肠衣中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

肠衣中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/21166一2007 肠衣中硝基喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determinationofmitrofuranmetabolitesresiduesineasing一 LC-MS/MSmethod 2007-10-31发布 2008-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T21166一2007 前 言 本标准的附录A为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位;江苏出人境检验检疫局 本标准主要起草人:陈惠兰、丁涛、沈崇钰、吴斌、徐锦忠、林宏、李公海、张扬、蒋原、蔡宝亮、陶宏锦
GB/T21166一2007 肠衣中硝基喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了肠衣中吠喃它酮的代谢物5-甲基吗脉-3-氨基-2-嗯陛炖基酮(简称AM0Z)、味喃西 林的代谢物氨基脉(简称SEM),吠喃妥因的代谢物1-氨基-2-内酰脉(简称AHD)和吠喃幽酮的代谢物 3-氨基-2-嗯陛烧基酮(简称A0Z)残留量的液相色谱-串联质谱的测定方法 本标准适用于肠衣中硝基吠喃类代谢物残留量的测定 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一1992,neqIsO3696;1987) 方法提要 硝基味喃类药物在动物体内迅速分解,其原位稳定性只有数小时.而其代谢物在动物体内容易和蛋 白组织结合,十分稳定 在酸性条件下,与蛋白质组织键合的硝基吠喃类药物代谢物游离出来,与衍生 化试剂避光衍生化16h,乙酸乙酯提取后,浓缩定容,用液相色谱-串联质谱仪测定,内标法定量 试剂和材料 4.1水:;应符合GB/T6682规定的一级水 4.2甲醇;HPLc级 4.3乙酸乙酯;HPLC级 4.4乙酸铵;HPLC级 4.5无水磷酸氢二钾:分析纯 4.6二甲基亚碱;分析纯 4.7邻硝基苯甲醛;分析纯 38%分析纯 盐酸.386% 4.8 4.9 同位素内标;AHD'ca.AM0z5.A0zM.SEM.Hck('c,"N2),0居/ml,纯度>98%. 4.10A0Z、SEMHCl、AM0Z和AHD HCl标准品:纯度>98% 4.11A0ZSEM、AMOZ和AHD标准储备溶液lmg/ml 准确称取适量的A0Z,SEMHCI、 AMOZ和AHDHCl标准品(4.10),用甲醉(4.2)配成1.0 mg/ml的标准储备液 储备液贮存在 4C冰箱中,l年有效 ng/ml标准 A0Z,SEM,AM0Z和AHD标准工作溶液;用甲醉分别配成浓度为l00ng/ml、l0t 工作溶液,标准工作溶液在4C保存,3个月有效 4.13内标溶液:用甲醉配制浓度为50ng/ml四种内标混合溶液,内标混合溶液在4C保存，1年 有效 4.14衍生化溶液:50mmol/L邻硝基苯甲醛 称取0.0378g的邻硝基苯甲醛(4.7)到50mL烧杯
GB/T21166一2007 中,加人5mL二甲基亚碱(4.6)溶解,现配 4.15磷酸氢二钾缓冲液(Imol/L);称取87.lg无水磷酸氢二钾(4.5),加人500mL水溶解 仪器 5.1液相色谱-串联质谱仪(串联四极杆);配有电喷雾离子源 5.2分析天平:感量0.01g和0.1mg各一台 5.3旋转燕发仪或相当者 5.4水浴振荡器 5.5旋涡混匀器 5.6贮液器;50mL 57 真空泵;真空度应达到80kPa 5.8离心机 5.9移液器， gL 5ml,200" 55. 10离心管:50ml,具塞 试样的制备与保存 试样制备 将实验室样品绞碎均匀,分出0.5kg作为试样 制备好的试样置于样品袋中,密封,并做上标记 6.2试样保存 将试样于冷冻状态下保存(一18C) 测定步骤 提取 准确称取2.00试样.置于50mL具塞离心管中.准确加人0.100mL50ng/mL四种内标混合溶 液(4.13)、4ml水,0.5mL1mol/1HCl,150nL邻硝基苯甲醛溶液(4.14),于旋涡混匀器上快速混合 30s，37C水浴振荡过夜(16h) 取出样品,冷却到室温后,加人3.5mL磷酸氢二钾缓冲溶液(4.15). 调节样品溶液pH7 7一7.5 加人8ml乙酸乙酯,混合30s,2500r/min离心5nmin,取上层乙酸乙酯溶 液到50mL玻璃试管中,再加人8ml乙酸乙酯,重复上述提取步骤,合并提取液,40C水浴旋转燕发 干 用甲醇水溶液(4十6)1.0mL定容,过0.45Am的滤膜到进样瓶中,供液相色谱-串联质谱仪测定 标准溶液的衍生化 分别准确移取100ng/mL和10ng/mL四种标准混合溶液(4.12)0.20mL0.10mL和0.050mL 到相应干净的50ml玻璃离心管中,准确加人0.100ml四种标准内标混合溶液(4.13),0.5ml1mol/L HCI、150AlL邻硝基苯甲醛溶液(4.14),于旋涡混匀器上快速混合30s，37C水浴振荡过夜(16h) 按 照样品提取步骤处理(7.1)后,供液相色谱-串联质谱仪测定 7.3测定 参考液相色谱条件 色谱柱:C,5Am，150mm×2.1mm n(内径),或相当者; a 流动相甲醇(A+0.5mmol/儿乙酸铵水溶液(B): D) 流速;0.25mL/min; c d 9min60% 梯度洗脱程序:0min" 6.0min20%60%A,6min8min 60%A,8min" min10.5 80%A,9min一9.1min80%20%A,9.1 min20%A e 柱温:室温; f 进样量:25L
GB/T21166一2007 7.3.2串联质谱条件 离子源;电喷雾离子化电离源(EsI),正离子监测; a b 扫描方式;选择离子检测(SRM); e雾化气、鞘气为高纯氮气,碰撞气为高纯复气 d)喷雾电压,碰撞电压等电压值均优化至最佳灵敏度; 选择离子对见表1 e 表1选择离子对 母离子 子离子 测定物质 m/z m/z 134.0" A0Z. 236.0 104.0 AOZ-D4 240.0 134.0" 166.0" SEM 209.0 92.0 SEM-(1C,1N2 212.0 168.o" 134" AHD 249.0 178 AHDC3 134" 252.0 291” AMOZ 335,0 262 AM0Z-D5 340.0 296.0" 定量离子 7.3.3液相色谱-串联质谱测定 衍生化后的标准工作溶液(7.2)在液相色谱-串联质谱设定条件下分别进样以标准与内标物峰面 积比值为纵坐标,工作溶液浓度(ng/mL)为横坐标,绘制6点标准工作曲线(0.5ng/mL20ng/mL). 用标准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中标准的响应值均应在仪器测定的线性范围内 在上述色 谱条件下,其相应的标准物质、内标色谱图和串联质谱图参见图A.1和图A.2 7.4空白试验 除不加人试样外,按上述步骤进行 结果计算 结果用色谱数据处理机或按式(1)计算样品中硝基吠喃代谢物的浓度,结果需扣除空白值 式中 -样品中硝基峡喃代谢物的浓度,单位为微克每千克(4g/kg); -样品中硝基咦喃代谢物的峰面积与相应内标峰面积比值 硝基吠喃代谢物标准的质量,单位为纳克(ng); 71 A -标准品中硝基吠喃代谢物的峰面积与相应内标峰面积比值; 样品质量,单位为克(g). n
GB/T21166一2007 测定低限和回收率范围 本方法中四种硝基峡喃类代谢物测定低限均为0.5g/kg 肠衣中四种硝基吠喃类代谢物添加浓度及回收率范围(内标校正)的试验数据(n=l0): 0.5g/kg添加水平,回收率范围在92%104%; 1.04g/kg添加水平,回收率范围在87%120%; 2.04g/kg添加水平,回收率范围在91%~l12%
GB/T21166一2007 附 录A 资料性附录 标准品色谱图及二级质谱碎片图 .60 00- AHD249>134 7.61 100 S-AHH252>134 7.62 AOz236>134 7.59 100 S-Aoz240>134 100- sEM209>166 M S-SEM212>168 00 AMOz335>291 8.10 Is-AM0Z340>296 10 min 图A.1硝基喃类代谢物和其相应内标离子流色谱图
GB/T21166一2007 134.0 133.90 100 AoZ AD 100 " 905 oi 0 m " 0 a 103.97 104.1 0 s0 0 “ af 30 20 10 103.97oO" 103.975 133.900 133.905 104.060 104.065 133.995 134.000 m/ mz m/z mz 291.0o SEM 166.00 100 AMOz 1001 90 192.00 i i 0 70s m n so 50- 40 0 262.00 o 30 n n 105 10 0 I品 995 166.000 191.995 192.000 261.995 262.000262.005 291.000291.005 m2 m I 图A.2四种硝基肤喃代谢物二级质谱碎片图