国家标准 GB/T40194一2021 大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofBarleystripemosaievirus 2021-05-21发布 2021-12-01实施国家市场监督管理总局发布国家标涯花管理委员会国家标准
GB/40194一2021 前言本文件按照GB/T1.1一2020<标准化工作导则第1部分;标准化文件的结构和起草规则》的规定起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本文件起草单位;检验检疫科学研究院、福州海关本文件主要起草人:张永江、沈建国、辛言言
GB/40194一2021 大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法范围本文件规定了大麦条纹花叶病毒的血清学和分子生物学检疫鉴定方法本文件适用于可能带有大麦条纹花叶病毒的植物及其产品的检疫鉴定规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义大麦条纹花叶病毒基本信息学名;Barleystriemosaicirus 缩写;,IBSMIV 异名:BarleyJlsesripeirus、Barleymildstriemosaicirus、Barleymildstripevirus、 Barleym1osaicuirus、Barleystripemosaichordleiuir4s、Barleyzerymilstripemosaicuirus、Oat srieosaicuir4s,Setripemosaicuirus 分类地位;马泰利病毒目(Martelioirales)植物杆状病毒科(Virgawiridae)大麦病毒属(Hordei uirus)成员大麦条纹花叶病毒的其他信息参见附录A 5 方法原理大麦条纹花叶病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据根据BSMV与抗体之间的特异性反应,对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA);依据BSMV的基因组特征进行RT-PCR,实时荧光RT-PCR检测;通过这些方法的有效组合,判断样品是否带有BSMV 仪器用具与试剂 6.1仪器设备 6.1.1电子天平(感量0.001g. 6.1.2高速冷冻离心机
GB/T40194一202 6.1.3微型瞬时离心机 6.1.4普通冰箱 6.15超低温冰箱(一80c) 6.1.6制冰机. 6.1.7涡旋振荡器 6.1.8磁力搅拌器 6.1.9高压灭菌锅 6.10pH计 6.1.11超净工作台 6.1.12实时荧光定量PCR仪 6.1.13PCR仪 6.1.14微波炉 6.1.15电泳仪 6.1.16电泳槽 6.1.17凝胶成像分析仪 6.1.18洗板机. 6.1.19朋标仪 6.1.20酶联板 6.121可调移彼器(25AL.DAL.0儿.10L..0w山.I0A. 6.1.22可调移液器火 6.1.23Ependaf管 6.1.24研钵 6.1.25微型磨杵 6.2试剂除另有规定外,所有试剂均为分析纯,试验用水应符合GB/T6682中相关规定 6.2.1DAs-ELISA检测试剂,制备按附录B中B.1执行 6.2.2RT-PCR检测试剂,制备按附录C中C.1执行 6.2.3实时荧光RT-PCR检测试剂,制备按附录D中D.1执行检测样品的制备 7.1种子挑取畸形、不成熟种子播于灭菌土中,待长出3片一4片叶后将表现症状的植株编号;未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号,采集的未表现症状的叶片分成2份;用于酶联测定和分子生物学检测也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测 7.2植株对于有症状(如叶片条纹、花叶、褐色细小斑点等)的植株,每个植株编号并进行单株检测没有症状的分组并编号后按组进行检测,分组方法和检测方法同7.1 7.3植物产品植物产品有症状的部分(如条纹,花叶等)单独编号检测没有症状或无法观察症状的植物产品,分
GB/40194一2021 组编号,分组方法和检测方法同7.1 检测鉴定 8.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定包被抗体后,再把制备的样品上清液加人已包被BSMV抗体的酶联板中,进行DASELISA检测每个样品平行加到两个孔中健康的植物组织作为阴性对照,感染BSMV的植物组织作为阳性对照，样品提取缓冲液作为空白对照;其中阴性对照的植物种类和材料(如叶片)应尽量与检测样品相一致具体操作按B.2的规定执行 8.2RT-PCR检测 RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同8.1,灭菌双蒸水作为空白对照分别提取样品和对照的总 RNA,反转录合成cDNA后进行PCR检测,具体操作按C.2的规定执行如采用商品化一步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行 8.3实时荧光RT-PCR检测实时荧光RTCR检测的阴性和阳性对照设置同8.1,灭菌双燕水作为空白对照分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后进行实时荧光CR检测具体操作按D.2和D.3的规定执行如采用商品化一步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行结果判定 DAs-ELISA,RT-PCR和荧光RT-PCR检测方法按照B.3,C.3,D.4的判定方法进行判定,其中任意两种检测方法的结果为阳性即可判定样品携带BSMVv 10 样品保存与结果记录 10.1样品保存经检测确定携带BSMV的样品应保存在适合的条件下以备复核如种子保存在干燥室温环境中; 种苗、叶片等样品保存在超低温冰箱(一80C)中;做好登记和标记工作,保存期限至少1年 0.2结果记录记录包括样品来源、种类、检测时间,地点、方法和结果、检测人员签字 DAS-ELISA检测应有酶联反应数值;RT-PCR检测应有电泳图片;实时荧光RT-PCR检测应有荧光曲线图
GB/T40194一2021 附录 A 资料性) 大麦条纹花叶病毒相关资料 A.1寄主范围寄主范围有限，自然寄主主要为大麦(Hordewwlgare、栽培二棱大麦H.distichon、小麦 Triticumaestivwm)和野燕麦(Aenafatua) A.2危害症状受侵染的大麦在三叶期时即出现褐色分散的细小斑点,后逐渐增多引起叶片枯死有的品种沿叶片中脉出现褐色条斑,在上部叶片出现黄绿相间的花叶和斑驳轻病株能抽穗,但千粒重明显降低小麦感染大麦条纹花叶病毒,发病轻的,叶片上只有褪绿小斑驳;发病中等的,在叶片上出现较大的褪绿斑驳;发病中等偏重的,则出现黄色花叶或坏死斑块;发病严重的则使整张叶片变成黄白色病株所结种子不饱满,千粒重不同程度地降低分布地区 A.3 、以色列、日本、韩国、黎巴嫩、巴基斯坦、叙利亚、突尼斯、土耳其、埃及、澳大利亚、新西兰、丹麦、匈牙利,罗马尼亚、德国、墨西哥、美国、阿根廷、巴西、秘鲁,加拿大,南非俄罗斯、智利、波兰、保加利亚、芬兰、捷克、葡萄牙、摩尔多瓦、瑞土、塞尔维亚、黑山,斯洛伐克、斯洛文尼亚、乌克兰、希腊、意大利,英国、朝鲜 A.4传播方式该病毒主要通过种子传播,也可通过花粉传播种传率分别为大麦90%100%,小麦7%~81%. 野燕麦22%,燕麦0~10%,长穗燕麦草22%,无芒燕麦8%,鸭断草8%，玉米90%100%,黑麦草属 3%8% A.5粒体形态病毒粒体为棒状,长度在50nm150nm,大多数为l10nm;直径约为20 nm A.6基因组基因组为正单链RNA,由三个组分组成,其中组分RNA 的长度约3.7kb,组分RNAp的长度约 3.2kb,组分RNA的长度在不同株系间差别较大,约2.7kb~3.1kb
GB/40194?2021 ? B 淶) ???(DAS-ELIsA B.1? B.1.1 ????塣????;l?治1;?? ?????? B.1.2?? ?????塣 B.1.3 (pNPP) B.1.41PBS?(pH7.4) 8.0 (NaC g 0.2g (KH,PO (NaHPO .15g ?(KCI 0.2g ?20(Tween-20 0.5ml 900nm???,pH?7.4,1000mL,4C档 B.1.5???(pH7.4 (Na,SO 1.3g ??(PVPMw24000-40000) 20.0g 900mL1PBST,1PBST1000mL,4C档 B.1.6?(pH9.6) ?(Na.co) 1.59g 2.93 ?(NaHCO g 900mL??,1000mL,4C档 B.1.7?????(pH7.4 2.0 ???(BSA g 20.0 ??PVPMIw24000?40000) g 900mL1PBST,1PBST1000mL,4C B.1.8??(pH9.8) 97mL ?
GB/T40194一2021 氯化镁(Mg(C, 0.1g 溶于800ml双蒸水中,用浓盐酸(HCI)调pH至9.8,定容至1000ml,4储存 B.2试验步骤 B.2.1包被抗体按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体,每孔加100"lL 酶联板加盖或用保鲜膜包好,37C孵育2h 清空孔中溶液,用1×PBST加满各孔,3min后倒掉孔中溶液,在吸水纸上拍干再重复2次上述洗板过程 B.2.2样品制备与加样待测样品,阴性对照及阳性对照按1;10(W/)加人抽提缓冲液,在研钵中研磨;将样品研磨液倒人离心管中,5000r/min离心10min,上清液即为制备好的检测样品阴性对照、阳性对照也可以按试剂盒说明书进行处理按100L/孔分别加人制备好的检测样品,阴性对照和阳性对照;酶联板加盖或用保鲜膜包好,4C孵育过夜酶联板用自来水彻底冲洗,再用1×PBST洗涤3次,每次3min;或用洗板机自动清洗3次 B.2.3加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液,按说明将酶标抗体稀释至工作浓度并加人到酵联板中,00L/孔,酶联板加盖或用保鲜膜包好,37C孵育4h 酶联板用自来水彻底冲洗,再用1×PlBST洗涤3次,每次3min; 或用洗板机自动清洗3次 B.2.4加底物将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL现配现用),100L/孔加人到酶联板中，室温避光孵育 B.2.5读数在不同的时间内如30min,60min,90nmin、120min或更长时间,用酶标仪在405nm处读OD值 B.3结果判定 B.3.1质量控制要求对照孔的OD值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)应在质量控制范围内,即;缓冲液孔和阴性对照孔的OD值<0.15,当阴性对照孔的OD值<0.05时,按0.05计算;阳性对照孔的oD值/阴性对照OD值>5;同一样品的重复性基本一致 B.3.2结果判定在满足B3.1的质量控制要求后，结果原则上可判断如下;样品OD丽值/阴性对照OD值>2,判为阳性;样品oD值/阴性对照oD值为2时,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验证;样品OD值/阴性对照OD值<2,判为阴性若不满足B.3.1的质量控制要求,则不能进行结果判断
GB/40194一2021 录附 C 规范性) RI-PCR检测 c.1试剂 c.1.1核酸提取试剂 Trizol或合格的RNA提取试剂盒 c.1.2电泳缓冲液TAE(50×x 三胫甲基氨基甲炕(Tris 242g" 冰乙酸(CH,O. 57.1ml. 乙二胺四乙酸二钠(Na,EDTA 2H.O) 37.2g 双燕水定容至1000mL,用时稀释至1×TAE C.2检测步骤 C.2.1核酸提取用电子天平称取0.1只样品加液氮研磨成粉末状,迅速将其移人灭菌的1.5ml离心管(用高压灭菌锅高压灭菌)中,加人1ml的TrizoL试剂,用涡旋振荡器剧烈振荡3min;用高速冷冻离心机4C "C 12000r/min离心10min;将上清液移人一新离心管中,加人0.5mL三氯甲烧猛烈振荡15s;4 12000r/min离心15min;小心吸取上层无色水相到新离心管中;加人等体积异丙醇,混匀;室温静置 10 C12000 r/min离心10min,弃上清液;加人1mL75%的冷乙醇洗涤沉淀;4C min;4 10000r/min离心l0min,弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后溶于304LDEPC-H,O中,微型瞬时离心机瞬离,置于普通冰箱-20C保存备用注:此处以0.1样品为例进行核酸提取,实际检测时如样品量有变化,加人的试剂可按比例调整;或者按照商品化提取试剂盒进行操作 RNA C.2.2引物序列上游引物BSMVF:5'-AGGATCAATGGGATACACAAGTT-3 下游引物BSMVR;5'-TTcGAAAGTcTTcCTGGTATACAC-3 产物大小:503bp C.2.3反转录反转录总体系为20AL 0.2mlLPCR管中加人总RNAlAL,dNTPs(10mmol/L)1AL,DEPC处理水10L.ISMVR(20mol/L)2L..,70C保温5min;冰上用制冰机制备碎冰)放置5min;再加人 5×buffer4AL，RNasin(40U/L)1AL，M-MLV200U/AL)1AL,42C保温1h,得到cDNA后用作 PCR的模板设置阳性对照、阴性对照及空白对照 C.2.4CR扩增 0,2mlPCR管中加人10×PCRbuffer(含Mg+)2ML,dNTPs(10mmol/L)0.6AL,BSMVF及 BsMVR(均为0malL)各05l..2U/l.Tq酶1l.cDNA模板2L和DEPc处理水13.4l
GB/T40194一2021 设置阳性对照、阴性对照及空白对照试剂全部加人后将PCR管放置到PCR仪中进行反应反应程序:95C,8min;95C,45s;58C,45s;72,lmin;40个循环,72C,l0 min 注:如采用商品化一步法RT-PCR检测试剂盒,可按照说明书进行操作,将步骤C.2.3和C.2.4合并进行 C.2.5CR产物琼脂糖凝胶电泳用微波炉将琼脂糖融化后制备1%的琼脂糖凝胶并放人电泳槽,按比例混匀电泳上样缓冲液和 PCR扩增产物,用DNAMarker作为分子量标记,用电泳仪进行电泳电泳结束后在凝胶成像分析仪中观察是否扩增出预期的特异性DNA条带,并拍摄记录结果判定 C.3 阳性对照在503bp左右处有条带,阴性对照和空白对照无特异性条带,待测样品出现与阳性对照 -致的条带,可判定为阳性阳性对照在503p左右处有条带,阴性对照、空白对照及待测样品无特异性条带,可判定结果为阴性
GB/40194一2021 附录 D 规范性实时荧光RT-PCR检测 D.1试剂 D.1.1核酸提取试剂同C.1.1 D.1.2TaqManOnc-stepRT-PCRMhixture D.1.3引物探针上游引物BSMVF;5'CGGAATcGGTGTCGTTGGA-3' 下游引物BSMVR;5'-CTCTTTGACCCGTCTCTGTAACTACC3 探针BSMVP:5'-FAM-AAATCAAAAACATTCTACGGAATcCGG-TAMRA-3' D.2核酸提取方法同C.2.1 D.3实时荧光RI-CR反应反应体系;0.2ml.离心管中加人2×One step RT-PCR10AL，Enzyme Mix0.6AL,BSMVF 104mol/L)0.4ML,IBSMIVR(10mol/L)0.4" ,BSMVP(10mol/L)0.8L,模板RNA2L,补 I DEPC处理水至20L 设置阳性对照、阴性对照及空白对照所有试剂加人均在超净工作台上操作; 试剂全部加人后将离心管放置到实时荧光定量P(CR仪中进行反应反应程序;45C10min;95C10min;9515s,60C1min,共45个循环 D.4结果判定对于疑似分离物,阳性对照和空白对照正常,出现典型扩增曲线判定为阳性;无典型扩增曲线判定为阴性对于样品检测，阳性对照和空白对照正常,出现典型扩增曲线,且CT<35,判定为阳性;35

大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法GB/T40194-2021

大麦是我国重要的粮食作物之一，在生产中极易受到各种病害的侵袭。其中，大麦条纹花叶病毒（Barley stripe mosaic virus， BSMV）是一种常见的病毒性病害。为了保障农业生产和国际贸易顺利进行，对于大麦种子、植株及其产品等的出入境检疫工作非常重要。

GB/T40194-2021标准介绍

GB/T40194-2021《大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法》是由中国国家标准化管理委员会发布的最新标准，于2021年正式实施。该标准以大麦条纹花叶病毒的检测为主要内容，包括了种子、植株及其产品等不同样品类型的检测方法。

检测方法

该标准提出了多种检测方法，主要包括：

RT-PCR法：通过逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR）技术检测大麦条纹花叶病毒RNA。
DAS-ELISA法：通过双抗体夹心酶联免疫吸附试验（double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay，DAS-ELISA）技术检测大麦条纹花叶病毒抗原。
Western Blotting法：通过Western Blotting技术检测大麦条纹花叶病毒蛋白质。

上述方法各有优缺点，可以根据具体情况选择合适的方法进行检测。

结语

GB/T40194-2021《大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法》的发布，对于提高大麦种子和相关产品的检测准确性和效率，促进出入境贸易的顺利进行具有重要意义。相信在不久的将来，随着相关技术的不断发展和完善，大麦条纹花叶病毒的检测方法也会更加科学、高效。