消毒剂安全性毒理学评价程序和方法

消毒剂安全性毒理学评价程序和方法

国家标准 GB/T38496一2020 消毒剂安全性毒理学评价程序和方法 Toxielogiealpreeduresandmethodsofsafetyevaluationfordisinfeetant 2020-03-06发布 2020-10-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/38496一2020 目 次 前言 范围 2 术语和定义 消毒剂安全性毒理学评价程序 消毒剂毒理试验项目确定原则 毒理试验用受试物的要求 消毒剂安全性评价的毒理试验方法 6. 急性经口毒性试验 11 6.2急性吸人毒性试验 13 6.3皮肤刺激试验 15 6.4急性眼刺激试验 6.5阴道黏膜刺激试验 17 6.6皮肤变态反应试验 1 6.7亚急性经口毒性试验 6.8致突变试验 22 32 6.9亚慢性毒性试验 6.10致畸胎试验 33 6.11慢性毒性试验 34 6.12致癌试验 35 对消毒剂的安全性评价 37
GB/38496一2020 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由国家卫生健康委员会提出并归口 本标准起草单位:疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、湖北省疾病预防控制中心、 上海市疾病预防控制中心 本标准主要起草人:金银龙、班海群,李毅民张流波、黄晓波、肖萍、王有森
GB/38496一2020 消毒剂安全性毒理学评价程序和方法 范围 本标准规定了消毒剂安全性毒理学评价的程序、确定毒理试验项目的原则、对毒理试验用受试物 受检消毒剂样品)的要求、毒理试验方法和对毒理试验结果的安全性评价 本标准适用于在我国生产或国外生产在我国销售和使用的消毒剂以及器械或装置产生的消毒剂的 毒理学安全性评价 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 2.1 新消毒剂newdisinfectants 利用新材料、新工艺技术和新杀菌原理生产的消毒剂 消毒剂安全性毒理学评价程序 3.1评价程序要求 消毒剂安全性毒理学评价程序采用分阶段系统法,逐阶段进行毒理试验,毒理试验依次分为四个阶 段,如果前一阶段毒理试验结果不符合安全性要求,应增做其后阶段相应的毒理试验 3.2消毒剂安全性评价毒理试验 3.2.1第一阶段试验,包括 急性经口毒性试验 a b) 急性吸人毒性试验 皮肤刺激试验 c -次完整皮肤刺激试验， 22) -次破损皮肤刺激试验 多次完整皮肤刺激试验 3 急性眼刺激试验 d 阴道黏膜刺激试验 ee 皮肤变态反应试验 f 3.2.2第二阶段试验,包括 亚急性毒性试验 a b 致突变试验: 体外哺乳动物L5178Y细胞基因突变试验(体细胞基因水平,体外试验); 22) 体外哺乳动物V79细胞基因突变试验(体细胞基因水平,体外试验); 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验体细胞染色体水平,体外试验) 3 4 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验(体细胞染色体水平,体内试验);
GB/T38496一2020 5 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验(体细胞染色体水平,体内试验); 6 程序外DNA修复合成试验DNA水平,体外试验); 7)小鼠精原细胞染色体畸变试验(性细胞染色体水平,体内试验 3.2.3第三阶段试验,包括 a 亚慢性毒性试验; b 致畸胎试验 3.2.4第四阶段试验,包括: 慢性毒性试验; a) 致癌试验 b) 消毒剂毒理试验项目确定原则 4.1原则要求 确定毒理试验项目,取决于消毒剂的特点,使用范围和安全性评价前一阶段毒理试验的结果 消毒剂必做的毒理试验项目 消毒剂均应进行以下试验项目: a 急性经口毒性试验; b)1项致突变试验 4.3消毒剂增做的毒理试验项目 根据消毒剂使用范围,除4.2必做的2项毒理试验外,分别增做以下试验 使用于室内空气的消毒剂,增做急性吸人毒性试验和急性眼刺激试验 a 使用于手和(或)皮肤的消毒剂 b) 偶尔使用或间隔数日使用的消毒剂,增做一次完整皮肤刺激试验; 1 手消毒剂增做多次完整皮肤刺激试验 3 接触破损皮肤(包括用于注射部位、手术切口部位消毒)的消毒剂,增做一次破损皮肤刺激 试验 ！ 接触创面(包括用于外科换药、烧伤皮肤消毒)的消毒剂,增做一次破损皮肤刺激试验和急 性眼刺激试验 c 使用于黏膜的消毒剂,增做急性眼刺激试验,使用阴道黏膜消毒的,增做阴道黏膜刺激试验 d 使用于游泳池水的消毒剂,增做急性眼刺激试验 e 在消毒过程中接触手和(或)皮肤的消毒剂增做一次完整皮肤刺激试验 4.4新消毒剂增做的毒理试验项目 44.1在我国首次生产和(或)销售含有新的杀菌主要成分的新消毒剂,应做的毒理试验 急性经口毒性试验(包括小鼠和大鼠) a 亚急性经口毒性试验; b 3项致突变试验(包括反映体细胞基因水平、体细胞染色体水平和性细胞染色体水平三种类型 c 试验); d 亚慢性经口毒性试验; 致畸胎试验 e 4.4.2根据消毒剂的成分,可能有致敏作用的,增做皮肤变态反应试验
GB/38496一2020 毒理试验用受试物的要求 5.1受试物应是按照消毒剂生产者既定的生产工艺和配方进行规范化生产的消毒剂,其成分和浓度应 与实际生产和销售的相同 5.2生产者应提供受试物的物理、化学性质的资料(包括消毒剂的配方,杀菌有效成分的化学结构和含 量、pH等,但植物消毒剂可不提供化学结构. 5.3在急性经口毒性试验,急性吸人毒性试验,亚急性毒性试验、致突变试验、亚慢性毒性试验,致畸胎 试验、慢性毒性试验和致癌试验时,采用消毒剂原形样品 消毒剂原形是指在销售过程中原包装的粉 剂、片剂或原液 对于二元包装的消毒剂,按产品使用说明比例混合配制后作为消毒剂原形样品 5.4在皮肤刺激试验、急性眼刺激试验和阴道黏膜刺激试验中所用样品的浓度,应是对皮肤、黏膜消毒 时应用浓度的5倍 对使用产品原液对皮肤、黏膜进行消毒的消毒剂,则采用消毒剂原液作为试验 样本 5.5在皮肤变态反应试验时,采用的诱导浓度应为引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度或原液,激发浓 度应为不引起皮肤刺激反应的最高浓度或原液 消毒剂安全性评价的毒理试验方法 6.1急性经口毒性试验 6.1.1 目的 6.1.1.1检测消毒剂对实验动物的急性毒性作用和强度 6.1.1.2为亚急(慢)性毒性试验和致突变试验提供剂量选择的依据 6.1.2实验动物 小鼠或大鼠任选一种,雌雄各半 小鼠体重18g一22g,大鼠体重180g一220迟,根据不同的急性 毒性试验设计方法,选用适当的动物数量,通常分为4个~6个剂量组 一般小鼠每组选用8只10只 动物,动物总数不少于50只;大鼠每组选用5只6只动物,动物总数不少于30只 6.1.3试验分组 6.1.3.1概率单位-对数图解法;计算LD,,随机分为5个一6个剂量组 通常最高剂量组的动物死亡 率应大于或等于90%,最低剂量组动物死亡率应小于或等于10% 可先以较大的组距,对少量动物进 行预试验,找出其粗略致死剂量范围,然后再设计正式试验的剂量分组 6.1.3.2霍恩(Horm)法;则可先通过预试验找出其粗略致死剂量范围,然后按照1.0,2.15、4.64乘以4" t=0、士1、士2、士3),或者按照1.0,3.16乘以1l"(t=0、士1、士2、士3)的方法设4个~5个剂量组 6.1.4操作程序 6.1.4.1 动物的准备;试验前,禁食过夜,不限制饮水 6.1.4.2受试物的配制:用水或食用植物油为溶剂配制成溶液,或采用0.5%羚甲基纤维素配制成混 悬液 6.1.4.3染毒方法;用灌胃方式将受试物一次给予动物 一般小鼠灌胃量不超过0.2mL/10g体重,大 鼠灌胃量不超过1.0ml/100g体重 若受试物毒性很低，一次灌胃容量太大,可在24h内分成2次 3次给予,其总剂量作为一日剂量计算
GB/T38496一2020 6.1.4.4染毒后观察动物的中毒表现和死亡数及死亡时间,并对死亡动物和观察期满处死动物进行尸 体解剖,肉眼观察,发现有异常的组织或脏器,尚需进一步作组织病理学检查 观察时间14d. 6.1.4.5根据给予受试物后14d内的各剂量组动物死亡率计算LD.(半数致死剂量) 6.1.5LD.的计算方法 6.1.5.1概率单位-对数图解法 6.1.5.1.1根据各剂量组动物死亡率,从表1中查各组的概率单位 因死亡率为0%和100%的概率单 位,与所试动物数有关,故应另在表2中查找 示例:某组死亡率为45%的概率单位,查表1 先在表的左侧第一列上找到40,而后在表的第一行找到5,两者交叉 点处的4.87,即为45%的概率单位 某组用10只实验动物,如果全部存活死亡率为0%),查表2,其概率单位为3,04 表1百分率-概率单位换算表 死亡率的个位数 死亡率的 十位数 2.67 2.95 3.12 3,25 3.36 3.45 3,52 3.59 3,66 3.77 10 3.96 4.001 3,72 3.82 3.87 3.92 4.005 4.008 4.12 4.16 4.19 4.23 4.26 4.29 4.2 4.45 20 4.33 4.36 4.39 30 4.48 4.5o 4.53 4.56 4.59 4.61 4.64 4.67 4.69 4.72 40 4.75 4.77 4.80 4.82 4.85 4.87 4.90 4.92 4.95 4.97 50 5,00 5.003 5,005 5.008 5,.10 5.13 5.15 5.18 5.20 5.23 60 5.39 5.25 5.28 5.31 5.33 5.36 5.41 5.44 5.47 5.50 70 5.52 5.55 5.58 5.61 5.64 5.67 5.71 5.74 5.77 5.81 80 5.84 5.88 5.92 5.95 5.99 6.04 6,08 6.13 6.18 6.23 6.4] 6.55 6.75 7.05 90 6.28 6.34 6.48 6.64 6.88 7.33 表2相应于反应率为0%及100%的概率单位 反应率 反应率 该组动物数 该组动物数 0% 100% 0% 100% 11 3.00 7.00 12 3.85 6.15 2.97 7.03 3.62 13 6,38 2.93 7.07 3.47 6.53 14 2.90 7.10 15 3,.36 6.64 2.87 7.13 3.27 6.73 16 2.85 7.15 3.20 6.8o 17 2.82 7.18 3.13 6.87 18 2.80 7.20 3.09 6.91 19 2.78 7.22 2o 10 3.04 6.96 2.76 7.24
GB/38496一2020 6.1.5.1.2用方格纸绘散点图,横轴表示剂量的对数值(r),纵轴为概率单位值(y),将各组数值点在 图上 6.1.5.1.3按各点的分布趋势,用直尺绘出一条最适合于各点的直线,使线上方的点到线的总距离与线 下方的点到线的总距离相近,此线应尽量靠近概率单位为5的点及附近的点 6.1.5.1.4查出求概率单位5处的剂量对数,其反对数即为ID.a 6.1.5.1.5按式(1),式(2)和式(3)计算LD的95%可信限 黑，.Z， S y" y 式中: LD.的标准差; 概率单位等于4; y 概率单位等于6:; y 概率单位等于4(y)时相应的剂量对数值 心 概率单位等于6(y2)时相应的剂量对数值 .， 2 式中 S LD的标准误 N 概率单位y(=4)及y.(=6)相应的死亡率间所用的动物数 log(LD.)的95%可信限=log(LDm)士1.96s 式中 LD -半数致死剂量; s LD.的标准误 注:式(3)结果,经反对数变换后,可得LD的95%可信限 6.1.5.2霍恩法 根据各剂量组动物死亡率,从表3或表4查出其相应的LD值和95%可信限 表3用于每组5只 动物,组距剂量递增公比为V,即10×V=21.5,21.5×V一46.4,,以此类推 此剂量系列排列 表4用于每组5只动物,组距剂量递 如下:l.00×10'、2.15×10'、4.64×10',,t=0、士1、士2、士3、 增公比为,即10×、=31.6,31.6×/=100,,余此类推 此剂量系列排列如下1.00×10、 3.16×10'、10,.0×10'、,/=0、士1、士2、士3、 表3每组5只动物、组距/0倍LD.值和95%可信限 剂量组 剂量1=0.464x1o" 剂量1=1.00×1o" 剂量1=2.15×10" 各剂量组动物死亡数 剂量2=1.00×10 剂量2=2.15×10 剂量2=4.64×10" 剂量3=2.15×10" 剂量3=4.64X1o" 剂量3=10.0×10 剂量4=4.64×10" 剂量4=10.0×10'" 剂量4=21.,5×10" 1组2(3)组3(2)组 4组 可信限 LDm LD 可信限 LD 可信限 2.00 l.372.9 4.30 2.95~6.26 9.26 6.3613.5 1.7 1.26~2.33 3.69 2.715.01 7.94 5.8410.8
GB/T38496一2020 表3(续 剂量组 剂量1=0,464×10 剂量1=1.00×10 剂量1=2.15×10" 各剂量组动物死亡数 剂量2=1.00×1o' 剂量2=2.15×10' 剂量2=4.64×1o' 剂量3=2.15×10' 剂量3=4.64×10 剂量3=10.0×10" 10.0×10o 剂量4- 剂量4 剂量4- 4.64Xl0 =21.5×l0" L.D 可信限 ID 可信限 可信限 1组23)组 3(2)组4组 LD 1.47 3.16 6.81 2.00 1.233.24 4.30 2.65~6.98 9.,26 5.70~15,00 1.71 1.05~2.78 3.69 2.275,99 7.94 4.8912.9 1.47 0.951~2.27 2.05一4.88 4.4110.5 3.l6 6.81 1.26 0.9261.71 2.71 2.003.69 5.84 4.30~7.94 1.71 1.01~2.91 3.69 2.176.28 7.94 4.6713.5 l.47 0,.862一2.50 3.16 1.865.38 6,81 4.00~13.5 1.26 0.7752.05 2.7 l.694.41 5.84 3.60一9.50 1.08 0.,7411.57 2.33 l.603.99 5.001 3.44一7.30 1.26 0.,7402.14 2.71 1.594.62 5.84 3.43一9.95 1.03 0.6651.75 2.33 1.43~3,78 5,001 3.08一8.14 1.96 1,223.14 4.22 2.63一6.76 9,09 5.66~14.6 1,62 1,07~2,43 3.48 2.315.24 7.50 4.98~l1.3 6,19 4.87~7.87 1.33 l.05~1.70 2.87 2.26~3,65 1.96 1.063,6o 4.22 2.297.75 4.941.67 9,09 1.62 0.866~3,01 3.48 1.876,.49 7.50 4.02~16,7 1.33 0.7372.41 2.87 1.595.20 6.19 3.421l1.2 1.10 0.66ll.83 2.37 1.42~3.95 5.1l 3.0078.51 1.62 0.8183.19 1.766.37 3.80~14.8 3.48 7.50 1.33 0.6582.70 2.87 l.425.82 6.19 3.05~12.5 l.10 0,.550~2.20 2.37 1.194.74 5.11 2.55一10.2 0.523一2.32 2.37 1.13一4.99 2.4310.8 1.10 5.1l 1.90 1.003.58 4.008 2.16~7.71 8.80 4.66~16.6 1.47 0.,8062.67 1.74一5.76 3.74~12.4 3.16 6.81 1.14 0.674~1.92 2.45 1.45一4.13 5.28 3.138.89 1.90 0.8394.29 4.08 1.819,23 8,.80 3.89~19.9 l.47 0.616~3.50 3.16 1.33~7.53 6,.81 2.86~16.2 l.14 0.466一2.77 2.45 l.005.98 5,28 2.1l6~12.9 1.47 0.573~3.76 1.248.1o 3.l6 6.81 2.66一17.4
GB/38496一2020 表3(续 剂量组 剂量1=0.464×10 剂量1=1.00×10" 剂量1=2.15×10" 各剂量组动物死亡数 剂量2=1.00x10' 剂量2=2.15×10' 剂量2=4.64×10 剂量3=2.15×10 剂量3=4.64×10 剂量3=10.0×10" =4.64×10" -10.0×10' 剂量4- 剂量4- 剂量4- =21.5×l0 LD 可信限 LD 可信限 LD 可信限 1组2(3)组3(2)组4组 0.406一3.18 2.45 0.875一6.85 1.14 6.28 1.89一14.8 1.18一3,26 4.22 2.537.02 9.09 5,46~15,1 1.96 1.62 1.27~2.05 3,48 2,744,42 7.50 5,90~9,53 1.96 0.978~3.92 2.118.44 9.09 4.5418.2 4.22 1.62 0.8932.92 3.48 1.,92~6.30 7.50 4.1413.6 1.33 0.8852.01 2.87 1.914.33 6.19 4.ll9.33 1.96 0.930一4.12 4.22 2.008.88 9.09 4.31~19.1 1.62 0.7973.28 3.48 1.727.06 3,.7015.2" 7.5o 1.33 0.715一2.49 2.87 1.54一5.36 6.19 3.32l1.5 1.10 0.686~1.77 2.37 1.48~3.8o 5.1l 3.19~8.19 1.33 0.6762.63 2.87 1.465,67 6.19 3,1412.2 1.10 0.5992.02 2.37 1.294.36 5.l1 2.78~9.39 1.90 0,9693.71 4.08 2.,097.99 8.80 4.50~17.2 2,20~4.54 6.81 1.47 1.02一2.11 3.16 4.74一9,78 0.,757一4.75 4.08 1.63~10.2 8.8o 3.51~22.0 1.90 1.47 0,6543.30 3,16 1.417.10 6.81 3,03~15.3 1.14 0.5812.22 2.45 1.254.79 5.28 2.7010.3 .90 0.7065.09 4.08 1.52l1.0 8.80 3.28~23.6 1.47 3.16 1.218.24 6.81 2.6217.7" 0.5643.82 1.l4 0.4542.85 2.45 0.997一6.13 5.28 2.l113.2 1.l4 0.423一3.05 2.45 0.912一6.,57 5.28 1.97~l4.2 0.662一4.78 8.25 1.78 3.83 1.43一10.3 3.07一22.2 1.21 0.5832.52 2.61 1.265,.42 5.62 2.7111.7" 1.78 0.455~6.95 3.83 0.980~15.0o 2.11~32.3 8.25 1.21 0.3274.48 2.61 0.705~9.66 5.62 1.5220.8 1.78 0,410~7.72 3.83 0.88316.6 8.25 1.90~35.8 1.21 0.2665.52 2.61 0.573~ll.9 5.62 1.23~25,6 1.90 1.12~3.20 4.08 2.426.89 8.80 5.22l4.8 0.777一4.63 1.679.97 3.6021.5 1.90 4.08 8.80
GB/T38496一2020 表3(续 剂量组 剂量1=0,464×10 剂量1=1.00×10 剂量1=2.15×10" 各剂量组动物死亡数 剂量2=1.00×1o' 剂量2=2.15×10' 剂量2=4.64×1o' 剂量3=2.15×10' 剂量3=4.64×10 剂量3=10.0×10" 10.0×10o 剂量4- 剂量4 剂量4- =4.64×10 =21.5×l0" L.D 可信限 ID 可信限 可信限 1组 2(3)组3(2)组4组 LD 1.47 0.8o6一2.67 3.16 1.74一5.76 3,74~12.4 6.81 1.90 0.6785.3o 4.08 1.46~l1.4 8.80 3.1524.6 1.47 0.6163.50 3.16 1.33~7.53 6.81 2.8616.2 1.14 0.6022.15 1.304.62 2.79~9.96 2.45 5.28 1.47 0.5733.76 3.16 1.248.10 6.81 2.66~17.4 1.14 0.5032.57 2.45 1.08~5.54 5.28 2.33l1.9 l.78 0,.856一3,69 3.83 1.85~7.96 8,25 3.98~17.l 1.78 0.4816.58 3.83 8.25 2.23~30.5 1.04一l4.2 1.21 0.4513.25 2.61 0.972~7.01 5.62 2.0915.l 1.78 0.3908.1 3.83 0.84017.5 8.25 1.81一37.6 1.21 0.,3104.74 2.61 0.66810.2 5.62 1.44一22.0 1.21 0.2795.26 2.61 0.602l1.3 5.62 1.30~24.4 表4每组5只动物,组距10倍LD值和95%可信限 剂量组 剂量1=1.00×10 剂量1=0.,316x10 各剂量组动物死亡数 剂量2=l.00×10 剂量2=3.16×10 剂量3=10.0x10 剂量3=3.16×1 剂量4=10,0×10" 剂量4=31.6×10 1组 2(3)组 3(2)组 4组 LD 可信限 LD 可信限 2.82 l.604,95 8.91 5.00715." 2.24 1.413.55 7.08 4,47112 1.78 5.62 2.82 1.365,84 8.91 4.30~18.5 2.24 1.08~4.64 7.08 3.42~14.7 1.78 0,9273.4 5.62 2.9310.8 2.24 1.014.97 7.08 3.19~15.7 1.78 0.8013.95 5.62 2.5312.5 l.4们 0,682一2.93 4.47 2.169,25
GB/38496一2020 表4(续 剂量组 剂量1=0.316×10" 剂量1=1.00×10" 各剂量组动物死亡数 剂量2=1.00X1o" 剂量2=3.16×10y 剂量3=3.16×10 剂量3=10.0×10" 剂量4=10.0x10 剂量4 =3l.6Xl0 可信限 LD 可信限 1组 2(3)组 3(2)组 4组 LD. 0.638~1.927 3.55 2.026.24 1.12 1.4 0.636~3.14 4.47 2.019,92 1.12 0.542~2.32 3.55 1.717.35 1.35~5.56 4.2617.6 2.74 8.66 2.05 1.1l3.80 6.49 3.5112.0 1.54 l.072.21 4.87 3.40~6.98 2.74 1.106.82 8.66 3.48一21.6 0.806~5.23 2.55l6.5 2.0s 6.49 1.54 0.632~3.75 4.87 2.00~ll.9 1.15 0.537一2.48 3.65 .70~7.85 2.05 0.7405.70 6.49 2.3418.,0 1.54 0.5344.44 4.87 l.69l4.1 1.15 0.408~3.27 3.65 1.29~10.3 0.,378~3.53 1.20~l1.2 1.15 3.65 1.01一6.77 8,.25 3.18~21. 2.6i1 1.78 0.7234.37 5.62 2.2913.8 1.21 0.5542.65 3.83 1.75~8.39 2.6 0.7688.87 8.25 2.4328.1 1.78 1.5320,7 0.4846.53 5.62 1.21 0.318~4.62 3.83 l.00~l4.6 1.78 0.434一7.28 5.62 1.37一23.00 0.259一5.67 1.21 3.83 0.819一17.9 2.74 1.275.88 8.66 4.003~18.6 2.05 1.43~2.94 4.53~9.31 6.49 2.74 0.968~7.75 8.66 3.06~24.5 2.05 0.8435.00 6.49 2.6715.8 1.54 0.833~2.85 4.87 2.639.01 2.74 0.896一8.37 8.66 2.83一26.5 0.711一5.93 2.05 6.49 2.25一l8.7
GB/T38496一2020 表4续 剂量组 剂量1=0.316×10 剂量1=1.00×10 各剂量组动物死亡数 剂量2=1.00×10' 剂量2=3.16×1o 剂量3=3.16×10 剂量3=10.0×10 =31.6×1oy 剂量4=10.0×10' 剂量4- LD 可信限 可信限 1组 2(3)组 3(2)组 4组 LD 0.604一3.92 4.87 1.9112.4 1.54 1.15 0.568~2.35 3.65 1.807,42 1.54 0.5554.,27 4.87 1.7613.5 0.4632.88 1.47~9.10 1.15 3.65 2.6 0.9537.15 8.25 3.0122.6 1.78 1.033.06 5.62 3.279,68 2.61 0,658~10.4 8,25 2.08一32.7 0.528~5.98 1.6718.9 5.62 1.78 1.21 0.442~3.32 3.83 1.40~10.5 2.61 0.59411.5 8.25 1.88~36.3 1.78 0.4237.48 5.62 1.34一23.6 1.21 0.3054.80 3.83 0.96615.2 1.21 0.2765.33 3.83 0,87116,8 2.37 0,539~l0,4 7.50 1.70一33.00 1.33 0,446~3.,.99 4.22 1.41~12.6 2.37 0.307~18.3 7.50 0.97058.0 1.33 0.1879.49 4.22 0.59230.0 2.37 0.26221.4 7.50 0.83067.8 0.13713.00 0.433~41.0 l.33 4.22 2.6 .195.71 8.25 3.77~18.l 2.61 0.6849,.95 8.25 2.16~31.5 0.723一4.37 1.78 5.62 2.2913.8 2.61 0.558~12.2 1.76~38.6 8.25 1.78 0.484~6.53 1.53~20.7 5.62 1.21 0.4673.14 3.83 1.48~9,.94 1.78 0,4347.28 5.62 1.3723,00 1.2]1 0.3564.12 3.83 1.l3~13.00 2.37 0,793~7.l0 7.50 2.51一22.4 2.37 7.50 0.333一l6.9 1.05一53.4 10
GB/38496一2020 表4(续 剂量组 剂量1=0,316×10 剂量1=1.00×10' 各剂量组动物死亡数 剂量2=3.,16×1o' 剂量2=1.00X1o 剂量3=3.l6×10 剂量3=10,0×10 剂量4=10.0×1o 剂量4=31.6×10' 2(3)组 3(2)组 LD LD 组 4组 可信限 可信限 1.33 0.303一5.87 4.22 0.958~18.6 2.37 0,24423,1 7.50 0,77173,00 1.33 0.172~10.3 4.22 0,545~32.6 1.33 0.l48~12.l 0.467~38.1 4.22 6.1.5.3一次最大限度试验 如20只动物(雌雄各半)一次灌胃剂量5000mg/kg体重,在14d内又无一死亡,可判定LDm习 5000mg/kg体重 6.1.5.4其他方法 也可采用其他方法如寇氏(Karber)法、固定剂量法(Fixeddose method)及上下法(Upanddownm pro oeedure)等 6.1.6急性经口毒性试验分级评价规定 急性经口毒性试验分级评价规定见表5 表5急性经口毒性试验分级 ID 毒性分级 mg/kg体重 实际无毒 LD0>5000 500GB/T38496一2020 6.2.3操作程序 6.2.3.1 试验设计 染毒浓度的设计,动物分组,观察期限、观察指标等可按6.1的要求进行 6.2.3.2染毒方法 急性吸人毒性试验可采用静式染毒法或动式染毒法 6.2.3.3静式染毒法 6.2.3.3.1静式染毒是将实验动物放在一定体积的密闭客器(染毒柜)内,加人一定量的消毒剂,并使其 挥发,造成实验需要消毒剂浓度的空气，一次吸人性染毒2 6.2.3.3.2染毒柜的容积以每只染毒小鼠不少于3L/h空气计,每只大鼠不少于30L/h计 6.2.3.3.3计算染毒浓度,染毒浓度一般应采用实际测定浓度 在染毒期间一般可测4次一5次,求其 平均浓度 在无适当测试方法时 可用式(4)计算染毒浓度 a×d 式中 染毒浓度,单位为毫克每立方米(mg/m)5 消耗消毒剂量,单位为立方米(m'); ); -消毒剂密度,单位为毫克每立方米(mg/m 染毒柜容积,单位为立方米(m). 6.2.3.4动式染毒法 6.2.3.4.1动式染毒是采用机械通风装置,连续不断地将含有一定浓度消毒剂的空气均匀不断地送人 染毒柜,并排出等量的染毒气体,维持相对稳定的染毒浓度 一次吸人性染毒2h 62342气体前毒别,经流量计与空气混合一定浓度后,直接输人染毒柜 易挥发被体消毒剂,通 过空气鼓泡或适当加热促使挥发后输人染毒柜 若消毒剂现场使用采取喷雾法时,可采用喷雾器或超 声雾化器使其雾化后输人染毒柜 6.2.3.4.3计算染毒浓度,染毒浓度一般应采用动物呼吸带实际测定浓度,每30min一次,取其平均 值 若无适当的测试方法,也可采用式(5)计算染毒浓度 a×d (5 WV 式中 染毒浓度,单位为毫克每立方米(mg/m'). 气化或雾化消毒剂量,单位为立方米(m'); d n) 消毒剂密度,单位为毫克每立方米(mg/m' -输人染毒柜风量,单位为立方米(m'); V -染毒柜容积,单位为立方米(m) 6.2.3.5LC的计算 6.2.3.5.1lC(半数致死浓度)的计算可按6.1的要求进行 6.2.3.5.2在预试验的基础上,如20只动物(雕雄各半)一次2h吸人染毒浓度10000mg/m',在14d 内无一死亡,可判定lCa>10000mg/m 12
GB/38496一2020 6.2.4急性吸入毒性试验评价规定 急性吸人毒性试验评价规定见表6. 表6急性吸入毒性分级 2hLc 毒性分级 mg/m” 实际无毒 LC>10000 1000GB/T38496一2020 表7(续 皮肤刺激反应 皮肤刺激反应评分 无 勉强可见 水肿形成 皮肤隆起,轮廓清楚 水肿隆起约1mm 水肿降起超过1mm1 6.3.3.2一次破损皮肤刺激试验 涂受试物前,在2.5emx2.5em的去毛皮肤上,用75%酒精清洁,消毒暴露皮肤,待酒精挥 6.3.3.2.1 发后,用灭菌刀片或注射针头在皮区内划一个“井”形的破损伤口,并在该破损皮区内染毒 注意皮肤破 损仅达表皮,不要伤及真皮 6.3.3.2.2试验用受试物的浓度、手术前的皮肤准备、手术后受试物的涂抹、局部皮肤反应的观察和评 分方法按6.3.3.1的要求进行 注意鉴别感染和原发性刺激反应的区别,若有感染可疑,应进行重复 测试 6.3.3.3多次完整皮肤刺激试验 6.3.3.3.1试验前动物皮肤准备按6.3.3.1.2的要求 6.3.3.3.2次日将受试物0.5mL(g)涂在一侧皮肤上,受试物的浓度同6.3.3.1.1.另一侧涂溶剂作为对 照,在涂抹后4h,用水或无刺激的适宜溶剂清洗,除去残留物 每天涂抹一次,连续涂抹14d 在每次 涂抹后24h观察结果,按表7评分 为了便于受试物的涂抹和结果观察,必要时应勇毛 对照区的处 理方法同试验区 6.3.4评价规定 6.3.4.1一次皮肤刺激试验 在各个观察时间点,按照表7对动物的皮肤红斑与水肿形成情况进行评分,并分别按时间点将3只 动物的评分相加,除以动物数,获得不同时间点的皮肤刺激反应积分均值(刺激指数) 取其中最高皮肤 刺激指数,按表8评定该受试物对动物皮肤刺激强度的级别 表8皮肤刺激强度分级 皮肤刺激指数D 刺激强度级别 0GB/38496一2020 M DI= ×l4 式中: D1 -皮肤刺激指数; M -每只动物14d的红斑和水肿总积分 受试动物数 14 多次皮肤试验刺激天数 6.4急性眼刺激试验 6.4.1 目的 检测消毒剂对实验动物眼睛的急性刺激和腐蚀作用 6.4.2实验动物 使用3只家兔 试验前检查家兔双眼,有异常者不能用于试验 6.4.3操作程序 试验用受试物一般为黏膜或空气消毒应用液的5倍浓度的溶液或消毒剂原液 6.4.3.1 6.43.2吸取受试物0.1mL,滴人家兔一侧眼结膜囊内 另一侧眼以生理盐水作为正常对照 6.43.3滴受试物后,将眼被动闭合4s,30s后用生理盐水冲洗 于滴眼后1h,24h,48h,72h、7d、 14d和21d,肉眼观察家兔眼结膜、虹膜和角膜的损伤与恢复情况 如果72h内未出现刺激反应,或第 7d或第14d,眼睛刺激反应完全恢复,即可提前终止试验 必要时,用2%荧光素钠溶液、裂隙灯,放大 镜检查角膜及虹膜变化 6.4.4评价规定 按表9对家免眼角膜,虹膜和结膜的急性刺激反应进行评分,并分别计算每只动物在3个不同观察 时间(24h、48h和72h)的角膜损害、虹膜损害、结膜充血和结膜水肿四方面的“平均评分”(即每只动物 的24h、48h和72h评分之和除以观察数3) 分别以动物眼角膜、虹膜和结膜充血,水肿的平均评分 和恢复时间,按表10,表11判定受试物对眼睛的刺激强度 表9家兔急性眼刺激反应的评分标准 眼损害表现 评分 无溃疡形成或混浊 散在或弥漫性混浊,虹膜清晰可见 角膜损害 半透明区易分辨,虹膜模糊不清 出现灰白色半透明区,虹膜细节不清,瞳孔大小勉强可见 角膜不混浊，虹膜无法辨认 正常 皱褶明显加深,充血、肿胀、角膜周围有中度充血,瞳孔对光仍有 虹膜损害 反应 出血、肉眼可见破坏,或瞳孔对光无反应 15
GB/T38496一2020 表9(续 眼损害表现 评分 血管正常 血管充血呈鲜红色 结膜(脸结膜、球结膜 充血 血管充血呈深红色,血管不易分辨 弥漫性充血呈紫红色 无水肿 轻微水肿包括瞬膜 结膜睑结膜、球结膜 明显水肿,伴有部分眼脸外翻 水肿 水肿至眼脸近半闭合 水肿至眼脸大半闭合 表10眼刺激性反应分级标准(一) 损伤类型 分级标准 3只动物的平均评分;角膜损害<1、虹膜损害<1,结膜充血<2和结膜水肿<2或3只 动物中至少有2只动物的平均评分符合上述标准,另外1只动物的刺激反应在21d内 无刺激性 可逆性损伤 完全恢复" 3只动物中有2只动物的平均评分;角膜损害l;虹膜损害>l;结膜充血>2;结膜水 轻刺激性 肿>2,且7d内全部动物的刺激反应完全恢复" 3只动物中有2只动物的平均评分;角膜损害>l;虹膜损害>1;结膜充血>2;结膜水 可逆性损伤 刺激性" 肿>2,且21d内 全部动物的刺激反应完全恢复 至少有1只动物的角膜、虹膜或结膜的刺激反应在21a的观察期内未完全恢复或(和 不可逆性损伤 腐蚀性 在3只动物中有2只动物的平均评分:角膜损害3;虹膜损害>1.5 完全恢复是指动物的眼刺激反应评分,角膜损害=0,虹膜损害=0,结膜充血=0或1,结膜水肿=0或1 刺激性是指接触受试物后所产生的可逆性炎性反应 腐蚀性是指接触受试物后所产生的不可逆性组织损伤 表11眼刺激性反应分级标准(二) 动物数 恢复时间" 平均评分" 损伤类型 角膜损害<1和 虹膜损害1或 轻刺激性 虹膜损害>1或 可逆性损伤 结充血>2或 刺激性 结膜水肿> 2 16
GB/38496一2020 表11(续 动物数 恢复时间 平均评分 损伤类型 角掀害>3或 虹膜损害>l.5 角膜损害>1或 不可逆性损伤 腐蚀性" 虹膜损害>1或 结膜充血>l或 结膜水肿>1 恢复时间是指动物刺激反应评分恢复至角膜损害=0,虹膜损害=0,结膜充血=0或1,结膜水肿=0或1的 时间 至少有1只动物于21d尚存在角膜粘连或血管噼,也可判为腐蚀性 6.5阴道黏膜刺激试验 6.5.1 目的 检测消毒剂对实验动物阴道黏膜的刺激作用和强度 6.5.2实验动物 选用健康、初成年的雌性白色家兔,同一品系,体重2.0kg3.0kg 试验前应检查动物阴道口有无 分泌物、充血,水肿和其他损伤情况 如有炎症或(和)损伤,应弃用 选择未交配的动物进行试验 6.5.3试验分组 分为染毒组和对照组,每组3只 6.5.4操作程序 6.5.4.1稀释使用的消毒剂采用黏膜消毒时应用液5倍浓度的溶液作为受试物 若应用液为原液的消 毒剂则用原液作受试物 对照组采用生理盐水 6.5.4.2将长度为8cm左右的钝头软管或12号硅胶导尿管与2mL的注射器连接 注射器和导管注 满受试液备用 每只动物各准备一套 6.5.4.3 一次阴道黏膜刺激试验的染毒方法:将动物仰面固定,暴露出会阴和阴道口 将导管用受试液 或对照液湿润后轻柔地插人阴道(4cm~5cm),并用注射器缓慢注人2mL受试液,抽出导管,完成染 毒 对照组动物用生理盐水作同样处理 6.5.4.4由于动物阴道容积的个体差异,有时受试液注人后可能有溢出,可用消毒棉或软纸拭去 6.5.4.5末次染毒后24h,采用气栓法处死动物,剖腹取出完整的阴道,纵向切开,肉眼观察是否有充 血、,水肿等表现,供病理取材时参考 然后将阴道放人10%福尔马林溶液中固定24h以上,选取阴道 的两端和中央(即位于耻骨联合处附近)3个部位的组织制片,HE染色后,进行组织病理学检查 6.5.5评价规定 6.5.5.1组织病理学检查结果,按表12规定对阴道黏膜的刺激反应进行评分 17
GB/T38496一2020 表12阴道黏膜刺激反应评分标准" 阴道组织反应 反应评分 完整一正常 细胞变性或变扁平 上皮组织 组织变形 A 局部糜烂 广泛糜烂或溃疡 无 极少一25 B.白细胞浸润每个 轻度25个50个 高倍视野) 中度51个~100个 重度> l00个 极少 C血管充血 轻度 中度 重度伴血管破裂 无 极少 D水肿 轻度 中度 重度 刺激反应积分=A十B+C十D. 6.5.5.2将实验组3只动物3个部位的刺激反应积分相加后,再除以观察总数(动物数×3),得出实验 组阴道黏膜刺激反应的平均积分,最大记分为16(见表12) 6.5.5.3对照组评分方法同6.5.5.1和6.5.5.2. 6.5.5.4将实验组平均积分减去对照组平均积分得出刺激指数后,按表13进行刺激强度分级 表13阴道黏膜刺激强度分级 阴道黏膜刺激指数Dl 阴道黏膜刺激反应强度 无 012 6.5.5.5当对照组动物阴道黏膜刺激反应平均积分大于9时,应采用6只动物进行复试,以鉴别是否与 操作损伤有关 18
GB/38496一2020 6.6皮肤变态反应试验 6.6.1 目的 检测消毒剂重复接触后,实验动物产生皮肤变态反应的可能性及其强度 6.6.2实验动物 选用皮肤完好的健康白色豚鼠,雌雄各半,体重200g~300 0g 6.6.3试验分组 将豚鼠随机分为实验组,阴性对照组和阳性对照组,每组动物至少16只 6.6.4操作程序 6.6.4.1对实验组豚鼠,给予受试物诱导和激发处理 阳性对照组给予阳性致敏物如;2,4-二硝基氧 苯)诱导和激发处理 阴性对照组仅给以受试物激发处理 6.6.4.2诱导处理浓度允许引起皮肤轻度刺激反应 激发浓度可低于诱导浓度,并不得引起原发性刺 激反应 如果原液不引起皮肤刺激反应,诱导和激发均使用原液 6.6.4.3试验前24h将豚鼠背部左侧3cm×38cm范围内去毛 取诱导浓度的消毒剂溶液(或原液 0.5mL(g),直接涂在2 cm×2 cm左侧去毛皮肤上或滴于同样大小的2层一4层纱布上,再将其敷贴在 左侧去毛区 用一层无刺激塑料膜或油纸复盖,再以无刺激胶布固定,持续6h 第7d和第14d以同 样方法重复一次 6.6.4.4在末次诱导后14d,将激发浓度的消毒剂溶液0.5mL(g)直接涂在2cm×2cm右侧脱毛皮肤 上或滴于同样大小的2层一4层纱布上,敷贴于豚鼠背部右侧3cm×3cm去毛区 然后,用一层塑料 膜或油纸和无刺激胶布固定,6h后将敷贴的受试物洗去 24h和48h后观察皮肤反应,按表14对皮 肤反应进行评分 表14皮肤反应的评分标准 评分 皮肤反应 无红斑 轻微红斑 红斑形成 中度红斑 严重红斑 水肿性红斑 无水肿 轻度水肿 水肿形成 中度水肿 严重水肿 6.6.4.5实验室开展皮肤变态反应试验初期,或使用新的动物种属或品系时,应同时设阳性对照组,阳 性对照物可使用2,4-二硝基氧代苯 为保证试验方法的可靠性,在进行该类试验时,每隔半年应使用 阳性对照物检查一次 若检测报告中需要用非本次阳性对照组的实验数据时,应注明其实验日期 阳 性对照组的操作程序同实验组,以阳性致敏物替代受试物 19
GB/T38496一2020 6.6.4.6阴性对照组,仅对动物给予受试物的激发处理,每次试验应设置 6.6.5评价规定 化学物质引起的过敏性接触性皮炎,属迟发型变态反应 对于动物,仅见皮肤红斑和水肿 6.6.5.1 6.6.5.2根据表14标准,将出现皮肤反应(评分>1)的动物数除以该组实验动物数,求得致敏率(%) 按表15评定致敏强度 表15致敏强度分级标准" 致敏率 致敏强度 % 08 极轻度 9~28 轻度 2964 中度 强度 65一80 81~100 极强度 致敏率为0%时,可判为未见皮肤变态反应 6.7亚急性经口毒性试验 6.7.1目的 6.7.1.1检测消毒剂多次接触对实验动物的蓄积毒性作用及其靶器官,并确定其最大未观察到有害作 用剂量和最小观察到有害作用剂量 6.7.1.2为亚慢性、慢性毒性或致癌试验的剂量设计提供依据 6.7.2实验动物 -般用啮齿类动物,首选大鼠,所用大鼠应为6周8周龄,每组至少10只,雌雄各半 6.7.3试验分组 将实验动物随机分为4组(3个剂量组和1个对照组) 选择受试物剂量时,高剂量组应出现明显 的毒性反应,但不引起死亡,如果出现动物死亡应不超过10%;中间剂量组应可观察到轻微的毒性效 应;低剂量组应不引起任何毒性效应属未观察到有害作用剂量) 至于具体的剂量设计,可考虑高剂 量为LD.的1/51/10,高、中、低3个剂量间的组距以3倍一5倍为宜,最低不小于2倍 对于LD习 5o0mg/k区体重的消毒剂,高剂量应用100mg/k体重 另以受试物游剂代替受试物进行试验,作 为阴性(溶剂)对照组 6.7.4操作程序 6.7.4.1采用灌胃方式经口染毒 6.7.4.2灌胃法每天灌胃一次,每周称体重,并按体重调整受试物的给予量 6.7.4.3试验期为28d,末次染毒后24h处死实验动物,检测各项观察指标 20
GB/38496一2020 6.7.5观察指标 6.7.5.1 临床检查 观察动物中毒表现,每周称量体重一次 6.7.5.2血液学检查 包括血红蛋白含量、红细胞计数、白细胞计数及其分类计数等 6.7.5.3血液生化检查 例如天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、尿素氮、肌酥、血清总蛋白和白蛋白、总胆固醇等 必要时,可根据所观察到的受试物毒性效应,或与受试物化学结构相似物质的毒性作用,选择其他一些 生化指标 6.7.5.4脏器重量 测量肝、肾等重要脏器的重量,并计算其脏器重量系数 6.7.5.5病理学检查 实验结束时,处死所有动物,进行全面的肉眼尸检,并将尸检发现的异常组织和主要脏器和组织如 、肺、肝、肾、脾、脑、肾上腺、睾丸、卵巢和胃肠等)固定保存 当各剂量组动物尸检未发现明显病变,先 心 进行高剂量组和阴性对照组动物的肝、肾、胃肠和其他可能受损的脏器的组织病理学检查 如大体解剖 发现异常或高剂量组动物组织病理学检查发现病变,还应对中,低剂量组动物相应的器官进行组织病理 学检查 6.7.6评价规定 将各实验组动物观察指标与阴性对照组加以比较,并进行统计学检验,注意各剂量组间的剂量-反 应(效应)关系 评定受试物的最小观察到有害作用剂量和最大未观察到有害作用剂量及毒性作用的粑 器官 6.8致突变试验 6.8.1体外哺乳动物L.5178细胞基因突变试验 6.8.1.1目的 检测消毒剂对体外培养的哺乳动物细胞的基因突变作用,以作为评价消毒剂致突变性的依据 6.8.1.2试剂 6.8.1.2.1F培养液:为完全培养液 以Fischer或RPM1640培养液,加人马血清10%,丙酮酸钠 pg/mL..青霉素100IU/mL和链霉素1004g/mL配制而成(pH7.2一p7.4) 于4C冰箱中保 220" 存备用 6.8.1.2.2Fp培养液:为无血清培养液 以Fischer或RPMI1l640培养液,加人丙酮酸钠220"g/mL 青霉素100IU/ml.和链霉素100"g/ml等配制而成(pH7.2~pH7.4) 于4C冰箱中保存备用 6.8.1.2.3马血清;将过滤除菌后的马血清，经56C作用30min灭活补体 分装后,于一20C保存 备用 21
GB/T38496一2020 6.8.1.2.4集落用培养基;用Fischer或RPMI1l640培养液,加人马血清20%、丙酮酸钠220g/mL,琼 脂0.37%配制而成 6.8.1.2.5无钙镁磷酸盐缓冲液(无钙镁PEBS,pH7.27.4) 磷酸二氢钾(KH,PO) 0.20g 2.89 磷酸氢二钠(NagHPO 12H,O) g 0.20 氯化钾(KCI 8.00 氯化钠(Na(CI g 1000mL 双蒸水(压力蒸汽灭菌 6.8.1.2.6受试物;最好能直接溶于F与F培养液中 否则应先溶于二甲基亚碱(DMsO),而后再 加于上述培养液内 所加DMso的屋应低于1%体积分数》 6.8.1.2.7阳性对照物;选用甲基碱酸乙酯(EMS),丝裂霉索CMMC),甲基硝基亚硝基呱(MNNG). 苯并(a)芪(BaP)等 6.8.1.2.8三氟胸苷(TFT);用生理盐水配成100g/mL溶液,可冻存3个月 6.8.1.2.9肝微粒体酶混合液(S9混合液)取健康的雄性成年SD或Wistar大鼠,体重150g左右,约 5周龄一6周龄 将多叙联装(Aotle 1254),溶于玉米油中,浓度200 mg/mL,按500mg/kg体重 次腹腔注射 5d后,断头处死动物,取出肝脏称重后,用预冷的0.15mol几氧化钾辫液冲洗肝脏数次 每克肝(湿重)加0.15mol/儿氯化钾溶液3ml 剪碎肝脏,在冰浴中用玻璃匀浆器制成肝匀浆 以上 操作应注意无菌和局部冷环境 将肝匀浆用低温(0C一4C)高速离心机,以90o0！离心10min 取上清液即为S9,分装于无菌 冷冻安甄中 s9制成后,应进行无菌检查,以及用间接致癌物鉴定其活性 合格者置一80C或液氮中 储存备用,储存期不超过半年 99混合液应以上述s9液在临用时按无菌要求配制 一般配成含10%s9的混合液 其配方 如下 S9 0.10ml 1.65mol/1氯化钾+0.4mol/1氯化镁 0.04ml 葡萄糖-6-磷酸2Na 1.8mg 氧化型辅酶I(NADP) 3.lmg 用Fp培养液补足至1.0mL 6.8.1.3细胞 试验以小鼠淋巴瘤L.5178Y细胞[胸苷激酶(TK)座位为杂合子(k十/tk一]检测TK基因的突 变 为减少细胞的自发突变率,在制备该细胞试验用悬液时,先将其在加有THMG的F培养液中培 养24h,杀灭培养液中所存在的自发突变细胞(tk一/tk一),然后将细胞悬浮于THG培养液(不含氨甲 喋岭的THMG培养液)中培养1d3 d THMG含下列4种成分,各成分的终末浓度如下 胸苷 5×10-“mol/L 次黄瞟岭 5×10-mol/几L 氨甲喋吟 4×10-了mol/L 甘氨酸 1×10-'mol/几L 6.8.1.4试验分组 6.8.1.4.1 一般设4个剂量组 有细胞毒性的受试物,最高剂量组的细胞存活率为l0%一20%,无细胞 毒性受试物最高剂量不超过10mmol/儿或5mg/ml 22
GB/38496一2020 6.8.1.4.2同时应有阴性(溶剂)对照组、阳性对照组和未处理对照组 阳性与阴性对照组的操作程序 同实验组,阳性对照组用阳性对照物代替受试物,阴性(溶剂)对照组用受试物溶剂代替受试物 6.8.1.4.3除未处理对照组外,实验组和其他对照组,还均应包括有加S9混合液和不加S9混合液的两 部分 6.8.1.5操作程序 6.8.1.5.1细胞准备 将新清除了自发突变体的细胞群体,用F培养液制成悬液 以无菌烧瓶加人细胞悬液和Fp培 养液至100mL,细胞终末密度为7×10个/ml8×10个/mL 培养物以含5%二氧化碳的空气充 气后,加盖密闭,于36士1C进行培养 L5178Y细胞的细胞增殖周期约为10h11h,在常规培养 24h后,细胞数将增加约5倍 用稀释法维持生长,每天将细胞培养物用F培养液作4倍稀释(或隔 培养液和Fm培养液各50%的对半混合 天用Fap培养液作24倍稀释),继续培养 实验前一天用F AO 液(马血清终末浓度为5%)稀释 6.8.1.5.2受试物处理 用6.8.1.5.1中F和F的对半混合液将细胞培养物稀释至1×10个/mL,并分种于50mlL有盖 试管中,每管6mL,再加S9混合液4mL总量共10mL) 不加S9混合液管,代之以Fp培养液 在上 述试管内加人一定浓度的受试物,并以含5%二氧化碳的空气充气后加盖密闭,于36C士1C培养4h 处理结束后,以200买离心10min,除去含受试物的上清液,收集细胞 细胞用Hanks液洗涤,再 加人20mLF培养液充分混悬(细胞浓度为0.3×10个/mL),以含5%二氧化碳的空气充气后,加盖 密闭,于36C士1C振荡培养,开始表达 6.8.1.5.3表达 细胞的表现型表达时间为2d 表达开始后24h和48h经计数后将细胞稀释至3×10个/ml 6.8.1.5.4选择和集落化 表达结束后,取10ml培养物经离心后除去大部分上清液 并将细胞在留下的约1mlFop培养 基中混悬 将细胞悬液移人含100mL集落培养基的烧瓶中 此时细胞密度为3×10'个/mL 在 36C士1C振荡培养30min 取出0.5mL后,向余下的细胞悬液中加人1.0mLTFT贮存液,继续振 荡培养15min 将样本取出,倒于3个直径10cmm平皿中,每平皿33mL,含1×10'个细胞(称为TFT 平板),作突变体的选择 将先前取出的0.5ml，细胞悬液用集落培养基先作1:100稀释,细胞悬液浓 度为3×10'个/mL 振荡培养15nmin后,取出2.0mL再用集落培养基作1:50稀释(此时细胞悬液 浓度为6个/mL)后振荡培养 经15min培养后,倒人3个直径为100mm的平皿中,每平皿33mL. 含细胞200个(称为vc平板) 待琼脂凝固后,置二氧化碳培养箱(36C士1C)中静置培养10d 计 数各个平皿中出现的集落数(m 6.8.1.5.5相关指标的计算 按式(7),式(8)计算绝对集落形成效率(E,)和相对集落形成效率(E,),按式(9)计算突变频率 MF n E 23
GB/T38496一2020 式中 绝对集落形成效率; 形成集落数,单位为细胞集落数(CFU): n 接种细胞数,单位为细胞个数 E a 8 E ×100% EO 式中 E 相对集落形成效率; E 实验组绝对集落形成效率; E 溶剂对照组绝对集落形成效率 mTr MF= X ml、 式中 MF -突变频率 TFT平板集落数,单位为细胞集落数(CFU); m Tm Vvc平板集落数,单位为细胞集落数(CFU); 心 稀释系数为2×10-' 6.8.1.6评价规定 6.8.1.6.1对L5178Y细胞,自发突变频率推荐可接受的范围为20×10-看100×10- 6.8.1.6.2用适当的统计学检验方法处理,当各剂量组MF与阴性(溶剂)对照组者相比突变率升高,且 有统计学意义,并呈剂量-反应关系时,或仅一个剂量组有统计学意义的升高并经重复试验证实者,均可 判为阳性结果,即受试物对1.5178Y细胞TK系统有致突变性 6.8.2体外哺乳动物V79细胞基因突变试验 6.8.2.1目的 检测消毒剂对体外培养的哺乳动物细胞可否引起基因突变,以对消毒剂的致突变性做出评价 6.8.2.2试剂 6.8.2.2.1完全培养液;以Eagle最低必需培养液(EMEM)或RPM1640培养液加10%小牛血清、青霉 素(I00U/mL)和链霉素(100g/mL)配制而成 6.8.2.2.2小牛血清:将过滤除菌后的小牛血清放人56C水浴中,保温30min以灭活补体,而后分装， 保存于一20" 丫备用 无钙铁酸盐缓冲液(无钙铁PBs) 6.8.2.2.3 ):见6.8.1,2.5 6.8.2.2.4胰蛋白酶-EDTA溶液:分别用无钙镁PBS配制胰蛋白酶与EDTA溶液,胰蛋白酶溶液浓度 为0.05%,EDTA溶液浓度为0.02% 两溶液按1:1混合 存放于一20C备用 6.8.2.2.5受试物;最好能直接溶于无血清培养液内 否则,先溶于二甲基亚碱(DMsO),而后加于无 血清培养液内 所加DMsO溶液量为0.5%体积分数) 6.8.2.2.6阳性对照物:可根据受试物的性质和结构选用不同的阳性对照物,例如甲基磺酸乙酯 EMS),丝裂霉素c(MMC),甲基硝基亚硝基呱(MNNG),苯并(a)花(BaP)等 6.82.27乐破代鸟嗦咚(G-TG),用0.5%碳酸氢钠溶液配制为1.0mg/ml溶液,保存于4笔备用 6.8.2.2.8肝微粒体酶混合液(S9混合液);见6.8.1.2.9 24
GB/38496一2020 6.8.2.2.9磷酸盐缓冲液(0.067mol/儿L,pH6.8);取磷酸氢二钠9.47g溶于蒸馏水1000ml中,配成 第一液;取磷酸二氢49.07g溶于蒸僧水1000ml 中,配成第二液;取第一液49.5ml 加于第二液 50.5mL中混匀,即为pH6.8的0.067mol/L磷酸盐缓冲液 6.8.2.2.10姬姆萨染液;取姬姆萨染料3.8g,置玛瑙乳钵中,加少量甲醇研磨 逐渐加甲醉至375mL 待完全溶解后,再加125m甘油,放人36C士1C恒温培养箱中保温48h 保温期间振摇数次,使充 分溶解 取出过滤,两周后使用,作为姬姆萨染液原液 使用时,取1份姬姆萨染液原液,与9份0.067mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)混合,配成其应用液 6.8.2.3细胞 以仓鼠肺(V79)细胞株进行试验 为减少其自发突变,正式试验前将野生型细胞接种于含 THMG(见6.8.1.3)的MEM培养液内并在二氧化碳培养箱中培养一周,以杀灭自发HGPRT位点突变 体 遂后重新接种于MEM培养液中 6.8.2.4试验分组 一般设4个试验剂量组 对有细胞毒性的受试物,最高剂量组的细胞存活率为10%一20% 6.8.2.4.1 无细胞毒性受试物最高剂量不超过10mmol/L(或5mg/mL) 6.8.2.4.2同时应设阴性(溶剂)对照组、阳性对照组和未处理对照组 阳性与阴性对照组的操作程序 同实验组,阳性对照组用阳性对照物代替受试物,阴性(溶剂)对照组用受试物溶剂代替受试物 6.8.2.4.3除未处理对照组外,各组均应包括加S9混合液和不加该液的样本 6.8.2.5操作程序 6.8.2.5.1细胞准备 -服外,其余尔 将5X10个细胞接种于含完全培养液的直径为100mm的平m中,除未处理对照组 每组二皿,共13皿 于二氧化碳培养箱中(36C士1C)培养24h 6.8.2.5.2接触受试物 吸去6.8.2.5.1培养皿中的培养液,用无钙镁PHBS洗2次 将含有细胞的培养皿分为两大组，一组 加S9混合液,另一组不加S9混合液 加S9混合液组,在培养中加人2mlS9混合液,对不加S9混 合液组,则用2mL无血清培养液代替,再加一定量不同浓度受试物的供试液,最后用不含血清的培养 液补足至10ml 并将培养皿置二氧化碳塔养箱中培养5h,处理结束后吸去培养m中液体部分,用无 钙镁PBS洗涤细胞2次,再加人完全培养液10ml,在二氧化碳培养箱中培养19h22h 阳性和阴 性(溶剂)对照组也分加与不加S9混合液两大组,操作方法同上 6.8.2.5.3表达 将培养物用胰蛋白酶-EDTA消化 待细胞脱落后,加人完全培养液,终止消化 混匀、计数并进行 表达 表达时,以5×10个细胞接种于直径为100nmm的平皿中 培养3d后,分传一次.仍接种5× 10个细胞,培养3d后再进行突变体的选择,并按6.8.1.5.5中式(7)和式(8)计算绝对集落形成效率 E.)和相对集落形成效率E,) 6.8.2.5.4细胞毒性测定 将6.8.2.5.3消化计数后的细胞,每平皿接种200个,每组5个平皿,于二氧化碳培养箱内(36C士 1)培养7d 取出样本,固定并进行姬姆萨染色后,计数各平皿的细胞集落数 并按6.8.1.5.5中式 25
GB/T38496一2020 8)计算相对集落形成效率(E,),以相对集落形成效率表示细胞的毒性 6.8.2.5.5突变频率的测定 表达结束后,消化细胞,分别接种,每组5个平,每平种2×10个细胞 待细胞贴壁后加人 6-TG,终末浓度为54g/mL 放人二氧化碳培养箱培养7d~10d 固定后进行姬姆萨染色,计数平m 内集落数,并计算其突变频率(MF) 突变频率(Mr)的计算 6.8.2.5.6 按式(10)计算突变频率 1 MF一 10 n×E 式中 MF 突变频率 突变集落数,单位为细胞集落数(CFU); n E 绝对集落形成效率; 接种细胞数 6.8.2.6评价规定 对v79细胞,推荐可接受的自发突变频率范围为10×10-" 6.8.2.6.1 着100×10-" 6.8.2.6.2用适当统计学检验方法处理,当各剂量组MF与阴性(溶剂)对照组者相比,突变率升高,且 有统计学意义,并呈剂量-反应关系时,或仅一个剂量组有统计学意义的升高并经重复试验证实者,均可 判为阳性结果,即受试物对V79细胞HG;PRT系统有致突变性 6.8.3体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 6.8.3.1 目的 用细胞遗传学方法检测体外培养的哺乳动物细胞染色体畸变,评价消毒剂的致突变性 6.8.3.2试剂 6.8.3.2.1完全培养液:采用Eagle最低必需培养液(EMEM)或Dulbecco最低必需培养液DMEM) 等,并加人10%小牛血清以及青霉素(100IU/mL)和链霉素(1004g/mL) 6.8.3.2.2小牛血清;见6,8.2.2.2 6.8.3.2.3无钙镁磷酸盐缓冲液(无钙镁PBS,pH7.27.4);见6.8.1.2.5 6.8.3.2.4胰蛋白酶-EDTA溶液;见6.8.2.2.4 6.8.3.2.5受试物;最好能直接溶于无血清完全培养液内 否则,先溶于二甲基亚碱(DMsO),而后加 于完全培养液内 所加DMS(O溶液量应低于1.0%体积分数) 6.8.3.2.6阳性对照物;加S9时选用环磷酰胺等,不加S9时选用丝裂霉素c等 6.8.3.2.7肝微粒体酶混合液(S9混合液);见6,8.1.2.9 6.8.3.2.8秋水仙素溶液(0.04%);取40mg秋水仙素溶解于100ml无菌0.85%氧化钠溶液中,过滤 除菌 6.8.3.2.9甲醇-冰醋酸(3;1,体积比)固定液;临用现配 6.8.3.2.10姬姆萨染液:见6.8.2.2.10. 6.8.3.2.11氧化钾溶液(0.075mol/L 26
GB/38496一2020 6.8.3.3细胞 可选用仓鼠肺(CHL)细胞、仓鼠肺V79)细胞、仓鼠卵巢CHO)细胞,或人外周血 淋巴细胞等进行试验 在一般情况下,本试验推荐使用CHL细胞 .8.3.4试验分组 6.8.3.4.1所设试验剂量组应不少于4个 最高剂量组的细胞存活率一般应为10%20%,无毒性受 试物最高剂量组不超过10mmolL(或5mg/mL. 6.8.3.4.2同时应设阴性(溶剂)对照组、阳性对照组和未处理对照组,阳性与阴性对照组的操作程序同 实验组,阳性对照组用已知染色体断裂剂替代受试物,阴性(溶剂)对照组用受试物的溶剂 6.8.3.4.3除未处理对照组外,各组均应包括加S9混合液和不加该液的样本 6.8.3.5操作程序 6.8.3.5.1细胞准备 使用CHL细胞时,在试验前一天,将其1×10个细胞接种于直径为100m平皿中,置36C士 C二氧化碳培养箱内待用 6.8.3.5.2接触受试物 试验时,吸出细胞培养平皿中的培养液,加人试验所规定浓度的受试物和S9混合物(10%)以及不 含小牛血清的完全培养液,放二氧化碳培养箱内作用2h 结束后,吸去完全培养液,用Hanks液洗细 胞3次 加完全培养液,再置二氧化碳培养箱中培养,于24h收获细胞 收获细胞之前2h一4h,加人 秋水仙素溶液(终末浓度为14g/mL.),阻断细胞于有丝分裂中期相 6.8.3.5.3收获细胞 用胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞,待细胞脱落,加人培养液并混匀以终止胰蛋白酶作用 离心 1000r/min~1200r/min,5min7min),弃去上清液后,加人0.075nmol/L氯化钾溶液低渗处理 10min一20min 离心后,再以甲醇-冰醋酸液固定2次 按常规滴片干燥,用姬姆萨应用液染色 15min左右 6.8.3.5.4细胞染色体畸变分析 每组各选100个染色体分散良好的中期分裂相细胞,进行染色体畸变分析,观察和记录染色体结构 的异常及数量异常 染色体结构异常可有:断裂、微小体、有着丝点环、无着丝点环,单体互换,双微小 体,裂隙、非特定性型变化(粉碎化等) 染色体数量异常可有;非整倍体,多倍体、内复制 6.8.3.6评价规定 用X'检验或其他适当的统计学检验方法,对所得试验数据进行处理 当各剂量组与阴性(溶剂)对 照组相比,畸变细胞率升高,且有统计学意义,并有剂量-反应关系时;或仅一个剂量组有统计学意义的 升高并经重复试验证实者,并经重复试验证实时,可判为该受试物在本试验中具有致突变性 6.8.4小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 6.8.4.1 目的 检测消毒剂对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成的影响,评价消毒剂的染色体损伤毒性 27