甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法

国家标准 GB/T28067一2011 甘蔗黄叶病毒实时荧光RI-PCR检测方法 DeteetionofsugareaneyelowleafvirususingtherealtimeRT-PCR 2011-12-30发布 2012-06-01实施 国家质量监督检监检疫总局 发布 国家标准花管理委员会国家标准
GB/T28067一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标淮起草单位;福建农林大学甘蔗综合研究所、农业部甘蔗及制品质量监督检验测试中心、农业 部甘蔗遗传改良重点开放实验室 本标准主要起草人;高三基,陈平华,陈如凯、郭晋隆,张华,许莉岸,王恒波,陈由强
GB/T28067一2011 甘蔗黄叶病毒实时荧光RI-PCR检测方法 范围 本标准规定了甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法所需的仪器与试剂、样品的采集与前处 理、操作方法以及结果判定 本标准适用于甘蔗植株、种苗及种茎中甘蔗黄叶病毒的快速检测、诊断 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 2. 反转录reversetranseriptiom 以RNA为模板合成DNA的过程,也称逆转录 实时荧光RT-PCRrealtieRT-PCR 实时荧光反转录-聚合酶链式反应 Ct值eyeletime 每个反应管内的荧光信号达到设定的阂值时所经历的循环数 缩略语 下列缩略语适用于本文件 RNA:核糖核酸 Taq酶:TaDNA聚合酶 dNTPs;4种脱氧核苷5'-三磷酸混合液 RNase:RNA酶 murineleukemin MMIV;莫洛尼鼠白血病病毒(Mooey nvirus)反转录酶 FAM:6-叛基荧光素 TAMRA:6-梭基四甲基罗丹明 方法原理 在反转录酶作用下将RNA反转录成cDNA,再以eDNA为模板利用Taq酶进行实时荧光PR扩 增反应(采用Ta4Mn探针方法) 在比对甘蔗黄叶稍毒外壳蛋白基因的基础上.设计一对仅在甘蔗黄 叶病毒外壳蛋白基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针 探针的5'端标记FAM荻 光素为报告荧光基团,.3'端标记TAMRA荧光素为悴灭荧光基团,结合部位位于目的扩增片段内部 当完整的探针与目的序列配对时,荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭,仪器检测不 到荧光信号;但在进行延伸反应时,Ta酶发挥5'一3'的外切核酸酶功能,将探针降解,使得荧光基团
GB/r28067一2011 与淬灭剂分离,所发出的荧光不再为淬灭剂所吸收而被检测仪所接受 随着扩增循环数的增加,释放出 来的荧光基团不断积累 因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系 甘蔗黄叶病毒基本信息 5 病毒粒体形态特征 甘蔗黄叶病毒粒体为二十面对称体,直径24nm一29nm,浮力密度1.30g/enm',由蛋白质外壳及 其包裹着的一条单链、正义的RNA(ssRNA)构成,病毒基因组大小约6kb 5.2寄主范围 自然寄主为甘蔗属中的热带种(Saccharumoficinarum),大茎野生种(Saccharumrobustum), nsi)和割手密(Saccharum 种(Saccharumsine Sbo7nla1eu 实验寄主包括蔗茅属(Eiu nthu4 ussp.)、小麦、燕麦、大麦、水稻、玉米和高粱等 在寄主植株内的分布主要局限于组织韧皮部内 5.3寄主症状 田间病症表现为甘蔗叶片中脉黄化,并向两侧扩展,中脉下表皮为鲜黄色，上表皮仍是正常的白色 或绿白色,有的染病品种叶片中脉两侧出现红褐色 染病植株叶片从叶尖开始干枯坏死,并向下扩展， 严重感病植株叶片发黄、坏死 由甘蔗黄叶病毒引起的这种病害称为甘蔗黄叶病(Sugarcaneyellow leafdisease),早期称为甘蔗黄叶综合症(sugarcaneyelowleafsyndrome). 分布地区 甘蔗黄叶病1989年首次发生在美国夏威夷,随后陆续在美国的弗罗里达州、德克萨斯州、路易斯安 那州以及巴西、澳大利亚、南非、、印度等30多个国家和地区出现并不断蔓延扩大 5.5传播途径 由甘蔗蚜虫(Melanaphissacchari),甘蔗绵蚜(Ceratowucwna 4 ua.lanigera)、玉米叶蚜(Ropaloihn maidis)和水稻根际蚜虫(Rhopalosiphumruiadominalis)传播,也可由感病的种茎传播,但不能通过 种子,机械摩擦方式传播 病毒的分类信息 国际病毒分类委员会(ICTV)第8次报告将甘蔗黄叶病毒列人黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷 叶病毒属(Polerowirus)中成员,英文名称为sugarcaneyelowleafvirus,缩写为SCYIV 仪器与设备 7.1实时荧光PCR检测系统 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 7.2 电子天平感量0.01g 7.3 7.4高速台式冷冻离心机:离心力12000g以上
GB/T28067一2011 7.5微量加样器:0.1AL一2.5L,0.5AL10AL,5L20L,10L100L,10AL200 0A 100Al~1000 7.6无RNA酶的离心管、,PCR反应管,Tip头,实时荧光PCR反应管 7.7恒温水浴锅 7.8鼓风干燥箱 心 7 g 冰箱2亿一4C一20c一80 试剂与材料 试剂 除另有规定外,所用试剂均为分析纯或生化试剂;所有试剂均用无RNA酶的容器分装 8.1.1三氯甲炕 8.1.2异丙醇 75%乙醇 8.1.4无RNase水及双燕水 8.1.5裂解液;主要成分为异硫氢酸肌和苯酚,为RNA提取试剂 e抑制剂、M-MLV反转录酶， 8.1.6 5X反转录反应混合液;含5X反转录反应缓冲液.dNTP.RNaet 具体配制方法参见附录A 8.1.7检测引物 5'-引物;5'-TTCcAGTATAACTcATGCTrccTccG-3" 3’-引物;5'-ACTTTCTTGGCGTTcCTCTTG3’ 扩增片段大小为130bp 8.1.8TaqMan探针;5'-FAM-cGCAAcTcCAGGTGCAATcGc-TAMRA-3’ 含有EXT4荧光RR反应混合被 8.1.9 含有2×EXTaq荧光PCR反应液、5'-引物、3’-引物、TaqMan探针,具体配制方法参见附录A 8.2材料 8.2.1阳性对照;用已知含甘蔗黄叶病毒的样品作阳性对照 阴性对照;用已知不含甘蔗黄叶病毒的样品作阴性对照 8.2. 2 样品的采集与前处理 取样工具 3 砍刀、剪刀、辍子等取样工具应经121C士2C、1.1×10Pa高压灭菌15min或经160C干烤 2h 9.2采样方法 9.2.1采样过程中应避免样本交叉污染,采样及样品前处理过程中应戴一次性手套 9.2.2叶片样品,取甘蔗植株或种苗最高可见肥厚带叶上一叶(一1叶)叶片,编号备用 1 用无RNase水配制
GB/r28067一2011 9.2.3蔗茎样品;取甘蔗植株可见肥厚带叶下两叶(十3叶)对应的蔗茎,若为甘蔗蔗种,取中部种茎， 编号备用 9.3存放与运送 采集或处理的样本在2C8C条件下保存应不超过24h;若需长期保存,要求放置-80C冰箱 但应避免反复冻融 采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,或用液氮处理,尽快运送到实 验室 10操作方法 10.1总RNA的提取 10.1.1取1.5mL无RNA酶的离心管,并对每个管进行编号 10.1.2称取0.2g样品材料(蔗茎样品要去除表皮),并用液氮研磨成粉末状(要保持液氮不挥发干 净) 10.1.3向1.5mL离心管中加人粉末,等液氮刚挥发完立即加人1ml裂解液,盖上管盖,振荡混匀， 于4C、12000g离心10min 吸取上清液至另一新的离心管中,加人0.2mL三氯甲烧,盖住管盖,剧烈振荡混匀约15s,室 温静置3 后,于4C、12000g离心15min. min 10.1.5吸取上清液至另一新的离心管中,加人0.5ml预冷的异丙醇(一20),颠倒混匀,室温静置 10 nmin后,于4C,12000离心15min 离心管开口保持朝离心机转轴方向放置) 10.1.6小心倒出离心管中上清液,加人 ml 75%预冷的乙醇(一20)洗涤,颠倒离心管2次3次 7500g离心5 离心管开口保持朝离心机转轴方向放置) 重复洗涤沉淀1次 min 10.1.7小心倒出离心管中上清液,用微量加样器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有 沉淀的一面,室温干燥10min15nmin 提 10.1.8加人50L无RNase水,轻轻混匀溶解管壁上的RNA.2000g离心5s,冰上保存备用 取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增;若需长期保存,应放置一80C冰箱 10.1.9取5LRNA溶液加无RNase水稀释至1mL,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计上测 260nm和280nm处的吸光值A和A RNA浓度按式(1)计算 C=A×N×40/1000 式中: -RRNA浓度,单位为微克每微升(g/pL); A 260nm处的吸光值; N RNA稀释倍数 当A/A比值在1.8一2.0之间时,适合于实时荧光RT-PCR扩增 10.2反转录 10.2.1取1.OLRNA(约2.0E/aL)1.0L反转录引物(3'"-引物)和8.0ALDEPC水加人到无 RNase的PCR管中,7015min 10.2.2冰浴2min 加人反转录反应混合液,每个测试样本反转录反应混合液配制参见表A.1 轻微混匀,5008 10.2.3 离心30s,42C1h,75"C8min 反应结束后,可以直接进行实时荧光PCR检测,或者放于一20C保 存备用
GB/T28067一2011 10.3 实时荧光PCR反应 10.3.1荧光PCR扩增试剂准备与配制 从试剂盒中取出含有EXTaq荧光PCR反应液,在冰上融 化后,2000g离心5s 每个测试样本反应混合液配制参见表A.2 10.3.2根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量,全部加完后,充分混合均匀,2000！离心5s 向每个实时荧光PCR管中各分装24.0AL 10.3.3在各设定的实时荧光PCR管中分别加人10.2.3中反转录产物各1.0AL(eDNA约10ng 100 ne),盖紧管盖后,轻微混匀,500发离心30 10.3.4将10.3.3中加样后的实时荧光PCR反应管放人荧光PCR检测仪内,记录样本摆放顺序 实 时荧光PCR反应条件随不同仪器略有改变，一般的反应程序为9510s,1个循环;95C5s,60C30s. 40个循环,在每次循环的延伸阶段收集荧光 结果判断与表述 11 11.1结果分析条件设定 读取检测结果 闵值设定原则以闵值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,结果显示阴 性为准 或可根据仪器噪音情况进行调整 11.2对照结果 检测过程中分别设阳性对照,阴性对照和空白对照 用已知含甘蔗黄叶病毒的样品作阳性对照,用 已知不含甘蔗黄叶病毒的样品作阴性对照,用等体积的无RNase水代替模板RNA作空白对照 空白对照;无Ct值且无扩增曲线 阴性对照:无Ct值且无扩增曲线 阳性对照的Ct值应<30.0,并出现典型的扩增曲线 否则,此次实验视为无效 11.3检测结果的判定 11.3.1阴性 无Ct值且无扩增曲线,表示样品中不含甘蔗黄叶病毒 11.3.2阳性 C值<35.0,且出现典型的扩增曲线,表示样本中含甘蔗黄叶病毒 11.3.3有效原则 C值>35.0的样本应重做 重做结果无Ct值者为阴性,否则为阳性 11.4结果表述 该试样中检出甘蔗黄叶病毒 该试样中未检出甘蔗黄叶病毒
GB/r28067一2011 附 录A 资料性附录 甘蔗黄叶病毒反转录反应与实时荧光PCR扩增反应混合液配制 表A.1每个测试样本反转录反应混合液配制的组分及使用量 试 剂 使用量 25AL反应体系终浓度 5×反转录反应缓冲液(MgPlus) 5.0Al 10mmol/1dNTPs 1.0l 0,4mmol/I 10U/L.RNase抑制剂 5U/28儿 0.5AL 200U/25 200U/L.MMLV反转录彤 1.0Al 15Al 无RNase水 7.5 Al 总体积 15.0AL 每个测试样本荧光PCR扩增反应混合液配制的组分及使用量 表A.2 试 剂 25AlL反应体系终浓度 使用量 2×荧光PCR反应液(含Tao酶) 2.5l 5 -引物(104mol/1 1.0l 0,4mol/1 3'-引物(10xmol/L 1.0L 0,4Amol/L 炎光探针(10mol/L 1.0l 0.4Amol/1 双燕水 8.5l 总体积 24.0Al 探针浓度与使用的实时荧光PR扩增仪、探针种类,荧光标记物质种类有关,实际使用时请参照仪器说明书 2 或各荧光探针的具体使用要求进行

甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法GB/T28067-2011详解

引言

甘蔗是我国重要的经济作物之一，然而甘蔗黄叶病毒是甘蔗生产中常见的病毒性病害之一。为了保障甘蔗生产和贸易安全，需要对甘蔗进行病毒检测。本文将介绍一种符合GB/T28067-2011标准的实时荧光RT-PCR检测方法。

GB/T28067-2011标准概述

GB/T28067-2011是我国农业部颁布的《植物检疫技术规范 甘蔗黄叶病毒检疫鉴定方法》标准，适用于甘蔗黄叶病毒的检测鉴定。

实时荧光RT-PCR检测方法

将取样组织进行RNA提取和cDNA合成后，采用特异性引物与甘蔗黄叶病毒RNA结合，进行PCR扩增。同时，添加荧光探针以检测PCR反应过程中产生的荧光信号。根据荧光信号的变化，判断样品中是否存在甘蔗黄叶病毒。

检测灵敏度和特异性

该方法的检测灵敏度高，能够检测到1pg的甘蔗黄叶病毒RNA。同时，经过多次验证，该方法具有良好的特异性，在同属于甘蔗科的其他植物中未出现假阳性结果。

优点与应用前景

相比于传统的病毒检测方法，实时荧光RT-PCR检测方法具有操作简便、高灵敏度、高特异性等优点。在保障甘蔗及其制品质量安全、促进甘蔗生产和贸易发展等方面具有广阔的应用前景。

结论

GB/T28067-2011标准提供了一种简单、快速、准确的甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法，为甘蔗生产和贸易安全提供了有力的技术支持。

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