国家标准 GB/T31805一2015 豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofCowpeaseveremnosaievirus 2015-07-03发布 2015-11-27实施中毕人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布中国国家标准化管厘委员会国家标准
GB/T31805一2015 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标准起草单位;厦门出人境检验检疫局、江苏出人境检验检疫局本标准主要起草人;陈青,李彬、方志鹏、黄峰、廖富荣、陈红运、林石明
GB/T31805一2015 豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法范围本标准规定了豇豆重花叶病毒检疫鉴定的血清学,生物学和分子检测方法本标准适用于可能携带有豇豆重花叶病毒的植物繁殖材料(种子、植株)和产品的检疫鉴定仪器设备和主要试剂 2.1仪器设备 PCR仪、定量PCR仪、灭菌锅、制冰机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器,电泳仪、凝胶成像系统、微量研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平(感量;0.0o1g),水平电泳槽、高速冷冻台式离心机、水浴槽、 pH计、移液器(1000L,200L,20AL2L),96孔酶标板、研钵等;防虫温室 2.2主要试剂除另有规定外,所有试剂均为分析纯 PCR缓冲液,dNTPsdATP,dTTP,dCTP,dGTP),DNA 聚合酶、引物和探针,琼脂,酶联检测试剂见附录B 检测样品的制备 3.1种子挑取畸形种子播于灭菌土中,待长出3片4片叶后,将表现症状的植株编号,未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号采集的叶片分成2份,根据需要分别用于酶联测定和分子检测 3.2植株有症状(如叶片畸形、花叶、斑驳等)的植株编号单独检测没有症状的分组并编号检测,分组方法和检测方法同3.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定检测与鉴定 4.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定把制备的样品上清液加人已包被CPSMV抗体的酶联板中,进行DAS-ELISA 每个样品平行加到两个孔中设阴性对照和阳性对照[健康的植物组织作阴性对照,感染了CPSMV的植物组织作阳性对照,其中阴性对照种类和材料(如种子或叶片)应尽量与检测样品一致],样品提取缓冲液作空白对照,不同的检测试剂或试剂盒按说明操作具体操作见附录B 4.2RT-PCR 分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后,进行PCR扩增健康的植物组织作阴性对照,感染CPSMV的植物组织作阳性对照用超纯水作空白对照具体操作见附录C
GB/T31805一2015 4.3IC-RTReal-timePCR 分别提取样品和对照的总RNA,进行ICRTreal-timePCR检测健康的植物组织作阴性对照,感染CPSMV的植物组织作阳性对照,超纯水作空白对照具体操作见附录D 4.4生物学测定样品按1:2~1:10(质量:体积)加人研磨缓冲液,在研钵中研碎研碎后放人硅藻土浓度为 0.5%)并与病汁液混匀,接种到鉴别寄主上具体操作参见附录E 结果判断样品经DAs-ELISA、普通RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阴性时,判定样品未检出豇虹豆重花叶病毒样品经DAS-ELISA检测结果为阳性,进一步用RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法进行检测 PCR结果为阴性,判定未检出豇豆重花叶病毒;PCR结果为阳性,可以判定为样品检出豇豆重花叶病毒结果记录与样品保存结果记录完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间,地点、方法和结果等,并要有经手人和实验人员的签字酶联测定需有酶联板反应的原始数据;PCR检测需有电泳结果图片及序列测定分析结果;实时荧光PCR需要有荧光曲线图与Ct值;生物学测定应有鉴别寄主的症状照片结果记录与资料保存期限至少1年 6.2 样品保存经检验确定携带CPsMV的样品应在合适条件下保存以备复核,种子保存在4C,病叶冻干保存在 -20C或者一80C冰箱中,做好标记和登记工作样品保存期限至少1年
GB/T31805一2015 懒录 1 资料性附录) 豇豆重花叶病毒相关资料 A.1背景资料豇豆重花叶病毒基本信息 A.1.1 学名:Coepeaseeremosaicirus 缩写;CPSMv 分类地位:豇豆花叶病毒属(Coouirus)成员 A.1.2方法原理豇豆重花叶病毒的分子生物学特性,血清学特性和生物学特性是本标准制定的主要依据 A.2自然寄主菜豆(Pha.seolasvulgaris),大豆(G/ycinema.r)、绿豆(Vignaradiata),豇豆(Vignasinensis),长豇豆(Vgnasesquipcdalis),毛蔓豆(Calopogoniummucunoides),直生刀豆(Canaaliaensi/ormis). 距瓣豆Centroemapubescens)，救麻Crolalariajucea)，Desmodiumcanescens，大翼豆 Macroptiliwmlathyroides),四棱豆(Psophocarpustetraugonolobus),Crotalariapaulinea A.3病害症状几乎所有的寄主在接种叶上形成褪绿斑或坏死斑,系统症状为斑驳或花叶,幼叶通常形成明显瘪状突起、畸形一些寄主表现系统坏死大豆;在巴西,受侵染的大豆出现植株矮化,芽枯、结荚数减少,产量降低毛蔓豆;出现严重花叶和疮状突起; 距瓣豆;出现褪绿和花叶症状; 麻;叶片出现褪绿斑驳和畸形或褪绿斑症状; 绿豆;叶片出现轻花叶和坏死斑症状豇豆;叶片出现褪绿花叶和严重畸形分布 A.4 美国、特立尼达(特立尼达和多巴哥共和国波多黎各岛、萨尔瓦多、哥斯达黎加、委内瑞拉、苏里南,巴西、秘鲁,墨西哥 A.5传播途径 CPSMV可以通过机械传播,花粉、种子传播,豇豆的种传率为10%,长豇豆(Vignasesquipcdalis)
GB/T31805一2015 的种传率为8%;也可以通过甲虫传播.主要是叶甲科甲虫传播,大约有10种,菜豆叶甲(Ceratomatri furata是最重要的传播介体,还可以通过带斑黄瓜叶甲(Diabroticabaleata)和南美叶甲(D.se ciosa)、Cerotomaruicornis等媒介昆虫传播 A.6抗原特性 CPSMV具有强免疫原性,容易制备高滴度的特异抗体粒体形态病毒粒体为等轴对称二十面体,直径25nm,无包膜 A.8基因组 CPSMV基因组由2条RNA组成,RNA-1和RNA-2由不同的病毒粒子包裹,RNA1包裹在沉降组分B的粒子中,RNA2包裹在沉降组分M的粒子中 RNA-1长5957nt;RNA-2长3732nt
GB/T31805?2015 ? B 淶?? ??? B.1? B.1.1 ???塣 B.1.2?? ????塣 B.1.3? (pNPP)100mg????100mL,á B.1.4??? (Na,SO. 1.3g ??(PvP)(Mw24000?40000y 20.0g 0,2 (NaN, 20tween-20 20mL 1L1PBST,pH7.4,4C?档 B.1.5 ? 1.59 ?(Na(CO g ?(NaHcO 2.93 (NaN, 0.2g 900ml??,pH9.6,??1L,4C?档 B.1.6PBS?(??? ?(NaCD) 8.0g (NaHPO 1.15 g 0.2 (KHPO g 0.2 ?(KC 0.5mL 20(Tween-20) 900mL??,pH7.4,?1L,4C?档 B.1.7????? 2.0g" ???(EBsA)?? 20.0 ??(PVP)(Mw2400040000 g (NaN, 0.2g
GB/T31805一2015 溶于1L1×PBST,调pH至7.4,！C冰箱保存 B.1.8底物(pNPP)缓冲液溶于800ml燕馏水: 氯化镁(MgCl 0.1 g 0.2 叠氮化钠(NaN, g 97mL 二乙醇胺溶于800mL蒸憎水中,用pH调至9.8,蒸憎水定容至1L,4C冰箱保存 B.2实验步骤 B.2.1 包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释,加人酶联板的孔中,100L/孔.37七孵育4h.请空孔中游被 PBsT洗涤3次 B.2.2样品制备样品按1:10(质量:体积)加人抽提缓冲液,用研钵研磨成浆,7500只离心10min,上清液即为制备好的待测样品阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行;空白对照为样品抽提缓冲液 B.2.3加样根据检测需要设计96孔(或48孔)酶联板,包括2个阴性对照孔、2个阳性对照孔、2个空白对照孔和多个待测样品孔加样量为100L/孔,每个样品设1个重复 4C冰箱孵育过夜,酶联板用PBST 洗涤3次 B.2.4加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度,并加人到酶联板中,100L/孔,37 孵育2h,PBST洗涤3次 B.2.5加底物将底物NPP加人到底物缓冲液中使终浓度为】mw/mL.现配现用)按10aL/孔.,加人到蹦联板中,室温避光孵育 B.2.6读数用酶标仪在30min、1h和2h于405nm处读OD值注:实际检测时,孵育温度.PBST洗涤次数和显色读数时间需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行 B.3结果判断对照孔的oD值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔),应该在质量控制范围内,即 B.3.1 缓冲液孔和阴性对照孔的oD值均<0.15; 当阴性对照孔的OD值<0.05时,按0.05计算阳性对照OD.值/阴性对照OD.值>5~10;重复性好
GB/T31805一2015 B.3.2在满足了B.3.1质量要求后,结果作如下判断样品OD值/阴性对照OD值>2,判为阳性; 样品OD值/阴性对照OD值<2,判为阴性; 样品OD值/阴性对照OD值接近2,判为可疑样品,需用其他方法验证 B.3.3若满足不了B.3.1质量要求,则不能进行结果判定
GB/T31805一2015 附录c 规范性附录 RT-CR检测 C.1试剂 C.1.1RNA提取试剂 TrizoL裂解液、三氯甲婉、异丙醇、75%乙醇 C.1.2反转录试剂 M-MLV反转录酶(200U/AL),5×反转录Bufler,dNTP(I0mmolL),Rnasin(40U/AL),焦磷酸二乙酯(DEPC)处理过的ddH,(O. C.1.3CR试剂 10×PCRBufer、dNTP(10mmol/L),DNA聚合酶(5U/L) C.1.4电泳试剂 C.1.4.150xTAs Tris 242g 冰醋酸 57.1m 乙二胺四乙酸二钠 37.2g 加去离子水定容至1L 用时加水稀释至1×TAE C.1.4.26×加样缓冲液 0.25%澳酚蓝 40%<质量:体积蔗糖水溶液 c.2实验步骤 C.2.1总RNA提取称取0.1g植物组织加液氮研磨成粉末状,迅速将其移人灭菌的1.5mL离心管中,加人1mL的 TrizoL试剂,剧烈震荡摇匀,室温静置3nmin;4C,12000发离心10nmin,取上清液;加人200L氯仿上下颠倒混匀,室温静止3min;4C,12000片离心10min,取上层水相;加等体积的异丙醉,颠倒混匀 4C,12000从离心10min,弃上清液;加1mL75%的乙醉洗涤沉淀,4C,7500片离心5min,弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后,溶于30l经DEPC处理的ddH.O,一20C保存备用 C.2.2RI-CR反应 C.2.2.1引物与产物 RT-PCR检测引物见表C.1
GB/T31805一2015 表c.1CR引物序列引物名称序列(5'-3” 扩增产物/bp ACACARGTIMGICCIGATAC,其中R=AG,1=IMP(次黄上游引物CPSMV-356f 356 噪岭核苷酸),M=C/AN GCTACIGGACTRCTRCTCA,其中I=IMP(次黄噪岭核下游引物CPsMV-356r 356 酸),R=A/G C.2.2.2eDNA合成反转录总体系为12.5L 在PCR管中依次加人3L总RNA,1AL下游引物CPSMV-356r(浓度为20pmol/AL)，65C温浴7min,然后冰浴5min,瞬时离心,再向PCR管中加人下列试剂:MMLV RT(200U/L)0.5l、5×RT缓冲液2.5Al,dNTP(10mmol/L)0.5Al,RNasin(40U/L)0.5L、 DEPC处理的ddH.o4.5L 反应参数:42C60min,95c10min 合成的eDNA于-20C冰箱保存备用 C.2.2.3PCR扩增 PCR反应体系见表C.2 反应参数:94C3min;9445s，52C45s，721min n,35个循环 72C延伸7min. 表C.2CR反应体系试剂名称加样量/l 10×PCRBuffer 2.5 dNTP(10mmol/1 1.0 CPSMV-356f(20pmol/L) 1.0 CPSMV-356r(20pmol/AL 1.0 DNA聚合酶(5U/AL 0.2 cDNA模板 3,0 aL.O 补足反应总体积至25山 c.2.3琼脂糖电泳制备凝胶 C.2.3.1 将1×TAE和电泳级琼脂糖按1.5%(质量:体积)配好,在微波炉中熔化混匀.冷却至55C左右加人澳化乙锭(浓度为0.5g/mL)，混匀,倒人已封好的凝胶平台上，插上样品梳待凝胶凝固后,从制胶平台上除去封带,拔出梳子,加人足够量的TAE(缓冲液没过凝胶表面约lm mm C.2.3.2加样取8AlLPCR产物与加样缓冲液按规定比例混匀,加人到琼脂糖凝胶孔中,使用的DNA标准分子量应与目的片段大小相匹配
GB/T31805一2015 c.2.3.3电泳接通电源,以5V/em(正、负极之间的距离)的电压进行电泳,当指示剂迁移至足够分离DNA片段时,关闭电源将整个胶置于凝胶成像仪上观察 c3结果判定如果阳性对照出现356p的条带,检测样品、阴性对照和空白对照未出现条带,可判定样品为阴性如果阳性对照及检测样品出现约356bp的条带,阴性对照和空白对照未出现条带,可判定样品为阳性 l0
GB/T31805一2015 附录D 规范性附录 c-RTrealtimePCR检测 D.1试剂 CPsMV抗体、包被缓冲液和PBST试剂见B.1;RNA提取和cDNA合成试剂见c.1.l;2× FastStartUniversalProbeMast(rox D.2实验步骤 D.2.1 包被抗体根据检测试剂说明,将包被抗体用包被缓冲液稀释(如1;200),取25Al稀释好的包被溶液于 PCR管中 25C中放置3h或4C冰箱中过夜,用PBST缓冲液洗涤3次5次,去除残留溶液 D.2.2抗原捕捉向每个已包被抗体的离心管中加人检测样品上清液25L.,25C下放置2h一3h或4C冰箱中放置过夜;加人PBST缓冲液洗涤3次5次,灭菌双蒸水洗涤2次,去除残留溶液如果是用于验证DAsEL.IsA的检测结果,可直接使用血清学检测样品的剩余提取液 D.2.3eDNA合成在已制备好的免疫捕获CR管中加人;特异性下游引物cPsMVR(e0pmolL)05l及无RN 酶ddH.o8.5AL.,在PCR仪上95C处理5min,迅速冷却后,再向PCR管中加人下列试剂:M-MIV RT(200U/aL)0.5l、5×RT缓冲液2.5nL,dNTP(10mmol/L)0.5nL,RNasin(40U/L)0.5AL 反应参数:42C60min,95C10min,加人剩余反转录(RT)反应液进行反转录,42C,60nmin 反转录总体积10L D.2.4Real-timePCR检测 D.2.4.1引物与探针引物和探针序列见表D.1 表D.1引物和探针序列及其在基因组中的位置序列引物名称 CPSMVF 5'-GGTcCAATcccGGCATTATTG3” CPSMVR 5’-GGCTTCTGCAGGTGTTCCAA-3’ CPSMVPro 5'(FAM)-TGTAGCACAATCAGGGCAAACACAGCA-TAMRA)3’ D.2.4.2反应体系实时荧光PCR反应体系见表D.2 1l1
GB/T31805一2015 表D.2实时荧光CR反应体系试剂名称加样量/AL 2×FastStartUniversalProbeMast(rox 10.0 cDNA 2.0 CPSMIVF(20Mmol/1 0,4 CP5MR0pmaL 0.4 CPSMVPro(20pm/L 0.l DEPC处理水补足反应总体积至20L D.2.4.3反应参数反应条件为:943min;9415s,60C60s,45个循环 D.3结果判定检测样品的Ct值大于或等于40时,则判定豇豆重花叶病毒阴性检测样品的Ct值小于或等于35时,则判定豇豆重花叶病毒阳性检测样品的Ct值小于40而大于35时,应重新进行测试,如果重新测试的ct值大于或等于40时则判定豇豆重花叶病毒阴性;如果重新测试的C值小于40,则判定豇豆重花叶病毒阳性 12
GB/T31805一2015 附录资料性附录生物学测定 E.1鉴别寄主竟色黎(Chepudiam.dmaraniadlwr),菜豆(PMalaeudleari)品种Pwao、豇豆(Vwua n guiculata)品种BlackeyeEarlyRamshorn E.2方法 E.2.1研磨样品按1:21:10质量:体积)加人0.01mol/几磷酸钠缓冲液(pH7.2)研磨,在研钵中研碎研碎后放人硅藻土(浓度为0.5%)并与病汁液混匀 E.2.2接种觉色藜接种苗龄:4片一6片真叶;菜豆(Phaseolusuulgaris)品种Pinto接种苗龄;子叶期或第片真叶出现;豇豆(Vgnaunguiculata)品种BlackeyeEarlyRamshorn接种苗龄;子叶期或第一片真叶出现先将要接种的植株叶片用牙签等穿孔作为接种叶片的标记.然后用手将样品汁液轻轻涂抹于鉴别寄主叶片上表面,用蒸憎水冲洗叶表面做好标签，置于隔离温室中(在自然光照下,温度控制在 20C30 0C),及时观察记载寄主反应 E.3鉴别寄主症状苑色藜;接种叶出现坏死斑症状,没有系统症状菜豆(品种Pinto);接种叶出现坏死斑症状,没有系统症状豇豆(品种BlackeyeEarlRamshorm);接种叶出现褪绿斑症状,并且通常有红色坏死斑,有的主要叶脉变成红色和坏死,系统症状为花叶,黄脉、畸形、坏死 13

豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法GB/T31805-2015

1.引言

豇豆是一种广泛栽培的蔬菜作物，因其营养丰富、口感好受到广大消费者的喜爱。然而，豇豆生长过程中容易受到各种病毒的侵害，其中包括重花叶病毒（Cowpea severe mosaic virus，CSMV）。

为了保障我国豇豆贸易安全，规范豇豆重花叶病毒的检疫工作，中国农业部于2015年颁布了《豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法》（GB/T31805-2015）标准，该标准规定了豇豆重花叶病毒的检疫鉴定方法。

2. GB/T31805-2015标准内容

GB/T31805-2015标准主要包括以下内容：

术语和定义：对与本标准有关的术语进行了定义。
检测原理：介绍了豇豆重花叶病毒的检测原理，包括标记抗体法、PCR法等。
试剂和材料：列举了进行豇豆重花叶病毒检测需要使用的试剂和材料。
设备：介绍了进行豇豆重花叶病毒检测需要使用的设备。
检测步骤：详细描述了进行豇豆重花叶病毒检测的具体步骤，包括样品处理、核酸提取、PCR扩增、PCR产物分析等。
结果分析：对检测结果进行分析和判定。

3. 实施步骤

按照GB/T31805-2015标准进行豇豆重花叶病毒检疫鉴定，具体步骤如下：

样品采集：在豇豆生长期内，采集有病征的叶片样品。
样品处理：将采集的样品进行气密封袋密封，避免交叉污染。
核酸提取：采用快速磨粉法或其他有效方法进行样品的核酸提取。
PCR扩增：使用引物对提取的核酸进行PCR扩增反应。
PCR产物分析：通过凝胶电泳等方法对PCR产物进行分析和检测。
结果分析：根据分析结果，判断样品是否存在豇豆重花叶病毒感染。

4. 结论

GB/T31805-2015标准规定了豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法，为豇豆生产和贸易提供了保障。按照GB/T31805-2015标准进行豇豆重花叶病毒的检疫鉴定，能够有效地防止病毒传播和扩散，保障我国豇豆出口质量和安全。

总之，豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法是保障我国蔬菜贸易安全的一项重要措施，实施该标准将对于维护豇豆市场秩序、促进农业生产健康发展具有重要意义。