河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定液相色谱-串联质谱法

河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T22963一2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中玉米赤霉醇、 玉米赤霉酮、己烯雌酚、己炕雌酚、 双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Deerminationofzearalanol,zearalanone,diethylstilbestrol hexestrolanddlievestrlresidwesinfugu,eelsand bakedeel LC-MS-MSmethod 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22963一2008 前 言 本标准的附录A,附录B为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位;秦皇岛出人境检验检疫局、天津出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:许泓、吴延晖何佳、张骏、张曼、林安清、庞国芳
GB/T22963一2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中玉米赤霉醇 玉米赤霉酮、己烯雌酚、己炕雌酚 双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中玉米赤霉醉(zearalanol),玉米赤霉酮(zearalanone),己烯雌酚 (diethylstilbestrol)、己烧雌酚(hexestrol)、双烯雌酚(dienoestrol)残留量液相色谱-串联质谱测定方法 本标准用于河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中玉米赤霉醇,玉米赤霉酮、己烯雌酚,己婉雌酚、,双烯雌酚残留量 的测定 本标准的方法检出限;玉米赤霉醉、玉米赤霉酮、己熔雌酚,己烯雌酚和双烯雌酚为1.04g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度(正确度与精密度 1部分:总则与定义 第 GB/T6379.1一2004,Iso5725-1:1994,IDTy 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度》第2部分;确定标准测量方法重复 GB/T6379.2 性与再现性的基本方法(GB/T6379.22004,1so5725-2;1994,IDT (GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,IsO3696;1987,MOD)y 原理 用叔丁基甲基醒和乙酸盐缓冲液加酶解剂分别提取试样中残留的玉米赤霉醉、玉米赤霉酮己烯雕 酚、己烧雌酚、双烯雕酚,经硅胶柱净化,用液相色谱-串联质谱仪测定,内标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯 水;GB/T6682,一级 叔丁基甲基醛:色谱纯 4.3甲醇;色谱纯 乙睛;色谱纯 4.5乙酸乙酯;色谐纯 4.6正已炕色谱纯 4.7二氯甲烧:色谱纯 4.8乙酸;优级纯 4.9乙酸钠CHI.CO(ONa3H,O) 4.10氢氧化钠:优级纯
GB/T22963一2008 4.113mol/L氢氧化钠溶液;称取120g氢氧化钠(4.10)溶于1000mL去离子水中 4.120.2mol/儿L乙酸盐缓冲液(pH=5.2);称取2.52g乙酸(4.8)和12.95g乙酸钠(4.9)溶解于 800mL水中,用氢氧化钠溶液(4.ll)调节pH值至5.2士0.1,加水定容至1000ml 4.13溶解液;正己熔-二氯甲熔(3十2) 4.14淋洗液:乙酸乙酯-正己炕(3十47) 4 15洗脱液;乙酸乙酯-正己熔(3十2). 4.168葡糖苷酸酶/硫酸酯复合酶;含葡糖苷酸酶124400units/ml硫酸酯酶3610units/mL 4.17激素及代谢物标准物质:玉米赤霉醇(包括a玉米赤霉醇和丹玉米赤霉醇,各50%)纯度>97% 玉米赤霉酮,纯度>97%;己烯雌酚,纯度>99%;己炕雌酚,纯度>98%;双烯雌酚,纯度>98% 4.18标准溶液;分别准确称取适量的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、双烯雌酚和己婉雌酚标准物 质,用甲醇(4.3)配制成1mg/mL标准贮备溶液 再根据需要以甲醇配制成不同浓度的混合标准溶液 作为标准工作溶液,保存于4C冰箱中 内标标准物质:-玉米赤霉烯醇-4冗代,纯度>99%;己烯雌酚-8爪代,纯度>98% 19 内标标准溶液;准确称取适量玉米赤霉希醉4爪代和己烯雕酚-8爪代标准物质,用甲醉(4.3) 4.20 分别配制成1mg/mL标准贮备溶液 再以甲醉稀释成适用浓度的混合内标工作溶液,保存于4C冰 箱中 4.21基质提取液;空白样品,除不加人标准工作溶液(4.18)和内标标准工作溶液(4.20)外,其他同 7.1.17.1.3处理后得到的溶液 4.22基质标准工作溶液;将标准工作溶液(4.18)及内标标准工作溶液(4.20)混合后在氨吹仪中吹干 以基质提取液(4.21)溶解,涡旋30s后即为基质标准工作溶液 4.23硅胶固相萃取柱:500mg,3mL 谴膜.0.2pm. 4.24 仪器 液相色谱-串联质谱联用仪;配有电喷雾电离源 55 2 分析天平;感量0.1mg和0.01g 5. 自动固相萃取仪或固相萃取装置 3 5.4高速均质器;转速大于10000r/min 5.5氮气吹干仪 5.6烘箱;控温精度土1c 5 涡旋振荡器 5.8离心机转速大于3000r/min. 5.9pH计;测量精度土0.3pH单位 10具塞离心管:25mL,50mL 5 5.11微量注射器;100AL 试样的制备与保存 6.1试样的制备 取有代表性样品500g,绞碎后搅拌均匀,制成实验室样品 试样分为两份,置于样品盒中,密封,并 做上标记 试样保存 将试样于一18C下保存
GB/T22963一2008 测定步骤 7.1混合基质标准校准溶液的制备 7.1.1样品称取 称取5个阴性样品,每个样品为5g(精确到0.lg),将上述样品置于50mL离心管(5.10)中,分别 加人适量混合标准工作溶液(4.18),使各被测组分玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己婉雕酚,己烯雌酚和双烯 雌酚的浓度分别为2.5ng/ml、5.0ng/ml、,10ng/mlL,25ng/ml,50ng/ml 再分别加人适量内标标 准工作溶液(4.20),使其浓度均为10ng/ml 7.1.2提取 加人20mL叔丁基甲基酥(4.2),在10000r/min均质1min 3000r/min离心5min,将上清液 全部转移至另一50mL具塞离心管(5.10)中备用 离心管中的残渣置于通风橱中挥发30min,加人 min,3000r/min 15ml乙酸盐缓冲液(4.12),高速均质1 1离心5min, 将上清液全部转移至另 25mL具塞试管(5.10)中,并在氮吹仪上于40C水浴中吹去残余叔丁基甲基酥后,加人80l丹葡糖 苷酸酶(4.16)混匀,于52C烘箱中放置过夜 在此缓冲溶液中加人氢氧化钠溶液(4.11)将溶液pH值 调至7,加人10ml叔丁基甲基腿,充分混合,3000r/min离心2min 移取叔丁基甲基腿层与前述的 叔丁基甲基雕提取液混合,在氮吹仪上于40C水浴中吹干 加人lmL溶解液(4.13),涡旋30s溶解， 待净化 7.1.3净化 固相萃取净化条件;用6ml正已己烧分两次预洗硅胶柱(4.23),流速均为4ml/min 上样,流速为 2mL/min,在样品试管中加人3mL淋洗液(4.14),混合后过柱,流速为2mL/min,用3mL淋洗液以 3mL/min的速度淋洗,加人2mL空气以4mL/min的速度吹过硅胶柱 用6mL.洗脱液(4.15)洗脱、 流速为2ml/min,加人2ml空气以6ml/min的速度吹过硅胶柱,收集洗脱液 将洗脱液在氮吹仪 上于40C水浴中吹干,加人1ml流动相,涡旋30s溶解 溶液过0.2m滤膜后,供液相色谱-串联质 谱测定 7.2实测样品溶液的制备 称取待测样品5g(精确到0.1g)于50mL离心管中,加人内标工作溶液,使其最终定容浓度均为 10 ng/mL 按7.1.2和7.1.3操作 7.3空白基质溶液的制备 称取阴性样品5g(精确到0.1g)于50m离心管中,按7.1.2和7.1.3操作 7.4测定条件 7 4.1液相色谱参考条件 色谱柱:ZORBAXEclipseSBC8,3.5am,150mm×4.6mnm(内径)或相当者; a b 柱温:25C; c)流动相:乙睛-水(7十3); 流速:0.5mL/min d 进样量:50L e) 7.4.2质谱参考条件 离子化方式:电喷雾电离; a 扫描方式;负离子扫描; b 检测方式;多反应监测(MRM; e) D 离子源温度:350C;
GB/T22963一2008 雾化气压力:0.083MPa; 气帘气压力:0.1240MPa; g)辅助气1压力;0.2756MPa 辅助气2压力;0.2412MPa; h i 喷雾器电流一5pA 电喷雾电压;一4500V; 定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表1 9 表15种激素及代谢物的定性离子对、定量离子对,碰撞气能量和去簇电压 化合物名称 定性离子对(" 1/这 定量离子对(G 碰撞气能量/N 去簇电压/y (mn/之 42 3206/277.2 11o 321.1/277.2 玉米赤霉醉 321.1/161.0 -40 -100 318.7/160.8 -40 -110 玉米赤霉酬 318.7/160.8 45 -l10 318.7/107.0 -50 -90 322.9/159,9 a-玉米赤霉烯醉-4尔代 322.9/159.9 322.9/130.1 43 90 266.9/251.0 -35 -90 己烯雌盼 266.7/251.0 40 266.9/237.1 -90 -36 -80 264.7/249.1 264.7/249.1 双烯雕前 264.7/235.0 -36 -80 269.0/118.9 -23 -70 己雌酚 269.0/134.0 -52 -70 269,0/134.0 275.0/258,9 -37 -90 己烯雌酚-8尔代 275.0/258.9 275.0/245.0 42 90 4.3液相色谱-串联质谱测定 7 定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同试验条件下,样品中待测物质和内标物的 保留时间之比,也就是相对保留时间,与混合基质标准校准溶液中对应的相对保留时间偏差在士2.5% 之内;且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定 性离子的相对丰度进行比较,偏差不超过表2规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以%表示 相对离子丰度K K50 20K50 l0GB/T22963一2008 7.5平行试验 按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定 7.6空白试验 除不称取试样外,均按上述步骤同时完成空白试验 结果计算 玉米赤霉醇、玉米赤霉酮,己烯雌酚,己婉雌酚、双烯雌酚的测定结果按式(1)计算 l000 x= -× -xx×会 l1000 式中: 一试样中被测物残留量-单位为微克每千克(e/ke) -基质标准工作溶液中被测物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/ml) 试样溶液中被测物的色谱峰面积; 基质标准工作液中被测物的色谱峰面积; 试样溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL). 基质标准工作溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/ml); 基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积; 试样溶液中内标物的色谱峰面积; 样液最终定容体积,单位为毫升(mL) 试样溶液所代表试样的质量,单位为克(g) 7m7 计算结果应扣除空白值;玉米赤霉醇和己烯雌酚将2种异构体面积或峰高值相加后以总量计算 精密度 9.1一般规定 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,重复性和再现性的值 以95%的可信度来计算 9.2重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,鱼肉组织中玉米赤霉 醇,玉米赤霉酮,已烯雌酚,已炕雌盼、双烯雌盼的添加浓度范围及重复性方程见表3 表3添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克 化合物名称 添加浓度范围 重复性限r" 再现性限R 玉米赤霉醇 1.0一10 lgr=0.9656lgm-1.0897lgR=0.9625lgm-0.7128 玉米赤霉阴 所 1.010 -0.651 lgr=0.9660lgm一1.1445lgR=0.9 1.0935 R- 十0.0119 -几.3"+ 己烯雌盼 从 l.010 lgr=0. g1 双婚雌盼 1.010 lgr=0,0735lgm十0.0016lgR=1.0813g川一0.798" 己烧雌酚 1.010 lgr=0.9760lgm-1.0445lgR=0.9252lgm一0.6613 注:m为两次测定结果的算术平均值 如果差值超过重复性限r,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 g. 3 再现性 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,鱼肉组织中玉米赤霉 醇,玉米赤霉酮,己烯雌酚,己炕雌盼,双烯雌盼的添加浓度范围及再现性方程见表3，
GB/T22963?2008 ?A ?? ????(MRN)?? ?ù?ù??????????????(MRM)?? ?A.1 5.20 ?M 2.0e4 5.99 0.D 6.0 8.0 8.5 5.05.5 6.57.07.5 0.5 1.5 4.5 min 5.25 M .6et 5.0e4 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 1/mim 1.0c4 ? 8 0.0 7.07.5 0.5 3.0 3.5 5.0 5.5 6.0 6.5 8.0 8.5 min 4.55 6 5000 ?ù 4.20 15 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 0.51.0 2.0 2.5 tmin 5.31 1.8e4 ?? 1.0e4 0.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.56.0 6.5 7.5 8.0 8.5 0.5I.01.52.0 2.53.0 Umin ?A.1?ù?ù?????????? ????(MRN)??
GB/T22963一2008 附 录 B 资料性附录 回 收 率 本方法中玉米赤霉醇、玉米赤霉酬、己烯雌酚、己炕雌酚、双烯雌酚添加浓度及其平均回收率的试验 数据见表B.1 表B.1玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己炕雌酚、双烯雌酚 添加浓度及其平均回收率的试验数据 化合物名称 加浓度/4g/kg 平均回收率/% 1.0 91.79 2.0 108.8 玉米赤霉醉 5.0 106.2 10.0 79.36 1.0 105,1 2.0 103.4 玉米赤霉围 5.0 106.4 10.0 103.3 l.0 87.44 98.53 2.0 己烯雌盼 5.0 86,99 89.07 ln.0 100.3 .0' 2.0 94.79 双烯雕盼 82.19 5.0 10.0 95.07 70.95 1.0 2.0 84.96 己烧雌酚 5.0 82.17 10.0 95.75