国家标准 GB/T19167一2020 代替GB/T19167一2003 传染性法氏囊病诊断技术 disease Diugmostictechmiquesforinfectousursal 2020-12-14发布 2020-12-14实施国家市场监督管理总局发布国家标涯花警理委员会国家标准
GB/T19167一2020 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准代替GB/T19167一2003《传染性囊病诊断技术》,与GB/T19167一2003相比,除编辑性修改外,主要技术变化如下 -将“传染性囊病”和“传染性法氏囊病”统一为“传染性法氏囊病”; -增加了规范性引用文件(见第2章) 增加了缩略语(见第3章) -增加了器材和试剂见第5章、第6章、第7章、第8章、第9章); 增加了临床诊断(见第4章); 增加了实验室诊断样品采集(见第5章); -删除了直接免疫荧光法(见2003年版的2.5.2); 删除了酶联免疫吸附试验见2003年版的第5章); 增加了RT-PCR检测方法(见第7章、附录C,附录D) 增加了实时荧光RT-PCR检测方法(见第8章、附录E); 删除了血清抗体的检测(见2003年版的第4章); -增加了细胞培养分离病毒检测方法(见9.4.l、附录F); 增加了诊断结果的综合判定(见第10章) 请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由农业农村部提出本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAc/Tc181)归口本标准起草单位;动物卫生与流行病学中心、北京市农林科学院畜牧兽医研究所、农业科学院哈尔滨兽医研究所本标准主要起草人:蒋文明、陈继明、刘月焕、王笑梅、王静静、刘爵、高玉龙、李阳、于晓慧,刘朔、庄青叶、李金平、侯广宇、祁小乐、王素春,刘华雷本标准所代替标准的历次版本发布情况为: GB/T191672003
GB/T19167一2020 引言传染性法氏囊病(Infectiousbursaldisease, ,IBD)又称甘布罗病(Gumborodisease),由双股RNA 病毒科(Birnaviridae)禽双股RNA病毒属(Avibir us)传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起火鸡、 naru. 鸭、珍珠鸡和鸵鸟均可感染IBDV 3周龄~6周龄的鸡发病急而且重,病死率高,而1周龄3周龄鸡常呈现亚急性或亚临床症状该病毒侵害法氏囊可引起严重免疫抑制已知IBDV有两个血清型,即血清1型和2型,仅1型对鸡有致病性,火鸡和鸭为亚临床感染,2型未发现有致病性本病具有特征性临床症状和眼观病变,可做出初步诊断,确诊应进行病原检测 2003年之后,国内外IBD诊断技术发展快速一些更为简便和准确的诊断新技术已经成为IBD诊断和预防的重要手段本次对IBD诊断技术的修订,目的有二;一是与国际标准基本保持一致,改变国家标准显著滞后于国际标准的状况;二是将一些在国内外经过多年实践证明成熟可行的新技术纳人进来.改变原有标准中检测技术偏少且显著滞后于实际应用的状况修订此标准,有利于我国IBD诊断和预防,也有利于提升国家标准的权威性和实用性本标准参考oIE(陆生动物诊断试验和疫苗标准手册)(2016版),并结合我国相关技术研究新成果进行修订
GB/T19167一2020 传染性法氏囊病诊断技术范围本标准规定了传染性法氏囊病临床诊断和实验室诊断的技术要求本标准适用于鸡传染性法氏囊病的诊断、检测、监测和流行病学调查其中琼脂凝胶免疫扩散试验、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光反转录聚合酶链式反应(实时荧光RT-PCR,病毒分离等诊断方法适用于临床疑似样本的检测与病毒分离,琼脂凝胶免疫扩散试验方法还适用于免疫抗体水平检测规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB19489实验室生物安全通用要求缩略语下列缩略语适用于本文件 AGID,琼脂凝胶免疫扩散试验(Agargelimmunodiffusiontest) CEF;鸡胚成纤维细胞(ChickembryofibroblastcelD) CPE,细胞病变(Cytopathicefect) BD传染性法氏囊病(Infeetiousbursaldisease) BDV传染性法氏囊病病毒(Infecetiousbursaldiseasevirus) PBSs;磷酸盐缓冲液(Phosphatebufferedsaline) PCR;聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction) RT-PCR:反转录聚合酶链式反应(Reversetranseription-polymerasechainreaction) RealtimeRT-PCR;实时荧光反转录聚合酶链式反应(Realtimereversetranseription-polymerase chainreaction SPF;无特定病原体(Speeifcpathogenfree TAE:三胫甲基氨基甲炕-乙酸-乙二胺四乙酸Trihydroxymethylatminomethane-aceticacid ethylenediaminetetraaceticacid 临床诊断 4.1流行病学 4.1.1自然感染仅发生于鸡,各种品种的鸡都能感染 4.1.2主要发生于2周龄15周龄的鸡3周龄~6周龄的鸡最易感,而1周龄3周龄鸡常呈现亚急性或亚临床症状 4.1.3常呈急性发病,传播迅速,通常在感染后第3天开始死亡,5d7d达到高峰,后快速下降
GB/T19167一2020 4.2临床症状 4.2.1潜伏期为2d~3d. 4.2.2易感鸡群感染后发病突然,病鸡体温突然升高,病鸡出现腹泻,排出白色黏稠或水样稀便,病程 -般为1周左右 4.2.3急性病鸡可在出现症状1d~2d后死亡,鸡群3d~5d达死亡高峰,以后逐渐减少 4.2.4随着病程的发展,食欲废绝,颈和全身震颤,病鸡步态不稳,羽毛蓬松,精神委顿,卧地不动,呼吸困难,泄殖腔周围的羽毛被粪便污染 4.2.5后期病鸡脱水严重,趾爪干燥,最后衰竭死亡 4.3剖检变化 4.3.1严重者腿部和胸部肌肉有条索状或斑块状出血 4.3.2法氏囊水肿和出血,体积增大,重量增加,严重者呈紫黑色、葡萄状;部分法氏囊出现萎缩 4.3.3有些法氏囊淡黄色水肿 4.3.4肾肿大褪色,肾小管有尿酸盐沉积,呈红白相间“花斑肾” 4.4结果判定符合上述流行病学特征、临床症状和剖检变化的病例,可以判为疑似IBD 确诊应采集有临床症状动物的法氏囊等组织或血清进行实验室诊断 5 实验室诊断样品采集 5.1器材 5.1.1手术剪刀和锻子 5.1.2离心管 5.1.3样品保存管 5.1.4组织匀浆器 5.1.5采血器 5.2试剂 5.2.10.01mol/LpH7.2PBS,配方见附录A中A.1 5.2.2青霉素 5.2.3链霉素 5.3样品采集 5.3.1生物安全措施按照GB19489的要求进行 5.3.2组织病料采集采集多只病鸡的法氏囊,分别装人样品保存管,密封冷冻保存 5.3.3血清样品采集经翅静脉采集鸡血液,每只应不少于1ml 无菌分离血清,装人2mL离心管中,密封后2C一8C
GB/T19167一2020 冷藏或一20C冷冻保存 5.4样品处理用剪刀剪碎法氏囊组织,加人含青霉素4000IU/ml和链霉素40004g/ml的PBS,用组织匀浆器制成20%匀浆,反复冻融2次一3次,1000o r/min离心10min,取上清作为检测材料琼脂凝胶免疫扩散试验(AGID) 6.1器材 6.1.137C温箱 6.1.2烧杯(200mL) 6.1.3搅拌棒 6.1.4电磁炉 6.1.5微量可调移液器(104L、,100AL、1000L等不同规格. 6.1.6灭菌平皿(9cm15 cm 6.1.7打孔器(中心1孔,周围6孔,孔径3mm,孔距4 mm 6.2试剂 6.2.1标准IBD琼扩阳性抗原(参见附录B的B.l). 标准ID琼扩阴性机原(参见B2. 6.2.2 6.2.3标准BDV阳性血清(参见B.3) 6.2.4标准IBDV阴性血清(参见B.4) 6.2.5琼脂糖 6.2.60.01nmmol/1磷酸缓冲液(pH7.4),配方见A.2 6.2.7氯化钠 6.3试验程序 6.3.1琼脂平皿制备参见B.5 6.3.2打孔、封底在制备好的琼脂板上用打孔器打孔,并挑出孔中的琼脂中心1孔,周围6孔,孔径3mm,孔距在火焰上封底 4mm， 6.3.3加样、孵育、观察 6.3.3.1病原检测中央孔加人标准IBDV阳性血请,第1孔、第4孔分别加人标准BD琼扩阳性抗原和标准BD琼扩阴性抗原,其他孔分别加人待检样品,20L/孔静置5min~10min,将加样后的平皿轻轻倒置放人填有湿纱布的盒内,置于37C温箱,在24h、48h观察并记录结果 6.3.3.2抗体检测中央孔加人标准IBD琼扩阳性抗原,第1孔、第4孔分别加人标准IBDV阳性血清和标准IBDV阴性血清,其他孔分别加人待检样品;或第1孔加人标准IEBD阳性血清,其他孔分别加人倍比稀释的待检
GB/T19167一2020 血清,20AL/孔静置5 min~10min,将加样后的平皿轻轻倒置放人填有湿纱布的盒内,置于37C温箱,在24h,48h观察并记录结果 6.4试验成立条件 24h,标准IBDV阳性血清与标准IBD琼扩阳性抗原孔之间形成清晰沉淀线,标准IBDV阳性血清与标准IBD琼扩阴性抗原孔之间未形成清晰沉淀线 6.5结果判定 6.5.1病原检测 24h或48h,待检样品孔与标准IBDV阳性血清孔之间出现沉淀线,且与标准IBD琼扩阳性抗原沉淀线末端相吻合时.待检样品判为阳性;标准IBD琼扩阴性抗原孔和待检样品孔与标准IBD阳性血清孔之间无沉淀线出现时,待检样品判为阴性(参见图B.1) 6.5.2抗体检测待检血清孔与标准IBD琼扩阳性抗原孔之间出现沉淀线，且与标准IBDV阳性血清沉淀线末端相吻合时,待检血清判为阳性;待检血清孔与标准BD琼扩阳性抗原孔之间无沉淀线出现时,待检血清判为阴性(参见图B.2) 标准IBD琼扩阳性抗原孔与待检血清之间形成清晰沉淀线的血清最高稀释倍数,即判为待检血清琼扩效价反转录聚合酶链式反应(Rr-CR 7.1器材 7.1.1PCR扩增仪 7.1.2台式低温高速离心机 7.1.3电泳仪和水平电泳槽 7.1.4凝散成像仪(或紫外透射仪) 71s 微量可调移液器(10AL、100L、l000AL等不同规格 7.1.6去核酸酶水处理的离心管与吸头 7.17PCR扩增管 7.2试剂 7.2.1RT-PCR试剂 7.2.1.12× 一步法RT-PCR缓冲液 7.2.1.2TaqDNA聚合酶-反转录酶-RNA酶抑制剂混合物 7.2.1.3灭菌去离子水 7.2.1.4引物 7.2.1.4.1上游引物十290;5'-AGATTCTGCAGCCACGGTCTCT-3' 7.2.1.4.2下游引物一861:5'-TTGATGACTTGAGGTTGATTTT-3' 7.2.2电泳试剂 7.2.2.1电泳缓冲液;50×TAE贮存液(配方见A.5),临用时加蒸僧水配成1×TAE缓冲液(配方见A.6)
GB/19167一2020 7.2.2.2琼脂糖;低熔点琼脂糖 7.2.2.3电泳加样缓冲液;配方见A.7 7.2.3DNAMarker(标准分子量分子大小范围100bp2000bp 7.3样品准备 7.3.1本方法适用所有的IBD病原样品种类,包括法氏囊组织、鸡胚接种物、细胞培养物等 7.3.2阳性对照:已知病毒材料,如lBDV感染的鸡胚或细胞 7.3.3阴性对照:IBDV阴性的鸡胚或细胞 7.4试验程序 7.4.1核酸提取 7.4.1.1异硫氮酸肌法抽提核酸见附录C 7.4.1.2核酸提取等效方法可采用等效病毒RNA提取试剂或试剂盒进行核酸提取 7.4.2核酸扩增 7.4.2.1引物;将引物(十290/-861)稀释到工作浓度10pmol/L 7.4.2.2PCR反应混合液配制:每个PCR管中依次加人4.5ALddH.O,12.5AL2×一步法RT-PCR 缓冲液、各1AlL上下游引物(+290/-861)、lL.TaqDNA聚合酶-反转录酶-RNA酶抑制剂混合物 7.4.2.3RT-PCR扩增;其中2个PCR管中分别加人5Al阳性对照RNA提取物和5AL阴性对照 RNA提取物;在其他PCR管中分别加人5L待检样品RNA模板盖紧管盖,放人扩增仪中按照设定程序扩增;50C30nmin;94C预变性2min;然后进行35个循环;95C变性30s,57C退火30s、 72C延伸45s;最后72C延伸5min;4C保存备用 7.4.3电泳 7.4.3.1 1.0%琼脂糖凝胶板的制备;称取1虽琼脂糖,加人I00mL1XTAE缓冲液中加热融化后加 lL核酸染料(如Gelred),混匀后倒人放置在水平台面上的凝胶盘中,胶板厚5mm左右依据样品数选用适宜的梳子待凝胶冷却凝固后拔出梳子胶中形成加样孔),放人电泳槽中,加1×TAE缓冲液淹没胶面 7.4.3.2加样;取64L8LPCR扩增产物和2AL加样缓冲液混匀后加人一个加样孔每次电泳同时设标准DNAMarker、阴性对照、阳性对照 7.4.3.3电泳;电压80V100V或电流40mA一50mA,电泳30min一40min 最后,由凝胶成像系统观察并拍照记录 7.5试验成立条件电泳结束后,取出凝胶置凝胶成像仪(或紫外透射仪)上观察阳性对照电泳结果应出现594bp扩增条带,同时阴性对照无扩增条带
GB/T19167一2020 7.6结果判定符合7.5的条件,被检样品扩增产物电泳出现594bp目标条带,符合阳性序列的特征,判为IBDV 核酸阳性(参见附录D);被检样品无扩增条带,判为IBDV核酸阴性 8 实时荧光反转录聚合酶链式反应(Rea-timeRT-CR 8.1器材 8.1.1荧光定量PCR扩增仪 8.1.2台式低温高速离心机 8.1.3微量可调移液器(10AL、100pL、1000L等不同规格) 8.1.4离心管与吸头 8.1.5PCR扩增管(0.2mL) 8.2试剂 8.2.1RT-PCR试剂 8.2.1.1 荧光定量RTcR试剂众 8.2.1.2灭菌去离子水 8.2.1.3引物和探针 8.2.1.3.1IBDvVP5F;5'-GAGccTTcTGATGcCcAAcAAC3' 8.2.1.3.2IBDVP5R;5'-CAAATTGTAGGTcGAGGTcTcTGA-3' 8.2.1.3.3IBDVprobe;FAM-CGGCGTcCATTccGGAcGAC-BHQ1 8.3样品准备见7.3 8.4核酸提取见7.4.1 8.5核酸检测 8.5.1将引物(IBDVP5F/IBDVP5R)和探针IBDVprobe)稀释到工作浓度10pmol/AL 8.5.2按照荧光定量RT-PCR试剂盒说明书配置反应体系,每个CR管中加人各1AL上下游引物、 0.54L探针 8.5.3在其中一个PCR管中加人5LIBDVRNA,设为阳性对照;在另一个PCR管中加人5超纯水,作为阴性空白对照;在其他PCR管中分别加人5AL待检样品RNA模板 8.5.4实时荧光RT-PCR反应程序为:50C反转录10min;95C预变性5min;然后进行40个循环 9510s,60C30s(检测荧光信号. 8.6试验成立条件阳性对照品扩增曲线有明显对数增长期，且Ct值<32;同时阴性对照品扩增曲线无对数增长期(参见附录E).
GB/19167一2020 8.7结果判定 8.7.1试验成立,样品Ct值35,且出现标准的S形扩增曲线,判为阳性 8.7.2样品无Ct值或Ct值>38,且无标准扩增曲线,判为阴性 8.7.3样品35GB/T19167一2020 液,按9.4.1.2.1所述方法再接种生长48h的单层细胞进行盲传,即1mL第1代细胞/病毒液加4ml 细胞维持液,37C培养如此盲传3代 g.4.2鸡胚分离病毒 9.4.2.1 接种病毒 g.4.2.1.1将样品经绒毛尿囊膜接种于5枚9日龄~11日龄的SPF鸡胚具体操作如下;分别在鸡无血管处和气室顶端打一小孔,用吸球在气室顶端孔处抽吸以制造人工气室,然后用注射器于鸡胚无血管处接毒,0.2mL/枚,之后将所打孔用蜡封闭,继续孵化 g.4.2.1.2每日照胚,接种48h内死亡的鸡胚弃去不用收集接种48h后死亡鸡胚,检查鸡胚病变血清】型IBDV的初次分离物就可引起部分鸡胚死亡病变表现为萎缩皮下水肿、充血,皮下或颅内出血,肝脏肿大,不均匀地充血、呈致斑驳病变晚死的鸡胚肝肿大、变绿,有坏死灶;脾肿大,肾水肿,充血,呈斑纹状血清II型IBDV不能引起感染鸡胚的皮下水肿和出血,但表现胚体小,呈灰黄色 9.4.3鸡接种试验取3周龄一6周龄的SPF鸡5只,每只滴眼0.05mL样品接种后72h一96h将鸡处死,检查法民囊、肾脏和胸肌有无病变 9.5病毒鉴定对出现CPE的细胞培养液,出现病变的鸡胚和病死鸡,选用第7章或第8章进行核酸鉴定,也可选用第6章进行病原鉴定 9.6结果判定 9.6.1细胞盲传3代未见细胞病变或鸡胚传代未见病变,且经第6章、第7章或第8章中规定的任一方法检测阴性者,判定病毒分离阴性 9.6.2对出现CPE的细胞培养液或出现病变的鸡胚，经第6章,第7章或第8章中规定的任一方法检测阳性者,判为病毒分离阳性 10 综合判断 0.1符合第4章的流行病学特点、临床症状和剖检变化的病鸡,初步判断为IBD疑似病鸡 0.2IBD疑似病鸡按照第6章,第7章,第8章或第9章中规定的任一方法,检测为病原学阳性的,判断为IBD确诊病鸡 0.3不符合第4章的流行病学特点、临诊症状和剖检变化的鸡,临床无明显特异症状的动物(结合疫苗免疫状况)但是按照第6章、第7章、第8章或第9章中规定的任一方法,检测为病原学阳性的,判断为IBDV感染鸡
GB/19167?2020 ? A 淶?? ?(?? A.10.01mwl/LPspH7.2) ?(NNaCI 8.0g ?KCI 0.2g (Na;HPO12H.O) 2.9g 0.2 (KHPO g ?? 800ml pH 7.2 1000ml ?? 121C?30min,4C?á A.20.01mol/L??p7.4) 0.2 ?KCI (NaHPO12H.O) 2.9g (KH.PO. 0.2g 800mL ?? 7.4 pH ?? 1000ml 121C?30min,4C?á PBST[0.05%()-200.01mol/LPBs,pH7.27. 0.01mol/LPBS 1000ml -20 0,5ml A.4????? A.4.1Eagle's-MEM Eagle'MEM??.Eagle'-MEM?95g,??1000ml??,4C 汸á A.4.2??? 90ml Eagle's-MEM?? 0mL ??
GB/T19167?2020 5%?(NaHcO.)pH7.27.4 A.4.3??? 98mL Eagle's-MEM?? ?? 2mL 5%?(NaHcO.)pH7.67.8 A.4.40.25%? 100mL Eagle's-MEM?? ? 0.25g ??-20汸 A.550xTAE? ?(Tris) 242.0g 57.1mL 100.01 0.5mol/L?(EDTA)(pH8.0) ml ??1000ml A.61TAE? ??50TAE50??ɡ A.7?? ? 0.25" 30.0nmL ?? 70.0mL A.8?? ?0.64g?0.415g,?B?0.7ml,???? ,50mL????33mL.25g.,??4C汸á A.92mol/LpH4.0 9 CH,coONa3H.o g ??? 40.0ml ??ddH.O,?pH?4.5,ddH.070mL,?,? ? 10
GB/T19167一2020 A.10酚:三氯甲炕:异戊醇(25:24:1 将水饱和酚(pH5.0)、三氯甲婉、异戊醉按照体积比25:24:1配置混匀,装人棕色瓶,最后加人 0.lmol/L的Tris-HCl保护液,4冰箱保存备用 11
GB/T19167一2020 录附 B 资料性附录) 琼脂凝胶免疫扩散试验材料制备方法 B.1标准IBD琼扩阳性抗原制备将血清!型标准IBDV毒株用PBS稀释后滴眼接种约3周龄的SPF鸡接种3d后将鸡处死,无菌采集法氏囊称重后分别加人等体积的低温蒸僧水(或适宜的缓冲液如PBS或胰蛋白磷酸盐肉汤和等体积三氯甲烧(注意:三氯甲婉有毒并可能致癌,因此要安全地操作和处理;可以用毒性较小的三氯三氟乙婉代替三氯甲烧) 再用组织搅拌器充分搅碎,2000离心30min,收集上清液,用2mL冻存管分装(每管100AL),置一80C备用该上清液用PBS稀释成10%体积分数)后,可用于上述SPp 鸡的接种用作抗体检测时,可在分装前灭活病毒;于收获的上清液中加0.3%体积分数)-丙内酯,在振荡器上作用2h,作用温度为37C 在sSPF鸡胚中传代三次进行病毒分离,以核检灭活效果 B.2标准IBD琼扩阴性抗原制备使用正常SPF鸡的法氏囊组织制备,方法同B1 B.3标准IBV阳性血清制备来自专业实验室,并经过质量检验,通常是用IBDV标准毒株点眼接种于4周龄5周龄的SPp 鸡,接种后28d采血制备的血清取已知含有IBD活毒的法氏囊组织(10%)匀浆上清液0.05mlL,点眼接种于4周龄5周龄的 SPF鸡,接种后28d采血制备血清,小量分装,置一20丫备用 B,4标准IBDV阴性血清制备采集sSPF鸡血,制备血清,小量分装,置-20笔备用 B.5琼脂平皿制备取NaCl80g、KHPO0.2g.NaHPO12H.O2.9g、琼脂糖10g,加蒸僧水至1L(25C时pH 7.1),l15C15min灭菌,置4C备用在试验前的24h到7d内将琼脂平皿准备好,先在微波炉等加热装置中融化琼脂糖(注意:不要让水等其他外源物质进到琼脂糖瓶内,然后将平皿水平放置,再把融化的琼脂糖倒人一个9em的平皿内，琼脂糖厚约3 mm 将平皿盖好,待琼脂糖凝固后储存在4C可以放7d 如果需当天使用,则需将平皿盖打开,在 37C温箱中倒置干燥30min1h 检测结果示意图如图B.1和图B.2所示 12
GB/19167一2020 Ab 说明 Ab -标准传染性法氏囊病毒阳性血清; 标准传染性法氏囊病毒琼扩阳性抗原. -标准传染性法氏囊病毒阴性抗原 2,3,5,、6 待检样品抗原检测示意图图B.1 Ag 说明 Ag 标准传染性法氏囊病毒琼扩阳性抗原; 标准传染性法氏囊病毒阳性血清标准传染性法氏囊病毒阴性抗原 2,3、5,6 待检血清或者 -标准传染性法氏囊病毒阳性血清; 倍比稀释的待检血清 26 图B.2抗体检测示意图 13
GB/T19167一2020 录附规范性附录) 异硫氧酸腻法提取总RNA 总RNA提取方法如下取待检样品、阴性对照、阳性对照各200L分别置于1.5mL离心管中,每管加人400L裂解 a 液(见A.8),反复混匀,冰水浴5min 每管分别加人60L2mol/L乙酸钠(pH4.0),混匀 b 每管加600AL酚;三氯甲烧:异戊醉(25:24;1)混合液,混匀,冰水浴5min. c d 4C,12000r/min离心10min 将上清液转人另一洁净离心管加人等体积异丙醇,混匀,室温放置15nmin e fD 4C,12000r/min,离心10min,小心地倒掉上清尽量倒干液体,留下RNA沉淀加1000L75%乙醇颠倒洗涤沉淀,4C、,10000r/min离心5min,小心倒干液体,室温干燥日 5min~10min h 每管加20无核酸酶水,用于溶解RNA 总RNA提取液可立即用于PCR扩增,也可一70C 冰箱保存备用 14
GB/19167一2020 录附 D 资料性附录 RI-PCR电泳及阳性序列 D.1RT-CR电泳示意图 RT-PCR电泳示意图见图D.1 M 说明: M -DNAMarkerDL.2000; 泳道1 -阴性对照; 泳道2 阳性对照; 泳道3、泳道4 检测样品图D.1RT-CR电泳示意图 D.2阳性序列 AGATrcIG;CAGc CTGACcTAGcTTGGA CATTGGAGACCAGGA CCCAATGCGTACCCGCCCGATATCGC GTACCACTCACAAGGGTGCCGTCAAGGATGTTGGTTCTGACGGGCGACGTAGATGGGGAAT TTGAGGTTGAGGACTACCTTCCCAAAATCAACCICAAGTCATCAA 注:黑体为引物序列 15
GB/T19167一2020 录附资料性附录) 实时荧光Rr-PCR扩增示意图实时荧光RT-PCR扩增示意图见图E.1 IBDV阳性对照 1001 检测样品 75 0 25 阴性对照0 5 4O 15 35 扩增循环数图E.1IBDV实时荧光RI-PCR扩增示意图 16
GB/T19167一2020 附录 F 资料性附录 CE细胞制备方法 CEF细胞制备方法如下将选好的9d10d发育良好的SPF胚用5%的碘棉消毒蛋壳气室部位,再用酒精棉脱碘 a 无菌取出鸡胚,放人灭菌的玻璃皿内,用pH7.2的PBS冲洗一次,去头、四肢和内脏再用 b pH7.2的PBS冲洗两次用剪刀剪成小块(2mm3mm=),用pH7.2的PBS冲洗两次 c d 约加4mL.0.25%胰酶溶液,38消化30nmin,期间15min轻摇一次 e 消化结束,弃掉胰酶消化液,用pH7.2的PBS冲洗两次,再用细胞培养液冲洗一次加人适量的细胞培养液,用刻度吸管反复吹打使细胞充分分散). f0 将细胞分散液倒人带6层~8层纱布的100ml烧杯中(过滤之前先用少许细胞培养液润湿纱 g 布),加人适量培养液(40mL/胚),过滤重复上述操作重虑一遍 h 计数,要求滤液中活细胞浓度应为1×10'个/ml~1.5×10个/mlL 分装培养瓶中(4mL/瓶一5 mL/瓶),置37C培养箱培养状态良好(细胞透明度大,轮廓清晰)的细胞适宜病毒接种 17

传染性法氏囊病诊断技术GB/T19167-2020

传染性法氏囊病是由牛离体成虫在肠道内寄生引起的一种重要寄生虫病。该病严重影响了畜牧业的发展和农牧民的经济收入。因此，良好的诊断技术对于预防和控制该病具有重要意义。

近年来，随着分子生物学和免疫学等领域的快速发展，越来越多的先进技术被应用于传染性法氏囊病的诊断中。其中，GB/T19167-2020诊断技术标准是一项非常重要的参考依据。

GB/T19167-2020诊断技术标准概述

GB/T19167-2020诊断技术标准是由中国农业行业标准化技术委员会牵头制定的，它规范了传染性法氏囊病诊断过程中的实验室操作、检测方法和结果判定等方面。该标准主要包括以下内容：

样品采集及处理
酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法
分子生物学检测方法
结果判定和质量控制

该标准的实施可以有效提高传染性法氏囊病的诊断准确性和标准化水平，促进了行业的规范化发展。

GB/T19167-2020与其他技术的比较

相对于传统的诊断方法，GB/T19167-2020标准引入了先进的检测技术，具有以下优点：

快速性：采用ELISA检测方法，可以在较短时间内得出结果。
灵敏度高：分子生物学检测方法可以检测到感染量非常少的寄生虫DNA，具有较高的灵敏度。
特异性强：该标准通过多重检测方法，可以明确识别传染性法氏囊病与其他疾病的区别。

结语

GB/T19167-2020是当前传染性法氏囊病诊断技术的最新标准，它引入了先进的检测技术，并规范了实验室操作、检测方法和结果判定等方面。该标准的实施对于传染性法氏囊病的预防和控制具有重要意义。