李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法

国家标准 GB/T33114一2016 李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法 etectionandidentifieationofPrunusneeroticringspotvirus 2016-10-13发布 2017-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T33114一2016 李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了李属坏死环斑病毒(Pr7 4s)的检疫鉴定方法 runusnecroticringspotirus 本标准适用于可能携带李属坏死环斑病毒的植物及其产品的检疫鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2122 sN/T2964！植物病毒检测规 植物病毒分子生物学检渊规范 SN/T3457 李属坏死环斑病毒基本信息 学名:Prumusnecrotlicringsboirus 缩写,PNRsV 分类地位;雀麦花叶病毒科(Bromoviridae),等轴不稳环斑病毒属(Ilarirus) 李属坏死环斑病毒其他信息参见附录A 方法原理 李属坏死环斑病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据 根据PNRsv与抗体之 间的特异性反应,对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAs-ELIsA);依据PNRsV的基因 组特征建立RT-PCR,实时荧光RT-PCR检测方法;通过这些方法的有效组合,判断样品是否带有 PNRsV 仪器、用具及试剂 5.1仪器 电子天平(感量0.001g),高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超低温冰箱(一80C),制 冰机、旋涡振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、超净工作台,PCR仪、微波炉,电泳仪电泳槽、凝胶 成像分析仪、酶标仪 5.2用具 酶联板,可调移液器(2.5AlL10AlL20Al,100L,200AlL、l000AlL)和可调移液器头,Eppendorf 管、研钵、微型磨杵等
GB/T33114一2016 5.3试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定 DAsELISA试剂 见附录B;RT-PCR检测试剂见附录C;实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D 抽样和样品制备 抽样 有病毒为害症状的植物材料单独抽样,PNRsV的为害症状描述参见附录A;无症状的种子、苗木 及其产品抽样方法按照sN/T2122中规定执行 6.2样品制备 样品制备参照sN/T2964和SN/T3457规定执行 苗木及其组培苗等产品:有明显症状的,直接取有症状叶片1g单独制样,用于后续检测;无明显症 状的,可5株叶片混合采样用于后续检测 检测鉴定 7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA 把制备的样品上清液加人已包被PNRsV抗体的酶联板中,进行DAS-ELISsA检测 每个样品平 行加到两个孔中 健康的植物组织作为阴性对照,感染PNRsV的植物组织作为阳性对照,样品提取缓 冲液作为空白对照;其中阴性对照的植物种类和材料(如叶片)应尽量与检测样品相一致 具体操作见 附录B 7.2RT-PCR检测 RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照 分别提取样品和对照的总 RNA,反转录合成cDNA后进行PCR检测,具体操作见附录c 7.3实时荧光RT-pPC检测 实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照 分别提取样品 和对照的总RNA,反转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测,具体操作见附录D 如采用商品化 步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行 结果判定 样品检测时,检测流程及结果判定按下述原则进行 -首先采用DASELIsA进行初步筛检 若检测结果为阳性,采用RT-rCR方法进行验证,若验证结果为阳性,则判定样品携带 若验证结果为阴性,则采用实时荧光RT-PCR进行进一步验证 若进一步验证的 PNRSV 结果为阴性,则判定样品不携带PNRsV;若进一步验证的结果为阳性,则判定样品携带 PNRSV -若检测结果为阴性,采用RT-PCR方法进行验证,若验证结果为阴性,则判定样品不携带
GB/T33114一2016 PNRsV;若RT-PCR验证结果为阳性,则需要将PCR产物进行测序,序列结果相符则判定样 品携带PNRSV 样品保存与结果记录 样品保存 经检测确定携带PNRSV的样品应保存在适合的条件下以备复核 如种苗、叶片等样品保存在 -80C冰箱中;做好登记和标记工作,保存期限至少1年 9.2 结果记录 记录包括样品来源,种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字 DAsELIsA检测应有酶 联反应数值RTR检测应有电试图片相测序结果,实时荧光RTR检测应有荧光曲线图"
GB/T33114一2016 附 录A 资料性附录 李属坏死环斑病毒相关资料 A.1寄主范围 该病毒寄主范围广泛,自然和实验接种侵染21科双子叶植物,该病毒可侵染大多数李属植物,如 李(Prwnusdomestriea,杏(P.armeniaca),桃(P.ersica,樱桃李(P.cerasi/era),欧洲酸樱桃(P ceraswa),欧洲甜樱桃(P.aum),马哈利酸樱桃(P.mahaleb)、稠李(P.adws),油桃(P.ersicaur nectarina,野黑樱(P.serotina、黑刺李(P.spiosa)等;该病毒可侵染玫瑰(Rosarugosa),啤酒花 lupulus)等 在人工接种的情况下还可侵染180余种植物 Hwwulws A.2为害症状 病害症状因分离物,栽培种和环境条件不同而不同 病毒的一些分离物不引起症状,仅仅在接种指 示植物或用血清学等方法检测时才能发现被侵染;一些分离物在系统侵染的当年在幼叶上产生坏死斑 和孔洞,但在以后的年份里,在叶子和果实上很少出现症状;另一些分离物在侵染当年产生坏死反应,随 后是慢性的褪绿叶斑驳和坏死、叶子耳突、畸形将,延迟水果成熟,水果上有斑点症状 如在甜樱桃上出现 了无症状到严重皱缩花叶症状,包括叶子上的褪绿点,叶扭曲,水果延迟成熟 在玫瑰上无症状侵染很 普遍,症状有花叶、开花延迟、秋天落叶早、产生更多不成形的花,被侵染的植株通常无活力 在啤酒花 上产生褪绿线和环斑 A.3分布地区 广泛分布在温带地区,如欧洲各国和美国都有发生 A.4 传播方式 机械接种传播、花粉传播、种子传播,也可通过无性繁殖苗木,组培苗等的运输人为途径进行长距离 传播 A.5粒体形态 李属坏死环斑病毒粒体为等轴对称球状体,直径23nm一27nm,有些粒体为准等轴球状到短棒状 轴比为1.011.5);有些株系的病毒粒体呈明显的棒状(轴比大于2.2);有些棒状粒体达70nm 棒状 粒体的有无及比例因株系而异 A.6基因组 正单链RNA,3分体基因组,RNA-1长3.662kb,RNA-2长2.507kb,RNA-3长1.887kb
GB/T33114?2016 ? B 淶?? ???(DAs-ELIsA B.1? B.1.1 ??塣 B.1.2?? ???塣 B.1.3 (pNPP) B.1.41PBST?(pl7.4) 8.0 ?(NaCD g KHPO 0.2g (NaHPO 1.15g ?(KCI 0.2g -20(Tween-20 0.5ml 900mL??,1000mL,4C档 B.1.5???(pH7.4) (Na.SO. 1.3g ?(PVPMw2400040000 20.0g 900ml1PBST,1PBST1000ml,4C档 B.1.6?(pH9.6) ?(Na,CO. 1.59g ?(NaHcO 2.93g 900ml??,100o mL,4C档 B.1.7?????(pH7.4 ???(BSA 2.0g
GB/T33114一2016 聚乙烯基此咯婉酮PVP,Mw2400040000 20.0g 溶于900ml.1×PBST中,并用1×PBST定容至1000ml. ,4C储存 B.1.8底物缓冲液(pH9.8 97mL 二乙醇胺 氯化镶(MeCl.) 0.1 g 溶于800mL灭菌双蒸水中,用浓盐酸(HCI)调pH值至9.8,定容至1000mL,4笔储存 B.2实验步骤 B.2.1包被抗体 按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体,每孔加100l 酶联板加盖或用保鲜膜 包好,37C孵育2h 清空孔中溶液,用1×PBsT加满各孔,3min后倒掉孔中溶液,在吸水纸上拍干 再重复2次上述洗板过程 B.2.2样品制备与加样 待渊样品按1'1u(质量浓鹰)加人抽提缓冲液,在研钵中研磨;200r/min岗心10mm. 1,上清液即 为制备好的检测样品 阴性对照,阳性对照作相应处理或按说明书进行 按每孔100AL分别加人制备 好的检测样品、阴性对照和阳性对照;酶联板加盖或用保鲜膜包好,4C孵育过夜 酶联板用自来水彻 底冲洗,再用1×PBST洗涤3次,每次3min. B.2.3加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度并加人到酶联板中,每孔100L,酶 联板加盖或用保鲜膜包好,37C孵育4h 酶联板用自来水彻底冲洗,再用1×PBST洗涤3次,每次 3 mln B.2.4加底物 将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/ml(现配现用),每孔100L 加人到酶联板 中,室温避光孵育 B.2.5读数 在不同的时间内如30nmin,60min、90nmin、,120min或更长时间,用酶联仪在405nm处读OD值 B.3结果判定 B.3.1质量控制要求 对照孔的oD值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)应在质量控制范围内即缓冲液孔和阴性对 照孔的OD值<0.15,当阴性对照孔的OD值<0.05时,按0.05计算;阳性对照OD值/阴性对照 oD值>5;,同一样品的重复性基本一致
GB/T33114一2016 B.3.2结果判定 在满足B,3.1的质量控制要求后,结果原则上可判断如下;样品OD值/阴性对照OD值>2,判 为阳性;样品OD值/阴性对照OD值在2左右,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验 证;样品OD值/阴性对照OD值<2,判为阴性 若不满足B.3.1的质量控制要求,则不能进行结果判断
GB/T33114一2016 c 附 录 规范性附录 RT-CR检测 C.1试剂 C.1.1核酸提取试剂 Trizol或合格的RNA提取试剂盒 C.1.2 电泳缓冲液TAE(50× 三胫甲基氨基甲婉(Tris) 242g 冰乙酸(C,H,O. 57.1mmL 乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA2H.O 37.2g 灭菌双蒸水定容至1000mL,用时稀释至1×TAE C.2检测步骤 C.2.1核酸提取 称取0.1只样品加液氮研磨成粉末状,迅速将其移人灭菌的1.5mL离心管中,加人1mL的TrizoL 试剂,剧烈振荡3min;4C12000r/min离心10min;将上清液移人一新离心管中,加人0.5mL氯仿， 猛烈振荡15s;412000r/min离心15nmin;小心吸取上层无色水相到新离心管中;加人等体积异内 4c12000, 醇,混匀;室温静置10min;4 r/min离心10min,弃上清;加人1ml.75%的冷乙醉洗涤沉淀; 410000r/min离心10min,弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后溶于30AL.DEPC-H.0中,-20笔保 存备用 注，此处以0.1l只样品为例进行核酸提取,实际检渊时如样品量有变化,加人的试剂可按比例调整;或者按照商品化 RNA提取试剂盒进行操作 C.2.2引物序列 上游引物H835'-TGGTCCCACTCAGAGCTCAACAAAG3' 下游引物c537.5'-AcccccAAAAGTGTcGAAATcTAAA3" 产物大小:455bp C.2.3反转录 反应体系:20aL;在0.2ml PCR管中加人总RNA1L,dNTPs(10mmol/L)1L,DEPC-H.O 10AL,引物C537(20mol/L)2L.70C保温5min;冰上放置5min;再加人5×反转录buffer4AL RNasin(40U/L)1 ，M-MLV200U/L)1ML,42C保温1h,得到cDNA后用作PCR的模板 kL. C.2.4PCR扩增 反应体系:20L;在0.2mLPCR管中加人10×PCRbuffer(含Mg+)2AL,dNTPs(10mmol/L
GB/T33114一2016 0.6L,正向引物及反向引物(均为20丝mol/L)各0.5L.Taq酶(2U/AL)1AL,模板2L和DEPC H.O13.4L 设置阳性对照、阴性对照及空白对照 反应程序;94C40s;60c1min;72c1min;35次循环;7210min. 注:如采用商品化一步法RT-PCR检测试剂盒,可按照说明书进行操作,将步骤C.2.3和C.2.4合并进行 c.2.5PCR产物琼脂糖凝胶电泳 制备1%的琼脂糖凝胶,按比例混匀电泳上样缓冲液和CR扩增产物,用DNAMarker作为分子 量标记,进行电泳 电泳结束后在凝胶成像仪中观察是否扩增出预期的特异性DNA条带,并拍摄 记录 c.3结果判定 阳性对照在455bp左右处有条带,阴性对照和空白对照无特异性条带,待测样品出现与阳性对照 -致的条带,判定为阳性 阳性对照在455bp左右处有条带,阴性对照,空白对照及待测样品无特异性条带,判定结果为 阴性
GB/T33114一2016 附 录D 规范性附录 实时荧光RT-PCR检测 D.1试剂 核酸提取试剂同C.1.1 IaqManOne-stepRT-PCRMixture D.2引物探针 上游引物PNRSV-F;5'-AATGCCCTGTcTAGGAAGGGGTT-3' 下游引物PNRsV-R:5'-CGCAAAAGTGTCGAAATCTAAATC-3' 探针PNRsV-Probe:5'-FAM-GGTTcTTGAAGGACCAACCGAGAGGTAMRA-3" D.3核酸提取 方法同C.2.1 D.4实时荧光RT-PCR反应 反应体系;0,2ml离心管中加人2×OneStepRT-PCRBuffer川10Al,ETaqHs(5U/L) 0.4AL,PrimeSeriptRT Mixl0.4AL，PNRsV-F10me nol/L)0.4Al，PNRsV-R EBn3yme 10Mmol/L)0.4"l,PNRSV-Probe(10mol/L)0.6Al,ROXReferenceDyel0.4AL,模板RNA 2AL,补DEPC-HH.0至20AL 设置阳性对照、阴性对照及空白对照 反应程序:4210min;9510s;95C15s,621min n,共45个循环 D.5结果判定 在空白对照及阴性对照无C值且无扩增曲线、阳性对照C值<30并出现典型扩增曲线的条 件下 待测样品的Ct值>40时,判定PNRsV阴性 待测样品的Ct值<35时,判定PNRsV阳性 待测样品的Ct值小于40而大于35时,应重新进行测试;如果重新测试的Ct值>40,判定PNRsv 阴性;如果重新测试的C值小于40而大于35,且分离曲线明显时,则判定结果为阳性 10o

李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法GB/T33114-2016

引言

李属坏死环斑病毒是一种常见的植物病毒，能够感染众多的果树、茶树、花卉等植物，给农业生产带来很大的危害。因此，对于患有李属坏死环斑病毒的植物进行及时的检测和鉴定至关重要。

检疫鉴定方法

GB/T33114-2016《植物病毒检疫技术规范》是我国针对植物病毒检测和鉴定制定的标准，其中也包括了李属坏死环斑病毒的检测方法。

具体的检测方法如下：

1. 采样：将叶片、茎、根等植物样品采集后，用无菌水或生理盐水清洗干净并晾干。
2. 提取RNA：将准备好的植物样品粉碎后，加入TRIzol试剂（或其他RNA提取试剂），按照说明书进行RNA提取。
3. RT-PCR扩增：使用特异性引物进行RT-PCR扩增，并进行相应的电泳分析。
4. ELISA鉴定：利用李属坏死环斑病毒的抗体进行ELISA鉴定。
5. PCR-RFLP分析：对于RT-PCR扩增产物阴性样品，可以使用PCR-RFLP进行进一步确认。

通过上述的检测和鉴定方法，可以快速、准确地检测出患有李属坏死环斑病毒的植物，并避免其在种植过程中造成更大的危害。

结论

李属坏死环斑病毒是一种常见的植物病毒，其检测和鉴定对于农业生产具有重要意义。GB/T33114-2016标准中提供了一系列的检测和鉴定方法，可以帮助我们快速、准确地检测出患有该病毒的植物。

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2022/10/1 18:01:53 现行