GB/T31810-2015
玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofMaizechloroticmottlevirus
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2015-11-27
- 文件格式PDF
- 文本页数16页
- 文件大小2.01M
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玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定方法
国家标准 GB/T31810一2015 玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定方法 DeteetionandidentificationofMaizechloroticmottlevirus 2015-07-03发布 2015-11-27实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T31810一2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位:珠海出人境检验检疫局、检验检疫科学研究院、中华人民共 和国宁波出人境检验检疫局、上海出人境检验检疫局、云南出人境检验 检疫局
本标准主要起草人:张卫东、张永江、张慧丽、王岚、杨翠云、廖力、李昱、迟远丽、徐森锋、权永兵、 闻伟刚、陈其文
GB/T31810一2015 玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定的方法
本标准适用于可能携带玉米褪绿斑驳病毒的种子,种苗等植物繁殖材料中玉米褪绿斑驳病毒的检 疫鉴定
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2964一2011植物病毒检测规范 仪器设备、设施和主要试剂 3.1仪器设备 酶标仪、洗板机、普通PCR仪,荧光PCR仪、微量分光光度仪、生物安全柜、高压灭菌锅培养箱、微 量天平(感量;0.001g、冰箱、离心机、酸度计,水浴锅,电泳仪、凝胶成像系统、移液器(1000AL、 200AlL100AL10L,2.5L)
3.2设施 隔离温室(10C30C). 3.3主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯
主要试剂和缓冲液见附录B中B.1和附录C中C.1 抽样和检测样品的制备 抽样 抽样按照SN/T2122的规定执行 4.2检测样品的制备 4.2.1种子类 挑取至少500粒种子(重点挑取畸形、不成熟的种子)样品,经3%次氧酸钠(NaCIO)表面消毒 101 nmin后,将种子置于灭过菌的土壤中,在适宜的发芽温度(2528C)条件下催芽,直至长出3片~ 4片真叶进行检测
选取具有褪绿,畸形等症状的植株幼嫩叶片全部进行编号检测,同时随机抽取至少 20株无症状植株样品进行混样检测
GB/I31810一2015 4.2.2种苗类 对于有症状的种苗类样品单独检测,重点选取表现症状种苗类样品的幼嫩叶片;对于无症状的种苗 类样品至少选取20株的幼嫩叶片进行混样检测
检疫鉴定方法 5.1DAS-ELISA检测 DAs-ELISA检测方案设计参照SN/T2964一2011
在一次血清学检测试验中,设置2个阳性对 照孔、2个阴性对照孔、2个空白对照孔作为质量控制,并根据送检样品数量设置待检测样品孔数,要求 每个待测样品设两次重复
所有点样孔都安排在酶联板内部,防止边际效应的发生,影响检验结果的准 确性
具体操作见附录B 5.2RI-CR检测 RT-PCR检测用健康的植物组织作阴性对照,用感染MCMV的植物组织作阳性对照,用ddH.O 作空白对照,每个反应体系设置两个平行样
具体操作见附录c
实时荧光Rr-PCR检测方法 5.3 实时荧光RT-PCR检测用健康的植物组织作阴性对照,用感染MCMV的植物组织作阳性对照,用 ddH,o作空白对照,每个反应体系设置两个平行样
具体操作见附录D 结果判定 样品经DAsELISA、普通RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阴性时,判定样品未检出玉米 褪绿斑驳病毒
样品经DAs-ELIsA检测结果为阳性,进一步用RT-PCR或实时荧光RT-PcR方法进行检测
PCR结果为阴性,判定未检出玉米褪绿斑驳病毒;PCR结果为阳性,可以判定为样品检出玉米褪绿斑驳 病毒
样品保存和复核 7.1样品的保存 经检验确定携带MCMV的样品应在合适的条件下保存,种子保存在4C.,其他繁殖材料采病叶经 液氮干燥后在一80C条件下保存
7.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括;样品的来源、种类,时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并要有实验人员 和审核人员签字
酶联免疫方法应有酶联反应的原始数据,PCR凝胶电泳检测应有电泳结果照片,荧 光PCR检测应附扩增图谱
GB/T31810一2015 7.3结果复核 检验结果的复核由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责,主要考察实验记录,照片等 资料的完整性和真实性,必要时进行复核实验
GB/T31810一2015 A.6病毒粒体形态 啊毒粒子为等轴对称二十面体(T一),用碎鸽股负染色直径约30mm,用醋股铺负染直径约为 33nm,无包膜,粒子外形呈六边形,有的被染色剂渗透,有180个蛋白结构亚基 A.7核酸 为单分子线形正义ssRNA,长4437nt,核酸占病毒粒子质量的18%
有的病毒粒子还偶尔含有 -个1100nt的亚基因组RNA A.8基因组 单分体基因组,RNA的3'端无Poly(A),5'端有一个序列为m7G5'PPPA的甲基化核苷酸帽子结 构
病毒基因组含有4个ORF,ORF1编码一个32ku蛋白,ORRF2编码50ku蛋白,对ORF2琥珀终 止密码子的超读使翻译持续到ORF2RT,产生一个1l1ku蛋白,该蛋白也可以在病毒RNA的体外翻 译中得到
ORF3编码一个9ku蛋白,推测对ORF3的UGA终止密码子超读产生一个33ku蛋白
ORF4编码25.1ku的外壳蛋白,在体内由共3'端亚基因组RNA表达产生
ORF1与ORF3编码蛋 白以及ORF3超读产物的功能目前还不清楚,ORRF2编码蛋白及其超读产物可能是病毒的聚合酶
A.9抗原特性 病毒外壳蛋白由一种多肽组成,分子质量为25.1ku
病毒具有中等到强的免疫原性,在凝胶扩散 中形成单条沉淀线,与其他一些禾谷类植物病毒无血清学关系 注:引自LommelSA
图A.1玉米褪绿斑驳病毒(MCMIV)在玉米上引起的症状
GB/I31810?2015 ?:l.ommelSA ?A.2??(MCM)?
GB/T31810?2015 ? B 淶?? ???(DAS-ELIsA) B.1? B.1.1 ???塣 B.1.2?? ????塣 B.1.3 (pNPP) B.1.410PBST?(pH7.4) (NaCD 80.0g (NaHPO, 11.5g (KHH,PO 2.0g ?(KcD 2.0g 5ml -20(Tween-20) 900mL??,pH7.4,??1L ???(pl7.4 B.1.5 10PBS'T 100ml 1.3g (NasO. 20 ??(PVP)(Mw2400040000) g (NaN,) 0.28 800mL??,pH7.4,??1L,4C档 B.1.6?(pH9.6) ?(Na,CO 1.59g ?(NaHco. 2.93g (NaN,) 0.2g 900mL??,pH9.6,??1L4 B.1.7??建?(pH7.4) 100ml 0PBST? ???(BSA 2g 20 ??(PVP)MW24000~40000) g
GB/T31810一2015 溶于800mL蒸僧水后,调节pH至7.4,定容至1L. B.1.8底物(pNPP)缓冲液(pH9.8 氯化镁(MgCl, 0.1g 叠氮钠(NaN,) 0.2g 二乙醇胺 97ml 溶于800ml蒸馏水中,调节pH至9.8,蒸馏水定容至1L,4C储存
B.1.9反应终止液 氢氧化钠(NaOH)120g溶于1000mL的无菌蒸僧水中,浓度为3mol/L
B.2试验步骤 B.2.1包被抗体 用包被缓冲液将包被抗体按说明比例稀释,加人酶联板的孔中,100AL/孔,加盖,37C孵育4h或 4C冰箱孵育过夜,清空酶联板孔中溶液,PBST洗涤4次一6次
B.2.2样品制备 取待测样品幼嫩叶片1g,按1:10质量:体积)加人样品抽提缓冲液,用研钵研磨成浆,充分振荡 混匀后室温保持10min.8000尽离心10min,上清液即为制备好的检测样品
用健康的植物组织作阴 性对照,用感染MCMV的植物组织作阳性对照,用样品抽提缓冲液作空白对照,阴性对照、阳性对照作 相同的处理
B.2.3加样 加人制备好的待测样品.阴性对照和阳性对照,100AL/孔
阳性对照,阴性对照和待测样品均应重 复1次
加盖后37笔孵育2h或4C冰箱孵育过夜,清空酶联板孔中溶液,PBST洗涤4次~6次
B.2.4加酶标抗体 用1×酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度,加人到酶联板中,100AlL/孔,加 盖,室温孵育2h,清空酶联板孔中溶液,PBST洗涤4次~6次
B.2.5加底物 将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/ml(现配现用),按100L/孔,加人到酶联板 中,室温避光孵育约0.5h2h,至阳性对照孔明显显色
必要时每孔加人50AL的3mol/1氢氧化钠 浓液终止反应
B.2.6读数 用酶标仪在405nm处读取吸光值
B.3结果判断 对照孔的oD值(缓冲液礼.阴性对照及阳性对照礼),应该在质量控制范围内,即 B.3.1
GB/T31810一2015 空白对照孔和阴性对照孔的OD值<0.15; 阳性对照OD值/阴性对照OD值>2; 同一样品的重复性基本一致 B.3.2在满足了B.3.1质量要求后,结果可判断如下 样品OD值/阴性对照OD值>2,判为阳性; 样品OD值/阴性对照OD值<2,判为阴性; 样品OD值/阴性对照OD值在2附近,判为可疑样品,应重新进行试验
B.3.3若满足不了B.3.1质量要求,则不能进行结果判断,应重新进行检测
GB/I31810一2015 附 录 c 规范性附录 玉米褪绿斑驳病毒RI-CR检测 C.1试剂 C.1.1RNA提取试剂 TRizoL裂解液、三氯甲烧、异丙醇、75%乙醇
C.1.2反转录试剂 M-MLVRT(200U/L),5×RT缓冲液,dNTP(10mmol/L),RNasin(40U/L). C.1.3PCR试剂 0×PCR缓冲液,氯化镁(25mmol/L),dNTP(10mmol/L)、Taq酶(5U/L)
C.1.4电泳试剂 C.1.4.150xTAE Tris 242g 冰醋酸 52.1mL 乙二胺四乙酸二钠 37.2g 加水定容至1L,用时加水稀释至1×TAE
c.1.4.26×加样缓冲液 0.25%澳酚蓝 40%质量分数)蔗糖水溶液 c.2实验步骤 c.2.1引物合成 依据玉米褪绿斑驳病毒外壳蛋白基因保守序列设计一对特异性扩增引物.见表C.1
表c.1引物序列 扩增片段长度 引物名称 引物序列 上游引物MCMV1 5'-CTAcCcGAGGTAGAAAGCAG-3" 429bp 下游引物MCMV2 5'-TTGTAGCTGAGGGCACCGATC-3'” C.2.2总RNA提取 使用Trizol法提取总RNA
称取1g植物叶片组织加液氮研磨成粉末状,迅速将其移人灭菌的 10o
GB/T31810一2015 1.5mL离心管中,加人1mlTrizol试剂,剧烈振荡摇匀3min;4C,12000g离心10min;取上清液 加人0.2ml.三氯甲烧，上下颠倒混匀,室温静置3min;4,12000g离心10min;取上层水相,加等体 积的异丙醇,颠倒混匀;4C,12000片离心10min,弃上清液;加75%的乙醇洗涤沉淀;4,7500g离 心2min ,弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后,溶于30LDEPC处理的超纯水中,用微量分光光度仪测 核酸的浓度和纯度，-20笔保存备用
C.2.3cDNA合成 nol/L) 反转录总体系为12.5L
在PCR管中依次加人1L总RNA,lL引物MCMV2(204m 65C温浴5min后迅速冰浴5 1,瞬间离心后向CR管中加人下列试剂 min， M-MLVRT(200U/L 0.5l 5×RT缓冲液 2.5l dNTP(10mmol/L 0.5l RNasin(40U/aL 0.5"l ddH.(O 6.5l 逆转录条件;37保温60min,70C15min灭活反转录酶
edDNA于-20C冰箱保存备用
c.2.4rCR扩增 PCR反应体系见表c.2,反应参数;955min;95C1min,6050s,7260s,35个循环 72C10min
也可采用商业化一步法RT-PCR试剂盒进行扩增
表c.2CR反应体系 试剂名称 加样量/L 10×PCR级冲液 2.5 Mg(C,(25mmol/L 2.5 MCMIV1(20Amol/L 0,5 McMv2(20pmol/L) 0,5 0.5 Taq酶(5U/L 1.0 cDNA模板 ddH.O 补足反应总体积为25Al C.2.5琼脂糖电泳 RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电沫分析,每个样品取5L扩增产物与lL的6×加样缓冲液 混合均匀点样,用DNAarker作分子标记,在1xTAE中以5V/cm的电压电泳50min,澳化乙锭溶 g/mL)染色10min,在凝胶成像系统上观察并记录结果 液(0.5 c.3结果判断 阳性对照在429bp左右处有扩增片段,阴性对照和空白对照无特异性扩增,待测样品出现与阳性 对照一致的扩增条带,判定为阳性
阳性对照、阴性对照和空白对照正确,样品未出现与阳性对照一致的扩增条带,判定结果为阴性
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GB/I31810一2015 附 录 D 规范性附录 玉米褪绿斑驳病毒实时荧光RT-PCR检测 D.1引物和探针 引物和探针见表D.1
表D.1引物和探针 引物编号 引物序列 扩增片段长度 5'-cCATGTccGAAATTcTGcTTG3' 上游引物MCMVTF 5'-GATGcGCACAGAGTTGAACAc-3' 179 下游引物MCMIVTR bp 序列MCMVP 5'-FAMCAGccATTTGGccGccccAAEdlpse8 D.2总RNA提取 操作方法见c.2.2. D.3eDNA合成 反转录总体系为12.5alL
在R管中依次加人1l总RNA,1L引物MCMVTR(20umol/L). 65C温浴5min后迅速冰浴5nmin,瞬间离心后向PCR管中加人下列试剂 M-MLVRT(200U/aL 0.5l 5×RT缓冲液 2.5ML dNTP(10mmol/L) 0.5L RNasin(40U/L 0.5AL ddH.o 6.5L 逆转录条件;37C保温60min,7015min灭活反转录酶
cDNA于一20C冰箱保存备用
D.4实时荧光R-PCR 以eDNNA为模板,进行实时荧光RT-PCR反应,反应体系见表D.2
实时荧光RT-PCR扩增参数为:95C2min,然后进行40个循环,每个循环95C5s;6030s
反应体系中各试剂的量根据具体情况或不同仪器可进行适当调整,也可采用商业化一步法或两步 法实时荧光RT-PCR试剂盒
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GB/T31810一2015 表D.2实时荧光RI-CR反应体系 试剂名称 加样量/山 l0× CR缓冲液 2.5 .25mmol/L 2.5 MgCl dNTP(10mmol/L 1.0 MCMVTF(204mol/L) 0.6 MCMVTR(20mol/L 0,6 MCMVP20mol/L) 0,6 Taq酶(5U/nl 0,5 cDNA模板 1.0 RNasefreedH.o 补足反应总体默为2山 D.5结果判定 实时荧光PCR反应结束后,应设置阔值
一般选择3个15个循环的阴性对照的10倍标准差作 为闵值,以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点,且Ct值等于40为准,且阳性对照和空白对 照结果正常
待测样品c值等于40,则可判定未检出玉米褪绿斑驳病毒
待测样品c值小于或等于35,则可判定检出玉米褪绿斑驳病毒
待测样品c'值在38一40之间,应重做实时荧光CR扩增
再次扩增后的结果Ct值为40,则判定 未检出玉米褪绿斑驳病毒
再次扩增后的结果值小于40而大于5,则可判定检出玉米谴绿斑驳 病毒
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GB/I31810一2015 参 考 文 献 [1]洪健,李德煤,周雪平.植物病毒分类图谱[M].北京;科学出版社,2001 [2]闻伟刚,张建成,崔俊霞,等.玉米褪绿斑驳病毒实时荧光RT-PCR检测方法研究[].植物检 疫,201l,25(1):39-42. transmissionofmaizechio roticmotlewir4s JensensG.Laboratory bythree speeiesofcorm [].PlantDisease,1985,69(10):864-868. rootworms [钉JiangxQ.MeinkeLJ,wrightRJ,etal.Maiechoroticmotleiru、inHawaiangrowm andassociatedviruses.CropProtection,l992,ll(3):248-254 maize:vectorrelations,hostrange L.ommelSA,KendalTL,SiuNF,etal.Characterizationofmaizechloroticmotleirus [E5 J.Phytopathology,1991,81:819-823. [6]NaultLR,StyerWE,CoffeyME,etal.Transmissionofmiechloroticmottleuirusby chrysomelidbeetles].Phytopathology,1978,68;1071-1074. [7]NiblettCLandClafinlE.CornlethalnecrosisanewvirusdiseaseofcorninKansasJ门. PlantDiseaset,1978,62:l5-19. I [8 NutterRC,ScheetsK,Panganiban C,etal.Thecompletenucleotidesequenceofthe maizechloroticmottleirusgenomeJ].NucleicAcid、Research,1989.17(8):3161-3177. XieL,ZhangJZ,WangQ,etal.Characterizationofaixechlorolicmoleirusassociated withmaizelethalneerosisdiseaseinChina].JournalofPhytopathology,2011,159(3);191-193. [10]UyemotoJK.Detectionofmai这echlorolicmolleirusserotypesbyenzyme-linkedimmu nosorbentassay[].Phytopathology,1980,70;290-292. 14
玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定方法GB/T31810-2015
玉米褪绿斑驳病毒简介
玉米褪绿斑驳病毒，又称玉米花叶病毒，是玉米病毒中的一种。该病毒在全国范围内广泛存在，能引起玉米花叶、穗叶和茎叶等部位的病害，导致玉米减产甚至死亡。因此，及早发现和正确鉴定玉米褪绿斑驳病毒对于保护玉米生产具有重要意义。
GB/T31810-2015标准介绍
GB/T31810-2015标准是我国规范检疫鉴定玉米褪绿斑驳病毒的技术要求和方法。该标准主要包括了样品采集、提取RNA、RT-PCR扩增、凝胶电泳分离和结果判定等环节，以及具体操作步骤和相关技术指标。
GB/T31810-2015标准的应用
GB/T31810-2015标准的实施使得玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定具有操作简便、稳定可靠、快速高效等特点，为防控病毒传播提供了有效手段。此外，该标准的推广还可以促进不同地区、不同单位之间的检测结果互认，保障了国家对某些重要物种的进出口贸易安全。
结论
GB/T31810-2015标准的出台对于规范玉米褪绿斑驳病毒检疫鉴定方法、保障粮食安全和农业经济发展具有重要意义。我们需要加强其推广和应用，不断提高我国的检疫技术水平。
