国家标准 GB/T34729一2017 猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法 BoekingELISAethodtodeteetantibodyagainstclassiealswinefevervirus 2017-11-01发布 2018-05-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T34729一2017 引言本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时,可能涉及4.1与猪瘟病毒E2蛋白表达及纯化相关的专利的使用本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场该专利持有人已向本文件的发布机构保证,他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案相关信息可通过以下联系方式获得专利持有人姓名:兽医药品监察所地址:北京中关村南大街8号请注意除上述专利外,本文件的某些内容仍可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任
GB/34729一2017 猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法范围本标准规定了猪瘟病毒抗体检测的阻断ELISA方法本标准适用于猪瘟抗体检测,但无法区分疫苗免疫抗体和野毒感染抗体规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件兽医实验室生物安全技术管理规范农业部公告第302号缩略语下列缩略语适用于本文件 CSFV:猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus) nnzyme-LinkedImmunosorbentAssay ELISA:酶联免疫吸附试验(Enz HRP辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase OD:光密度OptiealDensity) 试剂 4.1猪瘟病毒E2蛋白:见附录A 4.2酶结合物:参见附录B. 4.3标准阳性血清:猪瘟疫苗免疫仔猪制备,经荧光抗体病毒中和试验检测为阳性 4.4标准阴性血清:无母源抗体,未免疫猪瘟疫苗的仔猪血清,经荧光抗体病毒中和试验检测为阴性 4.5包被液:见C.1 磷酸盐缓冲液:见C.2. 46 44.7 封闭液见C.3. 4.820倍浓缩洗液;见C.4 4.9稀释液;见C.5 4.10底物液A:见C.6 4.11底物液B;见C.7 4.11终止液;见C.8. 4.12商品化试剂盒;可选择同类的商品化试剂盒器材和设备 5.137C温箱
GB/T34729一2017 5.2酶联读数仪 5.3微量移液器(200AL、1000L)和吸头 5.4多道移液器(200ML. 5.5酶联反应板 5.6 -次性注射器(5mL10ml). 6 血清样本的处理 6.1样本采集及处理采集静脉血时,每头猪使用一个注射器,不同猪的注射器不能混用进行前腔静脉或耳静脉无菌采血,不少于2ml 室温静置于斜面2h,待自然凝固后,置于2C8C冰箱中放置不少于2h,4000r/min 离心10min 用移液器小心吸出上层血清 6.2血清样本的存放与运送血清样本在一周内检测,可置2C一8C条件下保存,超过一周,应置一20C以下冷冻保存运输时注意冷藏,确保样品有效采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输,运输时间应尽量缩短按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识检测步骤 7.1抗原包被;用包被液将亲和层析纯化的E2蛋白稀释至0.24g/mL,包被酶联反应板,100L/孔 2C一8C包被16h,即为抗原包被板 7.2抗原包被板的封闭;包被结束后,弃去孔中液体,每孔加人1×洗液3004L,漂洗1次每孔加人新鲜配制的封闭液300l,2C8C封闭24h 封闭结束后,弃去孔中液体,每孔加人1倍洗液 300L漂洗1次,于吸水滤纸上拍干 7.3在抗原包被板中加人稀释液,50L/孔将待检血清按顺序加人到抗原包被板中,50L/孔同时加人阳性对照及阴性对照血清各2孔.50L/孔 37C温箱中反应1 7.4弃去反应液,每孔加人1×洗液300AL,漂洗3次 7.5用稀释液将酶结合物稀释100倍,每孔加人100L 37C温箱中反应1h. 7.6重复7.4步骤 7.7将底物液A和B按等体积进行混合,混合后立即加人到抗原包被板中,每孔100L,避光显色 10 mina 7.8每孔加人100L终止液 7.9酶标仪上读取450nm吸光值 7.10结果计算[见式(1)~式(3)] NN N 式中阴性对照孔平均值; N -阴性对照孔1的OD值; N 阴性对照孔2的OD值 P十P p
GB/34729一2017 式中: P -阳性对照孔平均值; P 阳性对照孔1的OD值; P -阳性对照孔2的OD值 N一S ×100% B= 3 N 式中: B -阻断率; N 阴性对照孔平均值 S -样本OD值 7.11试验成立条件;标准阴性对照血清ODam>0.5,标准阳性对照的阻断率大于50%,该检验结果成立若试验不成立,应进行重复检测 8 结果判定如果被检样本的阻断率>40%,则该样本可以判为阳性,即有猪癌抗体存在;如被检样本的阻断 8.1 率二32%,则该样本可以判为阴性,即无猪瘟抗体存在;如果该样本的阻断率在32%一40%,则应在 14d后对动物进行重新检测 8.2若采用商品化试剂盒,可根据说明书进行操作及结果判定 9 注意事项 9.1所有操作应严格遵守生物安全规定 9.2用于加样的移液器应进行校准,以免误差过大影响检测结果 9.320倍浓缩洗涤液在低温保存时可能会产生白色结晶,应加热使其溶解后再使用 9.4底物溶液和终止液对眼睛、皮肤以及呼吸道有刺激作用,使用过程中应穿戴相应的防护用具,防止接触和吸人 9.5底物溶液应避光保存,避免与氧化剂接触,盛装底物溶液的容器应保持干净 9.6所有试剂一律于2C一8C保存,使用前恢复至室温 9.7血清稀释板只能使用一次,没用完的血清稀释板应将用过的孔充分洗涤拍干,并进行标记,避免下次检测时发生混淆在进行多板检测时,反应板不能叠放在37C温箱中,以免导致各反应板受热不均 37C反应时,反应板可平放于湿盒内或加封板膜后直接平放于温箱中,但不能采用密封袋,以免导致受热不均
GB/T34729一2017 附录 A 规范性附录) 猪瘟病毒2蛋白的表达及纯化材料和试剂猪痛兔化弱毒疫苗株;大肠杆菌感受态细胞、pFastBacl质粒、DH10Bac感受态细胞,Sf9细胞、质粒提取试剂盒、转染试剂、无血清培养基均为商品化试剂 A.2引物序列 P1-1:5'>ATAGGATCCACCATGGCATTCCTCATcTGCTTGATAAAAGTATTAAG3' P2-1:5'>TAAGCTTACTTGGTAccGTGATGGTGATGGTGATGTcCCcATACCAGcGGcG 3 AGTTGTTcTGTTAGAACTAcGTAGGTCACTATCAGC< M13F:5'>GTTTTccCAGTCAcGAC<3 M13R:5'>CAGGAAACAGCTATGAC一3" A.3方法 A.3.1重组转移载体的构建猪痛兔化弱毒疫苗株RNA的提取、反转录合成病毒cDNA 再用引物P1-1和P2-1扩增猪瘟兔化弱毒疫苗株基因,琼脂糖凝胶纯化,将纯化产物和载体pFastbael分别用BamHI/Hind酶切连接，转化大肠杆菌感受态细胞,筛选获得的重组转移载体 A.3.2重组杆粒的构建将重组转移载体转化DH10Bac感受态细胞.在筛选培养基上进行蓝白斑筛选,取白斑培养,用 PCR方法进行鉴定,引物为M13F/M13R,目的片段长度为3500bp A.3.3转染及病毒鉴定将鉴定正确的克隆菌在培养基中扩大培养,用质粒提取试剂盒提取重组杆粒DNA,用转染试剂转染Sf9细胞,转染后28C培养96h,获得重组病毒将病毒液在Sf9细胞上传3代后,以1%的比例感染s9细胞,28C培养96h后,收集培养上清 A.3.4猪瘟病毒2蛋白的纯化将收集的培养上清12000r/m离心10min,除去细胞碎片,然后将上清用离心超滤法浓缩;浓缩的上清在镍离子亲和层析洗液(50mmol/L磷酸钠、300mmol/1氧化钠,pH7.0)中4C透析过夜平衡过的上清加人洗液平衡过镍离子亲和层析柱,4C吸附30min后,用40mmol/L咪幽洗脱,收集洗脱液用SDS-PAGE电泳检测纯化效果 A.3.5蛋白浓度测定用BCA法测定蛋白浓度,按说明书配制BSA蛋白标准250g/ml、125g/ml、50g/mL、
GB/34729一2017 25闪g/mL5/mL.04g/mL.将2蛋白稀释10倍,其他均按说明书操作测定oD5921 nm,绘制标准曲线,计算E22蛋白浓度纯化后的E2蛋白浓度应>0.1mg/ml A.3.6蛋白纯度测定和特异性测定取5AL2L、1lAL纯化产物进行SDSsPAGE电泳,用凝胶成像仪中成像并用薄层扫描法测定蛋白纯度,蛋白纯度应90% 同时用猪瘟阳性血清对纯化后的E2蛋白进行wee esternblo鉴定和ELIsA 鉴定,猪瘟阳性血清应仅与目的蛋白发生特异性反应,杂蛋白无反应
GB/T34729一2017 附录 B 资料性附录) 酶结合物的制备 B.1材料 B.1.1猪瘟病毒E2蛋白;制备及纯化见附录A B.1.2弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、6~8周龄BalB/C小鼠、青链霉素混合液(100x),小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0),改良Eagle培养基(Dulbecco'smodifcationofEagle'smediumDulbecco,DMEM)、胎牛血清(FetalBovineSerum,FBS),50%聚乙二醉1000,次黄嗯吟-氨喋岭-胸苷培养基添加物(50× HYPOXANTHINE-THYMIDINEMEDIAsUPPLEMENT,HT),次黄喋岭-氨喋岭-胸苷培养基添十加物(50 HYPOXANTHINE-AMINOPTERIN-THYMIDINEMEDIAsUPPLEMENT,HAT 蛋白G亲和层析柱,辣根过氧化物酶标记试剂盒,细胞培养板、细胞培养瓶等均为商品化产品 B.1.3基础培养液:DMEM培养基,含1%青链霉素混合液 B1.4HAT培养液含10%FBS的DMEM培养液,加HA至终浓度为2%,含1%青链霉素混合液 B.1.5HT培养液;含10%FBS的DMEM培养液,加HT至终浓度为2%,含1%青链霉素混合液 B.2方法 B.2.1免疫首免;将猪瘟病毒E2蛋白稀释至100g/ml,与弗氏完全佐剂等量混合,颈背部皮下多点注射， lml/只;二免:46周后,将浓度为100g/ml的E22蛋白与弗氏不完全佐剂等量混合,腹腔注射 0.5ml/只;三免;方法同二兔;四兔;三免2周后,取0.5ml浓度为1004g/ml的E2蛋白直接腹腔免疫小鼠 3d后进行细胞融合 B.2.2细胞融合无菌摘取免疫小鼠脾脏,磨碎后,分别用1504m和200m铜网过滤,将收集的细胞用1000r/nmin离心5min 弃上清,沉淀用无血清DMEM重悬,进行细胞计数将培养好的SP2/0细胞从细胞培养瓶上轻轻吹下,用无血清DMEM培养液重悬,进行细胞计数将制备的脾细胞和SP2/0细胞按照51 mL50%猴么二醉1o0祥液,缓慢加人 8:l的比例混合,l000r/min离心10min,弃上清吸取1 然后立即在5mim内滴加公mL无血清DMEM 1o00，/min离心10mim,弃上 60s内)至细胞中清,加人30mLHAT培养液重悬,分装于96孔细胞培养板中,置含5%二氧化碳37C温箱中培养 7d B.2.3抗体检测及筛选定期观察融合后细胞,待细胞培养液上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时,吸取100L 细胞上清进行抗体检测采用有限稀释法对阳性克隆孔进行亚克隆,所有操作采用HT培养液进行置含5%二氧化碳的37C温箱中培养,定期观察,采用相同方法进行抗体检测亚克隆过程应进行 3次4次
GB/34729一2017 B.2.4单克隆抗体腹水的制备与纯化将筛选的杂交瘤细胞进行扩大培养后,收集细胞,进行计数,将细胞浓度调整至1×10”细胞/mL 2×10'细胞/mL,每只老鼠腹腔接种0.5mL 定期观察,待小鼠腹部膨大且有波动感时,用注射器吸取腹水将采集的腹水于5000r/min离心10min,取上清,用0.Q1mol/LpH7.2的磷酸盐缓冲液将股水稀释10倍,用蛋白G亲和层析柱进行纯化 B.2.5酶结合物的制备将纯化后的单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记试剂盒进行标记,操作步骤按照说明书进行 B.2.6酶结合物效价的确定将酶结合物进行100倍稀释后,再进行2倍梯度稀释用7.2中制备的抗原包被板进行酶结合物效价测定,将OD值最接近1.0的稀释度作为酶结合物效价调整酶结合物浓度至终效价的100倍， -20分装备用
GB/T34729一2017 附录 C 规范性附录) 试剂配制 C.1 包被液的配制称取碳酸钠1！和碳酸氢钠3g,溶于1000ml去离子水,调节pH至9.49.6 C.2磷酸盐缓冲液的配制称取十二水合磷酸氢二钠3.5g,二水合磷酸二氢钠0,25g和氯化钠8.5g,溶于800mL去离子水中,调节pH至7.2~7.6,用去离子水定容至1000ml C.3封闭液的配制称取牛血清白蛋白3g,溶于100mL 磷酸盐缓冲液中 C.420倍浓缩洗液的配制称取十二水合磷酸氢二钠70g,二水合磷酸二氢钠5g,氯化钠170.0g,吐温-2016.0mL,加去离子水至800ml调pH至7.4一7.6,定容至1000ml 12115min高压灭菌后,室温存放备用使用前,将20倍浓缩洗液用蒸僧水或去离子水按1:19的比例混合即可 C.5稀释液的配制量取5.0mL马血清溶于95.0mL磷酸盐缓冲液中 C.6底物液A的配制称取TMB200g,无水乙醇(或二甲基亚碱)100ml,加双燕水至1000ml 底物液B的配制十二水合磷酸氢二钠14.60g,柠檬酸9.33g,0.75%过氧化脉6.4mL,加三蒸水至1000mL.,调至 pH5.05.4 c.8终止液的配制将去离子水与浓盐酸(36%一38%)以9:1的比例混合即可,室温保存

猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法GB/T34729-2017介绍

猪瘟病毒是一种会引起猪瘟的高致病性病原体。其传播迅速，感染范围广泛，能够对养猪业造成巨大的经济损失。因此，对猪瘟病毒进行准确的检测至关重要。目前，ELISA方法已经成为猪瘟病毒检测中最常用的方法之一。

实验步骤

以下是猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法GB/T34729-2017所规定的实验步骤：

1. 样品处理：将血清样品离心去除悬浮物。
2. 涂板制备：将猪瘟病毒抗原涂覆在96孔板上。
3. 样品加样：将样品加入到孔中，并与猪瘟病毒抗原结合。
4. 洗板：将孔中的剩余物质洗去。
5. 加二抗：加入特异性较好的生物素化二抗，与样品中的抗体结合。
6. 加酶标记的亲和素：加入酶标记的亲和素，与生物素化二抗结合。
7. 加底物：加入底物，使酶发生反应并产生颜色。
8. 停反应：停止酶反应，并测定吸光度。

注意事项

以下是在进行猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测时需要注意的事项：

1. 样品的采集和保存应该避免污染。
2. 孔板制备过程中应该注意控制涂覆猪瘟病毒抗原的浓度。
3. 实验过程中应该保证每个步骤的操作时间和温度。
4. 检测结果分析应该对吸光度值进行准确的判读。

总之，猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法GB/T34729-2017提供了一套标准化的实验操作流程，能够保证检测结果的准确性和可靠性。在进行猪瘟病毒检测时，建议尽可能遵循该标准进行操作。