动物源性食品中庆大霉素残留量检验方法酶联免疫法

动物源性食品中庆大霉素残留量检验方法酶联免疫法

国家标准 GB/T21329一2007 动物源性食品中庆大霉素残留量 测定方法酶联免疫法 Methodforthedeterminationofgentamieinresiduesinanimal originalfo0d一Enzyme-linkedimmun0sorbentassay 2007-10-31发布 2008-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T21329一2007 前 言 本标准的附录A、附录B为资料性附录 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 本标准起草单位:浙江出人境检验检疫局 本标准主要起草人:施伟良、张晓峰,方莹、谢文,朱振江 本标准系首次发布的国家标准
GB/T21329一2007 动物源性食品中庆大霉素残留量 测定方法酶联免疫法 范围 本标准规定了肉类、内脏、水产品、牛奶和奶粉中庆大霉素残留量的酶联免疫测定方法 本标准适用于肉类、内脏,水产品、牛奶和奶粉中庆大霉素残留量的测定 本标准的方法检出下限:肉类和水产品为10.04g/kg;内脏、牛奶和奶粉中为20.04g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注明日期的引用文件,其随后所 有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研 究是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注明日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379(所有部分)测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一1992,neqIsO3696;1987) 原理 微孔板中包被有绵羊抗兔lgG抗体,加人特异性抗体(兔抗庆大霉素抗体)、酶标记庆大霉素、庆大 霉素标准品或样品后,特异性抗体与包被的绵羊抗兔lgG抗体结合,同时游离庆大霉素和酶标记庆大 霉素竞争性的与特异性抗体结合 通过洗涤除去未结合的庆大霉素和酶标记庆大霉索,然后加人底物 显色,用酶标仪测定吸光度,根据吸光度值得出试样中庆大霉素的含量 试剂和材料 除去另外说明外,所有试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 庆大霉素检测试剂盒(组成参见附录A) 4.2三氯乙酸 4.3氯化钠. 44氧化钾 4.5磷酸二氢钾 4.6磷酸氢二纳 4.7磷酸二氢钠 4.8吐温-80. 493%三氯乙酸;称取3g三叙乙酸(4.2),用水定容至100mL 4.10PIs缓冲液18.5只叙化钠,1.15只磷酸氢二钠,0.27只磷酸二氢钠用水定容至1L 4.11sDB缓冲液;1.15只磷酸氢二钠,0.2只磷酸二氢钾.0.2只氧化钾,30只氯化钠,0.5mL吐 温-80,用水定容至1L 正已婉 4.13庆大霉素标准品为USP级 4.14庆大霉素标准品溶液的配制:用灭菌水作为溶剂配制成50mg/ml的储存液,于一20C条件 下保存
GB/T21329一2007 仪器 5.1酶标仪 5.2八道移液器;50L300 0L 5.3单道移液器5L一50L.I00L~1o00L和2ml一10mL. 5.4混合振荡器 5.5离心机 5.6具塞试管;20mL.,50mL. 试样的制备与保存 试样的制备 对组织样品:从全部样品中取有代表性样品,混匀,用四分法缩分出不小于1000g试样,去除脂 肪、充分绞碎混均、分装、密封,并加以标识 对牛奶和奶粉从原始包装中取有代表性样品,充分混匀,用四分法缩分出不小于500g试样,装人 清洁密闭容器,加封后标明标记 试样的保存 将样品于一18C一一20C条件下保存 分析步骤 提取 组织 称取2.5g去脂肪均质样品,精确到0.1g,置于50mL具塞试管中,加人5mLPBS缓冲液(4.10) 振荡10min,加人10mL.的3%三氯乙酸(4.9)涡旋10min,6000r/min离心15min 取3nmL上清液 于一干净试管,再加人2mL正已烧(4.12)混合;3000r/min离心10min,吸取150L下层液体加 50AL的sDB(4.11)缓冲液,调节pH至7.5左右 最后稀释倍数为20. 7.1.2牛奶 牛奶样品先离心去脂肪,然后以sDB缓冲液(4.11)直接做10倍稀释;对于奶粉则可以先用与样品 质量相等的水进行稀释溶解,离心去脂,然后再以SDB缓冲液(4.11)做5倍稀释,调节pH至7.5左 右,最后稀释倍数为10 7.2测定条件 7.2.1酶标仪测定条件 酶标仪测定波长为450nm. 7.2.2洗板条件 7.2.2.1人工洗涤次数5次以上,每次注水量为250AL 自动洗板可以预定5次周期 7 .2.2. 2 7.2.3操作条件 所有操作应在室温下(20C24C)进行,庆大霉素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温 (20C24C)后方可使用 测定步骤】 将测定需用的微孔板备齐并插人微孔架上,记录标准品及样品等在微孔架上的位置 给出该信息是为了方便本标准的使用者,并不丧示对某一产品操作步骤的认可 如果其他产品的操作步骤有不 同,需经实验评估后采用
GB/T21329一2007 7.3.2吸取100L零浓度标准品于孔Al、A2;并吸取50L零浓度标准品于孔B1、B2;分别吸取 50AL庆大霉素标准溶液(0.25,0.5、1.0,2.0,10.0,50.0ng/mL.)于c1,C2一Hl、H2;吸取50L样品 溶液于其余微孔中 7.3.3分别吸取25L庆大霉素酶标记物溶液于除Al、A2外的每一个微孔 7.3.4分别吸取25L庆大霉素抗体溶液于除A.A2外的每一个微孔 7.3.5用封口膜封孔条,并持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀 7.3.6将酶标板置于4C避光孵育1 7.3.7倒出孔中的液体,将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打,以除去孔中过多的残液,但不能使微孔干 燥 再立即用洗涤缓冲液按7.2.2条件进行洗板,要注意不能使微孔干燥 7.3.8迅速加人100L底物溶液于每一个微孔底部,持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后,于 20C24C避光孵育30min 7.3.9迅速加人100Al反应终止液于每一个微孔 持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后,将微 孔架置于酶标仪中,在450nm处测量吸光度(加人反应终止液后应在30min内读取吸光度 注，测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头 平行试验 拨以上步猴,对同一标准溶液.同一样品游液均应进行平行试验测定 7.5空白试验 除不称取试样外,均按上述步骤进行 7.6监控试验 每次测定均应做一个添加庆大霉素标准(4.14)的样品 结果计算 从含有标准品和样品的板孔的吸光度(OD)值中,减去空白孔A1、A2的平均OD值 标准品和样 品的OD平均值除以零标准(B1、B2)的平均OD值,再乘以100 零标准为100%(最大吸光度值),其他 OD值为最大吸光度值的百分数 在半对数坐标纸上,以吸光度值为纵坐标(%),庆大霉素标准溶液浓度(ug/L)为横坐标,绘制标准 工作曲线 从标准工作曲线上得到试样中相应的庆大霉素浓度后，结果按式(1)进行计算 cXX100o X一 mX1000 式中; 样品中庆大霉素的残留量,单位为微克每千克(" g/kg); g -从标准工作曲线上得到的样品中庆大霉素浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL) 样品溶液的最终定容体积,单位为毫升(mL) 样品溶液所代表的最终试样质量,单位为克(g). 777 注:所得结果应表示至一位小数 也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算 确证试验 如被测样品中庆大霉素残留量的值大于限量要求时,应用其他方法进行确证 回收率参见附录B
GB/T21329一2007 附录A 资料性附录) 庆大霉素试剂盒？ A.1预包被抗体的96孔板;12条×8孔 A.2庆大霉素标准溶液:0,0.25,0.5、1.0,2.0,l0.0,50.0ng/mL 3 庆大霉素酶标记物冻干粉;根据庆大霉素试剂盒中说明,可用稀释缓冲液配制成庆大霉素酶标记 A. 物溶液 A.4抗庆大霉素抗体冻干粉;根据庆大霉素试剂盒中说明,可用稀释缓冲液配制成抗庆大霉素抗体 溶液 A.5底物TMB溶液 A.6稀释缓冲液;根据庆大霉素试剂盒中说明,可用水配制成洗涤缓冲液 A.7洗涤浓缩液(10倍浓缩);可用水稀释后使用 4 反应终止液 注，试剂盒应在4C一8C避光条件下保存,溶解后的酶标记物和抗体溶液需在一15C条件下冻存 2给出该信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对某一产品的认可 如果其他产品具有相同的效果,需经实 验评估后使用这些等效产品
GB/T21329一2007 附 录 B 资料性附录) 回 收 率 本方法中庆大霉素添加浓度及回收率的试验数据: a)组织样品(包括水产品): -舔加量为104g/kg时,平均回收率为83.9%~97.3% -添加量为504g/kg时,平均回收率为86.8%94.8%; -舔加量为5004g/kg时,平均回收率为88.0%96.5% b 肝、肾样品 添加量为204g/kg时,平均回收率为90.2%一99.4% 添加量为2004g/kg时,平均回收率为93.0%一97.4% 添加量为10004g/kg时,平均回收率为93.0%97.4%; 牛奶样品 -添加量为204g/kg时,平均回收率为95.6%; -添加量为200g/kg时,平均回收率为88.2% 添加量为10004g/kg时,平均回收率为93.7%