国家标准 GB/T40226一2021 环境微生物宏基因组检测高通量测序法 Deteetion.ofenviromentalmierobialmetageome一HHighthroughputsequeneing 2021-05-21发布 2021-12-01实施国家市场监督管理总局发布国家标涯花管理委员会国家标准
GB/T40226一2021 目次前言范围 2 规范性引用文件术语和定义缩略语原理试验条件试剂仪器设备样品 10试验步骤试验报告 12质量控制粪便样品采集、保存、运输方法附录A规范性) 附录B(规范性土壤样品采集、保存、运输方法附录c规范性水体样品采集、保存、运输方法附录D(资料性)样品信息单附录E(资料性)DNA样品的完整性图谱和质量级别分类 10 附录F(资料性参考数据库参考文献 12
GB/T40226一2021 前言本文件按照GB/T1.1一2020<标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口本文件起草单位;深圳华大生命科学研究院、深圳华大基因科技有限公司、深圳市生命科技产学研资联盟、测试技术研究院生物研究所、深圳华大临床检验中心本文件主要起草人:陈冰、肖亮、钟焕姿、李俊桦、李倩一、贾慧压、姜华艳、周李华、唐美芳、吴吴、李陶莎、周媛钟宏彬
GB/T40226一2021 环境微生物宏基因组检测高通量测序法范围本文件描述了采用高通量测序技术进行环境微生物宏基因组检测的术语和定义、原理试验条件、试剂、仪器设备、样品,试验步骤,试验报告和质量控制要求本文件适用于运用高通量测序法进行环境微生物宏基因组的检测规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中,注日期的引用义件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析试验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T35537一2017高通量基因测序结果评价要求术语和定义下列术语和定义适用于本文件 3.1 环境 enVirOnment 相对某项中心事物的周围世界注:在本文件中特指人体(动物)环境与自然环境人体(动物)环境包括但不限于口腔、皮肤、生殖道、肠道等;自然环境包括但不限于空气、水体,土壤、沉积物等 3.2 相对丰度relativeabundance 某一特定种类微生物在环境微生物群落中所占的相对比例注，通常以百分比表示 3.3 微生物宏基因组nmicrobialmetagenomme 以特定环境中整个微生物群落作为研究对象,不分离培养,直接提取得到的所有微生物基因组DNA 注:可用于分析其遗传信息、物种分类、系统进化,基因功能及代谢网络等， 3.4 ealling 碱基识别质量qualityofbase 评价碱基准确识别的概率注，简称为Q,通常以数值表示碱基识别质量值与碱基识别错误率负相关,二者遵循对数函数关系碱基识别质量值越高,错误率越低
GB/T40226一202 3.5 Q20 测序数据中,碱基识别质量值为20的碱基识别准确率为99%,或错误率为1% 3.6 Q30 测序数据中,碱基识别质量值为30的碱基识别准确率为99.9%,或错误率为0.1%. 缩略语下列缩略语适用于本文件 DNA;脱氧核糖核酸(deoxyribonueleicacid D;识别码(identifier PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) RNA;核糖核酸(ribonucleicacid) 5 原理运用高通量测序技术对环境样品中微生物基因组DNA进行测序,再将测序结果与现有数据库中序列进行比对,从而检测样品中所含微生物种类和相对丰度试验条件 o 实验室设施和设备要求应符合GB19489的规定 6.1 实验室用水应符合GBy/6682的规定 6.2 6.3实验室应做到防止污染,应根据不同工作内容划分独立区域,并有明显标志,如试剂储备和准备区、样品制备区、扩增区等,各区域间应避免交叉污染试剂 7.1DNA提取试剂 7.2PCR产物纯化试剂 7.3文库制备试剂 7.4高通量测序试剂 8 仪器设备 8.1高通量测序仪 8.2PCR仪 8.3冷冻离心机;最大离心力12000以上 8.4微量移液器 8.5紫外分光光度计 8.6荧光定量仪
GB/T40226一2021 8.7电泳仪 8.8凝胶成像系统 8.9水浴锅 8.10低温冰箱;一20C和一80C 样品 9.1样品采集、保存和运输 9.1.1样品采集应经过伦理审查和生物安全评价审查 g.1.2应即刻采样,减少样品暴露于空气中的时间,同时应避免样品被其他物质污染 9.1.3应根据环境样品类型等情况选择相应的采样方法以保证样品中微生物群落的代表性和准确性粪便样品采集,保存和运输方法按附录A,土壤样品采集、,保存和运输方法按附录B,水体样品采集、,保存和运输方法按附录C执行 9.2样品接收与处理应核对样品编号,记录样品信息,检查样品状态,避免密封不严导致泄漏或污染等,否则该样品应废应记录样品信息(见附录D),以保证样品的可追溯性弃,重新采样 10试验步骤 10.1DNA提取 10.1.1原理将环境样品悬浮于裂解缓冲液中,通过抽提等步骤提取微生物基因组DNA,充分去除样品中的蛋白质、脂类、多糖,RNA等杂质宜选用手工提取方法或相应DNA提取试剂盒 0.1.2DNA样品浓度和完整性检测环境样品提取微生物基因组DNA后,应使用荧光定量仪检测DNA样品浓度,使用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA样品完整性宜综合DNA样品浓度及完整性,判断DNA样品质量级别,判断依据见附录E 10.2文库构建与高通量测序 10.2.1应使用合适的DNA样品和文库构建试剂进行文库构建进行文库构建的DNA样品类别选择标准按表1 表1进行文库构建的DA样品类别选择标准 DNA样品类别是否满足文库构建 A类满足文库构建要求,DNA总量>1,04g B类满足文库构建要求,DNA总量>0.5g,且<1.04g 不完全满足文库构建要求,可以尝试进行该步骤,但不保证测序质量 C类建议重新采样,重新提取样品微生物基因组DNA
GB/T40226一202 0.2.2应使用合适的文库和高通量测序试剂进行高通量测序高通量测序按GB/T35537一2017的附录A进行 10.3数据处理 10.3.1数据质控 0.3.1.1质控步骤样品经过高通量测序得到的原始数据,应进行质量控制,去除含接头或低质量的序列、外源或宿主基因组序列,再进行后续生物信息学分析 10.3.1.2碱基识别质量值要求测序完成后,应进行Q20,Q30的统计和评估每个DNA样品可用数据对应的碱基识别质量值应符合如下要求大于Q20的碱基比例>90% 大于Q:0的碱基比例>80% 10.3.1.3可用数据量要求可用测序数据量应达到声明目标物种可从样品中检测到的最小测序数据量每个样品测序生成的可用高质量序列数目应大于1×10条注:序列数目为单端测序序列条数,或双测序序列对数 10.3.2物种注释数据质控后对样品数据进行物种注释除特殊方法外,对于已知物种,宜使用数据库中序列相似度 95%以上,覆盖度90%以上的物种信息进行注释数据库见附录F 10.3.3序列拼接与组装数据质控后对样品数据可进行序列拼接与组装使用组装软件将序列进行拼接,得到更长的叠连群,将这些叠连群片段聚集起来,与参考数据库进行比对,得到新的参考基因集数据库见附录F 10.3.4微生物物种相对丰度计算数据质控后对样品数据进行物种相对丰度计算,应对所使用的相对丰度计算方法进行记录除特殊方法外,宜将可用高质量测序数据比对到组装好的参考基因集或合适的数据库上,按相似度95%以上,覆盖度90%以上进行统计,得到基因水平上的相对丰度分布情况,再将注释到同一物种分类水平的基因序列相对丰度进行叠加,得到该物种的相对丰度结果 1 试验报告试验报告应包含环境样品中微生物群落的物种组成及各成分相对丰度,可增加个性化功能分析部分,并应至少包括下列内容 a 检测机构名称、联系方式和地址检测员、样品接收时间样品检测时间及报告时间 b)测序平台与测序策略;
GB/T40226一2021 数据分析对应使用的注释方法,软件,参数、流程和数据库版本等; c 样品物种组成及各相应丰度,宜选择多元展现方式 d 12质量控制 12.1宜使用标准物质进行质量控制,评估定性与定量检测结果的准确性 2.2在描述结果时应注明检测结果的局限性,说明非本文件规定的可能影响检测结果的所有操作细节
GB/T40226一2021 附录 A 规范性) 粪便样品采集保存、运输方法 A.1粪便杯采集法 A.1.1采集应使用洁净的器皿收集粪便样品,确认器皿中无水、尿液或其他分泌物如经血)等污染排便后即刻使用一次性粪便杯配套取样勺对粪便样品中部取样,将粪便样品从洁净器皿转移至粪便杯,立刻旋紧盖子每个粪便杯中转移至少2em大小的粪便样品 A.1.2保存与运输 A.1.2.1粪便杯采集粪便样品后,应立即置于干冰或一80C保存若不能即刻转移,可暂存于<4C 条件下如冰盒),30min内转移至干冰或一80C保存 A.1.2.2应在干冰条件下进行运输保存及运输过程应避免反复冻融 A.2含稳定液自采样套装采集法 A.2.1采集应使用洁净的器皿收集粪便,确认器皿中无水、尿液或其他分泌物(如经血)等污染,按照自采样套装操作要求取中段粪便,将采集的粪便样品迅速转移至含有稳定剂的保存管中,使稳定液完全浸没粪便样品,盖紧管盖 A.2.2保存与运输含稳定液保存管采样后,该保存管按操作说明可于常温保存和运输,避免阳光直射常温放置时间应不超过自采样套装操作说明限定的常温保存时间范围对将超出自采样套装操作说明限定时间的常温粪便保存管需转移至一80C冻存,应在干冰条件下进行运输保存及运输过程应避兔反复冻融
GB/T40226一2021 录附 B 规范性土壤样品采集、,保存、,运输方法 B.1采集宜取土壤表层5cm10em处土壤,如果土壤有翻动,应更深处采样,避免空气微生物污染采样区内设置至少3个重复采样点,保证所取样本对所在地域的代表性每个点取样量应一致(>5g),去除土样里植物根系或砾石,将重复土样混合均匀,做好标记.装人灭菌封口聚乙烯袋或其他无菌容器 B.2保存与运输 B.2.1采集样品后,应立即置于干冰或一80C保存若不能即刻转移,可暂存于<4C条件下(如冰盒),30min内转移至干冰或-80C保存 B.2.2应在干冰条件下进行运输保存及运输过程应避免反复冻融如需常温保存或运输,宜将样品浸润于稳定剂中
GB/T40226一2021 录附 C 规范性) 水体样品采集、保存,运输方法 C.1采集 c.1.1根据水体不同的浊度,应使用无菌器材采集4L2001不等的水样采集好的水样需要通过滤膜进行过滤,可选择不同孔径大小的滤膜示例201 ,0.lm等孔径滤膜 4m.,0.2pm、 Mm、3Am,0.8Amm,0.41 c12浊度较大水样应先静置.分离悬泽颗粒;再使用20m孔径谜膜预过逃,再选择小孔径逮膜进行浊度较小请凉水样,可选择小孔径遮膜直接过涉过滤 C.2 保存与运输 c.2.1样品最后一次过滤后的滤膜应放置于无菌容器,并将无菌容器立即置于干冰或一80进行保存若不能即刻转移,可暂存于<4C条件下(如冰盒)30nmin内应转移至干冰或一80保存 c.2.2应在干冰条件下进行运输保存及运输过程中应避免反复冻融如常温保存或运输,宜将样品浸润于稳定剂中
GB/T40226一2021 附录 D 资料性样品信息单样本信息单记录见表D.1 表D.1样本信息单运输公司: 快递单号城市: 样品寄件人样品寄件人联系电话运输状态;口干冰冰袋常温其他样品联系人" 样品联系人电话样品联系人邮箱样品联系人单位有无传染性、有致病传染性说明未知无口致病性实验室要求" 普通实验室 P实验室(生物安全柜) 详细提取方案样品信息信息栏填写标准 1.样品名称必需唯一化以区分其他样本 2 样品名称可由字母及数字组成;不能包含" 井” 样品名称 ""“&.”和“,"等非常规符号人体相关样品名称不能包含任何可识别个体身份的信息样本状态包括;DNA、速冻组织(速冻粪便、速冻土壤、速冻水样品状态体等),含稳定剂组织等按照NCBtaxonID提供样品分类单元信息例如:410658 代表土壤宏基因组样品;749906代表肠道宏基因组样品; 分类单元D 代表海洋沉积物宏基因组样品;408172代表海洋水体宏基因组样品;449393代表淡水宏基因组样品 NCB无记录ID的样品类型归为408169 样本环境名称必需与上述分类单元D一致包括土壤宏基因样品环境名称组、肠道宏基因组,海祥沉积物宏基因组,海洋水体宏基因组等宿主名称仅针对宿主相关样本宿主名称;人(Hwma.sapiens)猪 Ssscrofa 含中文名与拉丁名样本采集时间,按照年-月-日“yyyymm-dd”规范记录,对无法采集时间精确日期的样本可精确到月份或年份例如:2017-01-23 2017-01和2017 采集地点信息需包括国家和省份信息(详细位置信息由经纬采集地点度提供) 例如;广东省采集地点经度,正值代表东经,负值代表西经采集经度例如:40,743和一10,530 采集地点纬度,正值代表北纬,负值代表南纬采集纬度例如:18.580和一89.122 注1样本信息标准参考国际基因维学标准联盟的宏基因组序列最小信息MIMS)标准注2;“来”栏目为必填项
GB/T40226一2021 录附资料性 DNA样品的完整性图谱和质量级别分类 E.1NA完整性判断使用琼脂糖凝胶电泳法检测基因组DNA样品的完整性,进行完整性判断的电泳图谱见图E.1 M2 M bp "出 4361 bp 2000 器 100o 750 0 250 100 标引序号说明: -重度降解电泳图中对应样品的泳道无明显主带,拖尾严重中度降解;电泳图中对应样品的泳道可见主带,略有拖尾: -轻微降解;电泳图中对应样品的泳道可见主带,略有拖尾; NM -DNA标准品1 M2 DNA标准品2; -碱基对(asepin. p 图E.1基因组DNA样品降解程度示意图 E.2DNA质量级别分类结合基因组DNA样品浓度和完整性,对DNA样品质量级别进行分类,分类标准见表E.1 表E.1DNA样品质量级别分类表检测结果样品类型判定结论 m>1.04g A类无降解 p>10ng/L 或轻微降解基因组DNA 0.54gm<1.04g B类川0.54g ps10ng/4L 中度降解或重度降解注1:m 指DNA总量注2:0 -指DNA质量浓度注3A类样品同时满足m>l.04g,p>10.0ng/L.,无降解或轻微降解三个条件,合格注4:B类样品同时满足0.54gGB/T40226一2021 附录 F 资料性参考数据库数据处理过程可使用如下参考数据库 a 国家生物信息中心(CNCB)/国家基因组科学数据中心(NGDC)的基因组数据库 https://bigd.big,.ae.cn/gwh/ 国家微生物科学数据中心(NMC)的微生物宏基因组数据库 https://gcmeta,wdem.org/ 国家微生物科学数据中心(NMC)的全球微生物菌种目录数据库 http://gem.wdem.org 国家基因库生命大数据平台的微生物数据库 https;//db,cngb,org/datamart/mierobe 美国国立生物技术信息中心(NCBI)的基因银行数据库 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank 美国国立生物技术信息中心(NCBI)的参考序列数据库 https www.ncbi.nlm.nih.gov/refseg g 美国国立生物技术信息中心(NCB1)的微生物基因组数据库 http: www.ncbi.nlm.ih.gov/genome/microbes h 美国国立生物技术信息中心(NCBD)的物种分类数据库 http www.ncbi,nlm.nih.gov/taxonomy 美国能源部联合基因组研究中心(DO)E-JG)的微生物基因组数据库 https://imgjgI.doe.gOV j 美国能源部联合基因组研究中心(DO)E-JG;)的细菌核糖体RNA基因序列数据库 http greengenes,secondgenome,com k 欧洲生物信息研究所(EB1)的核酸数据库 www.ebi.ac,uk/embl http 欧洲生物信息研究所(EB1)的蛋白数据库 https www.unprot.Org m斯坦福国际研究所(SRIinternational)的代谢组学数据库 httpS;//metaCyC.Org 日本京都大学的基因与基因组百科全书 n www.genome.jp/kegg/ https: o 日本国立遗传学研究所(NIG)的核酸数据库 http: www.ddbj.nig.ac.jp 加拿大麦克马斯特大学的抗性基因数据库 p https://card.mcmaster.ca/ 全球海洋微生物数据库(TARAOceans) https://www.ocean-miecrobiome.org 11
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环境微生物宏基因组检测高通量测序法GB/T40226-2021解析

一、环境微生物宏基因组检测的意义

环境微生物是指存在于土壤、水体、空气等自然环境中的微生物，它们在环境中发挥着重要作用。环境微生物宏基因组检测的意义在于通过对这些微生物的基因组进行分析，可以更好地了解它们的生态学特征、代谢途径、功能等信息。

二、高通量测序法在环境微生物宏基因组检测中的应用

高通量测序法是目前宏基因组研究中最常用的技术之一，其优点在于高效、快速、可靠、全面。通过高通量测序技术，可以快速、准确地获得环境微生物样品的DNA序列信息，并对其进行分析和比较。同时，高通量测序技术在检测微生物数量、种类、代谢途径等方面也有很好的应用。

三、GB/T40226-2021标准的内容和意义

GB/T40226-2021是我国针对环境微生物宏基因组检测颁布的标准，涉及到了样品采集、处理、测序、数据分析等多个环节。该标准的实施可以规范环境微生物宏基因组检测工作的流程和质量，提高检测的准确性和可靠性，为环境保护和治理提供技术支持。