饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测

饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测

国家标准 GB/T26428一2010 饲用微生物制剂中枯草芽饱杆菌的检测 MethodfordeterminationofBacillussubtilisinfeeds 2011-01-14发布 2011-07-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 首家标准化管难委员会国家标准
GB/T26428一2010 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口 本标准起草单位:广东省微生物分析检测中心 本标准主要起草人:朱红惠、孙晓棠、羊宋贞、陈远良、张鲜姣
GB/T26428一2010 饲用微生物制剂中枯草芽抱杆菌的检测 范围 本标准规定了饲用微生物制剂中枯草芽袍杆菌的检验方法 本标准适用于饲用微生物制剂中枯草芽袍杆菌的检测和计数 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T14699.1饲料采样(GB/T14699.1-2005,Iso6497:2002,IDT) GB/T20195动物饲料试样的制备(GB/T201952006,IS06498;1998,IDT) 稀释液培养基及试剂 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂,实验室用水采用蒸僧水或去离子水,或相当 纯度的水 3.10.85%灭菌生理盐水 3.2营养琼脂(NA)培养基;参见附录A中的A.1 3 3 革兰氏染色液;参见附录A中的A.2 7%氯化钠生长培养基;参见附录A中的A.3 3 4 3 V-P测定培养基和试剂:参见附录A中的A.4 3.6硝酸盐还原培养基和试剂:参见附录A中A.5 3.7D甘露醇发酵培养基;参见附录A中的A.6 3.8丙酸盐利用培养基;参见附录A中的A.7 设备和玻璃器皿 除常用微生物实验室设备外,其他设备和玻璃器m如下 恒温培养箱:37C士1C 4.2pH计;精度到士0.1个单位 4.3玻璃或塑料培养m 刻度吸管;标记容量为！ml和10ml,最小刻度分别为0.！mL和0.5ml 4 4. 4.5玻璃或塑料涂布棒 4. 6 显微镜;1000倍 采样 实验室样品真实、具有代表性 采样工具,如铲子、匙,采样器、试管、广口瓶、剪子等,应是灭菌的
GB/T26428一2010 样品送到微生物检验室应越快越好 采样数量和方式按照GB/T14699.1执行 试样的制备 按照GB/T20195进行试样的制备,样品制备后应尽快检验 操作步骤 检样制备初始悬液和十倍稀释 以无菌操作称取试样25g(ml),加人225ml.0.85%灭菌生理盐水,均质！ nmin2min,制成 1:10的初始悬浮液 吸取1:10的初始悬浮液1ml,加人9ml.0.85%灭菌生理盐水,经充分混匀后 制成1:100的稀释液 根据样品含菌量,做进一步的十倍系列递增稀释 7.2接种和培养 选择2个一了个适宜的稀释度,水浴80笔士1亿推持10mn,用无菌移液管分别吸取0.lmL,接 种到两个营养琼脂平板(3.2)上 使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面,涂布棒不得接 触平皿边缘 每个平皿用一支无菌涂布棒 涂布好的平皿盖好,置室温中放置15min使接种物完全被 琼脂吸收 翻转上述平皿置37C士1C培养箱中培养48h士2 7.3菌落计数及筛选 培养后,选取菌落数在30个300个之间的平板计数 若平板中有较大片状菌落生长时,则不宜 采用;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2以代 表全皿菌落数 典型枯草芽袍杆菌菌落表面粗糙,不透明,不闪光,边缘扩张,圆形或蔓延成波浪形、不 规则形,灰白色或微黄色 然后从中选出5个特征菌落进行确证试验 7.4确证试验 7.4.1概述 目前商业上的生化鉴定试剂盒或生化鉴定管,如果采用的培养基与本标准确证试验所用的培养基 -致,可以按照商品说明书使用这些试剂盒或生化鉴定管进行该项确证试验 7.4.2菌种制备 自平板上挑取单菌落,划线转接培养于营养琼脂平板上,37C士1C培养48h士2h 从每一平板 中选取至少1个良好分离的特征菌落,转接保存,进行确证试验 7.4.3形态观察 将挑选纯化的菌落做革兰氏染色(3.3)镜检 枯草芽抱杆菌细胞应为杆状,有芽抱,芽抱椭圆形,中 生或近中生,芽抱囊不明显膨大 7.4.4生理生化确证试验 将挑选纯化的菌落进行7%氧化钠生长(3.4)、,V-P测定(3.5),硝酸盐还原(3.6),D甘露醇发酵 3.7)和丙酸盐利用(3.8)试验
GB/T26428一2010 7.4.5确证结果 枯草芽抱杆菌菌落表面粗糙,不透明,灰白色或微黄色,细胞杆状,有芽抱,芽抱椭圆形中生或近中 生,芽抱囊不明显膨大,在7%氧化钠中生长,V-P测定阳性,硝酸盐还原阳性,能从D甘露醉产酸,不利 用丙酸盐者可判为枯草芽袍杆菌 枯草芽抱杆菌与类似芽袍杆菌的鉴别特征见表1 表1枯草芽抱杆菌与其他类似芽抱杆菌的鉴别特征 地衣芽袍 蜡样芽弛 凝结芽袍 坚强芽袍迟缓芽弛 枯草芽抱 巨大芽袍 短小芽袍 杆菌 杆菌 杆菌 项目 杆菌 杆菌 杆菌 杆菌 杆菌 B..subilisB.lichenijormisB.cereusB.cougulansB.irmus|B.lenusB.megaleriumB.pumiles 厌氧生长 V-P 硝酸盐还原 淀粉水解 明胶液化 ND ND 丙酸盐 利 用 柠檬酸盐 D木糖 X 产 -阿拉伯糖 d 酸 D甘露醇 7%氧化钠生长 pH5.了生长 注，十;阳性;一;阴性xd,部分菌株为阳性;ND未测定 结果计算与报告 计算每块板上枯草芽抱杆菌菌落数 计数每块平板上的枯草芽抱杆菌菌落数a,使用式(1)计算 xc " 式中 -计数每块平板上的枯草芽抱杆菌菌落数 挑取后经证实为枯草芽抱杆菌的菌落数; -挑取平板上用于验证的菌落数; 平板上的所有特征菌落数 最终结果按照GB/T8170数值修约规则修约至整数 示例 若某板上长有78个典型菌落,从中选出做确证实验的5个菌中有4个证实为枯草芽抱杆菌,则: 号x78一62. 按照GB/T8170数值修约规则得a为62.
GB/T26428一2010 2 8. 样品中枯草芽抱杆菌数的计算方法与报告 选择两个连续稀释度平板(每个稀释度至少有一块平板,其上经确证后的枯草芽袍杆菌菌数介于 30300之间),通过式(2)计算,即为1ml.或1g样品中的枯草芽袍杆菌数N N= 十0.ln)d 式中: N -样品中枯草芽弛杆菌菌数; >a -所有平板经确证后的枯草芽抱杆菌菌数的总和; -平板的接种体积,单位为毫升(mL); 第一个稀释度的平板数; n 第二个稀释度的平板数; na 第 一个稀释度的稀释因子(未经稀释的液体样品的d值为). d 按照GB/T8170数值修约规则将计算出的结果保留至两位有效数字,也可将样品的枯草芽袍杆菌 菌落数记录为1.0一9.9乘以10的指数幕表示 报告每毫升或每克样品的枯草芽抱杆菌估计数,单位为cFU/g(mL.) 示例1 若第一个稀释度(10)经确证后的菌落数为168和215,第二个稀释度(I0-')经确证后的菌落数为34和55,则 472 168土215土34土55 N=， ;，=2145450 .I文羊w.I文文I=.w 按照GB/T8170数值修约规则得出每克或每毫升样品中含枯草芽他杆菌估计数为2100000cCFU/g(ml.)或2.1× 10CFU/g(ml 示例2 若只有最后一稀释液(10-')经证实含枯草芽抱杆菌菌落数分别为120和130,则 250 =12500000 N= 去- .0000 按照GB/T8170数值修约规则修约.报告每克或每毫升样品中含枯草芽袍杆菌估计数为12000000CFU/g(mL 或1.2X10cFU/g(mL.
GB/T26428一2010 附 录A 资料性附录 培养基和试剂 营养琼脂(NA)培养基 A.1.1成分 蛋白陈 l0g 牛肉膏 3g 氧化钠 5 g 16 琼脂 g 燕僧水 1000mL A.1.2制法 溶解各成分于水中,必要时加热 调整pH值,使培养基pH值在25C时为7.3士0.2. 121C灭 菌30 min A.2革兰氏染色 A.2.1结晶紫染色液 A.2.1.1成分 结晶紫 1g 95%乙醇 20mL 80ml 1%草酸铵水溶液 A.2.1.2制法 将结晶紫溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合 A.2.2革兰氏碘液 A.2.2.1成分 碘 1g 碘化钾 2g 300m 蒸圜水 A.2.2.2制法 将碘与碘化钾先进行混合,加人蒸僧水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加燕水至300mL
GB/T26428一2010 A.2.3沙黄复染液 A.2.3.1成分 0.25 沙黄 g 10ml 95%乙醇 90ml 蒸僧水 A.2.3.2制法 将沙黄溶解于乙醇中,然后用燕水稀释 A.2.4染色法 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染色1min,水洗;滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗;滴 加95%乙醇脱色，约30s,水洗;滴加沙黄复染液,复染1min,水洗待干,镜检 A.37%氯化钠生长 A.3.1成分 蛋白陈 10g 牛肉膏 3g 氯化钠 70g 蒸僧水 1000ml A.3.2制法 溶解各成分于水中,必要时加热 调整pH值,使培养基pH值在25C时为7.4士0.2 分装试管 121C灭菌30min. A.3.3试验方法 取新鲜培养物接种于上述培养基中,36`C士1C培养2d7d,与未接种的对照管对比,目测生长 情况 A.4v-P测定 A.4.1培养基 A.4.1.1成分 蛋白眸 5g 葡萄糖 5g 5 氯化钠 1000mL 蒸僧水 A.4.1.2制法 溶解各成分于水中,必要时加热 调整pH值,使培养基pH值在25C时为7.0士0.2 分装试管
GB/T26428一2010 121C灭菌30 min A.4.2试剂 肌酸 0.3%或原粉 氢氧化钠 40% A.4.3试验方法 加少许 接种菌于上述培养基中,36C土1亿培养2d一4d 取培养液和40%氢氧化销等量相混 肌酸,10min” 如培养液出现红色,即为阳性反应,有时需放置更长时间才出现红色反应 A.5硝酸盐还原 A.5.1培养基 A.5.1.1成分 蛋白陈 20g 牛肉膏 3g 5g 氯化钠 硝酸钾 1g 蒸僧水 1000mL A.5.1.2制法 溶解各成分于水中,必要时加热 调整pH值,使培养基pH值在25C时为7.4士0.2 分装试管， 121C灭菌30min A.5.2试剂 甲液 对氨基笨碱酸 0.5g 10%乙酸溶液 150ml 甲綦胺 乙液 0.1 g 蒸懈水 20ml 10%乙酸溶液 150mL 二苯胺试剂 二苯胺 0.5g 蒸懈水 20mL 浓硫酸 100ml A.5.3试验方法 接种菌于上述培养基中,36C士1C培养2d~4d 加人甲液和乙液各1滴,观察结果 如溶液变 为红色、橙色、棕色为硝酸盐还原阳性 如无红色出现,可加1滴一2滴二苯胺试剂,如不呈蓝色,也为 硝酸盐还原阳性,呈蓝色则为阴性
GB/T26428一2010 A.6甘露醇发酵 6.1培养基 A， A.6.1.1成分 磷酸氢二铵 g D 氧化钾 o 硫酸镁 .2g 0. 酵母膏 0.2g D甘露醇 0.0g 15ml 0.04%溴甲酚紫 5 琼脂 g 1000ml. 蒸僧水 A.6.1.2制法 除指示剂溴甲酚紫外,其余各成分溶解于水,必要时加热 调整pH值,使灭菌后培养基pH值在 25C时为7.0士0.2 加人指示剂澳甲酚紫,分装试管,l15C灭菌30min A.6.2试验方法 挑取小量培养物接种于上述培养基中,36C士1C培养2d~5d 观察指示剂变黄,表示产酸,为 阳性;不变或变蓝(紫)则为阴性 A.7丙酸盐利用 A.7.1培养基 A.7.1.1成分 硫酸镁7H,( 0.2g 磷酸氢二氨 lg 磷酸氢二钾3H.O lg 氯化纳 5g 丙酸钠 2g 1%澳百里酚蓝水溶液 10ml 20g 琼脂 1000mL 蒸馏水 A.7.1.2制法 以上成分除指示剂外加热溶解,调整pH值,使培养基pH值在25C时为7.0士0.2 加人指示剂 澳百里酌蓝,分装试管,121C高压灭菌30mm,摆成斜面备用 同时设不加丙酸盐的空白对照
GB/T26428一2010 A.7.2试验方法 取新鲜培养物接种于上述培养基中,36C士1C培养48h,观察结果 培养基由绿色变为蓝色为 阳性,培养基不变色为阴性

饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测GB/T26428-2010详解

GB/T26428-2010是我国国家标准中对饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测方法规定。该标准主要针对饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测方法和技术要求进行了详细规定，旨在保证饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的含量达到相关标准。

首先，该标准明确了枯草芽孢杆菌的检测对象和样品处理方法。其次，对于不同类型的饲用微生物制剂样品，该标准也规定了相应的检测方法和技术要求。例如，在进行枯草芽孢杆菌含量检测时，需要选择适当的培养基、试剂和试验条件，并对试验结果进行评估和判定。

此外，该标准还规定了枯草芽孢杆菌检测中需要注意的问题。例如，在进行PCR检测时，应注意引物和探针的设计和选择；在进行传统的培养方法检测时，应注意样品的储存和保存方式等。

总之，GB/T26428-2010为饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测提供了标准化的指导，有效地保证了饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的含量和质量达到相关标准。但是，为了确保检测准确性和可靠性，操作人员必须具备一定的专业知识和技能，严格按照标准要求进行检测。

饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测的相关资料

和饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测类似的标准

GB/T26428-2010

饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测

2022/11/6 16:42:17 现行