸提取开始的重复检测,检测结果可疑即不确定(出现阴性结果和阳性结果),重 现性不好,可在测试报告中表述该实验室样品的检测结果为阴性,并注明定量检测方法和定性检测方法 的检测低限
GB/T19495.1一2004 9.6检测质量保证 检测结果应来自同一实验室样品的两份测试样品 当一份测试样品的结果为阳性,另一份测试样 品的结果为阴性时,应重做检测 可能的话,可通过增加PCR反应体系中DNA模板量,使两份试样得 到同样的结果 此外,还需检测模板DNA的质量 10测试报告 样品经检测后,实验室应根据实验的具体操作程序和结果做好详细的实验记录,出具检测报告 检 测报告至少包含如下内容 实验室样品的描述、状态和明确的标识 检测依据 取样方法与日期; 收样的日期 储存条件; 检测开始与结束日期 检测负责人; 实验室样品与测试样品的量; 特定方法取得的结果,结果使用的单位及计算方法 检测过程观察到的特别情况 对检测方法的偏离、增添或删节 本系列标准中需要报告的内容 样品保存 11 存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式,妥善保存6个月 如检测为含有转基困成分,则样 品保存期为1年,以备复验、谈判和仲裁 保存期满后,需经无害化处理
GB/T19495.1一2004 参 考 文献 [1]CodexAlimentariusCommission，ProceduralMa1 TwelfthEditi ionfor“Prineiples for lanual， heEstabishmemtafcodexMathodsofAmlysi"，200I，p 64f.“Gudelincssomthe了 Ap plicationoftheCriteriaApproach”见Cx/MAs01/4) [2 CodexCommitteeon Meth ofAnalysisandSampling:lnHousemethodvalidation. ods ln Codex Housevalidatedmethodsandtheirroleinmethodsofanalysisforcodexpurposes Alimentarius Commission. cx/MAs98/8)，1998，Bhudapest，Hungary，2327 November1998 [3] HorwitzW Protocolforthedesign，conduetandinterpretationofmethodpertormance studies PureandAppliedChemistry，1995，67:331-343 [4]Inhorn,s.L."QualityAssurancePracticesforHealthLaboratories”APHA，washin ington DC1978， 588 p. http://www.eurachem.bam.de/guides/mval.htm，ISBN0-948926-12-0 [57 [6]Thompson，M. andwood,R.，Harmonisedguidelinesforsinglelabornr toryvalidationofmethodsofanalysisTechnicalreportoftheInternationalUnionofPure andAppliedChemistrySymposiumonHarmonisationofQualityAssuranceSystemsfor AnalyticalIaboratories，1999，Budapest，Hungary，4-5November1999 [7 ArumuganathanK ，andEarleE.D.:Nuclearcontentofsommeimportantplantspecies. PlantMol.BiolRep1991，9(3):208-218