生活饮用水标准检验方法微生物指标

生活饮用水标准检验方法微生物指标

国家标准 GB/T5750.12一2006 部分代替GB:5750-985 生活饮用水标准检验方法 微生物指标 Standardexaminationethodlsfordrinkingwater Microbiologicalparameters 2006-12-29发布 2007-07-01实施 卫生部 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T5750.12?2006 ? ? 3 ???? 14 ???? 16 ???? ??? 19 ? 30
GB/T5750.12一2006 前 言 GB/T5750《生活饮用水标准检验方法》分为以下部分 总则; -水样的采集和保存; 水质分析质量控制 -感官性状和物理指标; -无机非金属指标; 金属指标; 有机物综合指标 有机物指标; 农药指标 消毒副产物指标 消毒剂指标 微生物指标; 放射性指标 本标准代替GB/T57501985《生活饮用水标准检验法》第二篇中的细菌总数、总大肠菌群 本标准与GB/T5750-1985相比主要变化如下 依据GB/T1.1-2000(标准化工作导则第1部分;标准的结构和编写规则》调整了结构 增加了生活饮用水中耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌、贾第鞭毛虫、隐袍子虫4项指标的7个检 验方法 本标准由卫生部提出并归口 本标准负责起草单位;疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所 本标准参加起草单位;中山大学、黑龙江省疾病预防控制中心、,河北省疾病预防控制中心、北京市疾 病预防控制中心,深圳市疾病预防控制中心,澳门自来水公司、广州市自来水公司 本标准主要起草人;金银龙、陈西平,周淑玉、孙宗科、宋宏 本标准参加起草人;遇晓杰、张淑红、张雅婕、丁培、薛金荣,余淑苑、范晓军、章诗芳 本标准于1985年8月首次发布,本次为第一次修订

GB/T5750.12一2006 生活饮用水标准检验方法 微生物指标 菌落总数 1.1平皿计数法 1.1.1范围 本标准规定了用平皿计数法测定生活饮用水及其水源水中的菌落总数 本法适用于生活饮用水及其水源水中菌落总数的测定 1.1.2术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 1.1.2.1 菌落总数standardplatecountbacteria 水样在营养琼脂上有氧条件下37C培养48h后,所得1mL水样所含菌落的总数 1.1.3培养基与试剂 1.1.3.1营养琼脂 1.1.3.1.1成分 蛋白陈 10g 牛肉膏 3g 氯化钠 5g 琼脂 10g20g 燕水 1000ml 制法;将上述成分混合后,加热溶解,调整pH为7.4一7.6,分装于玻璃容器中(如用含杂 1.1.3.1.2 质较多的琼脂时,应先过滤),经103.43kPa(121C，15Ib)灭菌20min,储存于冷暗处备用 仪器 高压蒸汽灭菌器 干热灭菌箱 培养箱36C士1c 电炉 天平 冰箱 放大镜或前落计数器 pH计或精密pH试纸 灭菌试管、平皿(直径9cm)刻度吸管、采样瓶等 检验步骤 1.5 生活饮用水 以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1ml.充分混匀的水样,注人灭菌平皿中,倾注约15ml 已融化并冷却到45C左右的营养琼脂培养基,并立即旋摇平皿l,使水样与培养基充分混匀 每次检验 时应做一平行接种,同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照 1.1.5.1.2待冷却凝固后,翻转平皿,使底面向上,置于36C士1C培养箱内培养48h,进行菌落计数，
GB/T5750.12一2006 即为水样1ml中的菌落总数 1.1.5.2水源水 1.1.5.2.1以无菌操作方法吸取1m充分混匀的水样,注人盛有9mL灭菌生理盐水的试管中,混匀 成1:10稀释液 1.1.5.2.2吸取1:10的稀释液1ml注人盛有9mL灭菌生理盐水的试管中,混匀成1:100稀释 液 按同法依次稀释成1:1000.1:10000稀释液等备用 如此递增稀释一次,必须更换一支1ml 灭菌吸管 1.1.5.2.3用灭菌吸管取未稀释的水样和2个3个适宜稀释度的水样1ml,分别注人灭菌平皿内 以下操作同生活饮用水的检验步骤 1.1.6菌落计数及报告方法 作平皿菌落计数时,可用眼睛直接观察,必要时用放大镜检查,以防遗漏 在记下各平皿的菌落数 后,应求出同稀释度的平均菌落数,供下一步计算时应用 在求同稀释度的平均数时,若其中一个平m 有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数 若片 状菌落不到平皿的一半,而其余一半中菌落数分布又很均匀,则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落 数 然后再求该稀释度的平均菌落数 不同稀释度的选择及报告方法 首先选择平均菌落数在30300之间者进行计算,若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范 围时,则将该菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中实例1) 若有两个稀释度,其生长的菌落数均在30~300之间,则视二者之比值来决定,若其比值小于 2应报告两者的平均数(如表1中实例2) 若大于2则报告其中稀释度较小的菌落总数(如表1中实例 3) 若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数(见表1中实例4) 1.1.7.3若所有稀释度的平均菌落数均大于300,则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告 之(见表1中实例5) 1.1.7.4若所有稀释度的平均菌落数均小于30,则应以按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报 告之(见表1中实例6) 1.1.7.5若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间,则应以最接近30或300的平均菌落数乘 以稀释倍数报告之(见表1中实例7) 若所有稀释度的平板上均无菌落生长,则以未检出报告之 如果所有平板上都菌落密布,不要用“多不可计”报告,而应在稀释度最大的平板上,任意数其 中2个平板1cm中的菌落数,除2求出每平方厘米内平均菌落数,乘以皿底面积63.6cm,再乘其稀 释倍数作报告 1.1.7.8菌落计数的报告;菌落数在100以内时按实有数报告,大于100时,采用两位有效数字,在两 位有效数字后面的数值,以四舍五人方法计算,为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示(见表 1“报告方式”栏) 表1稀释度选择及菌落总数报告方式 不同稀释度的平均菌落数 两个稀释度菌落总数 实 例 报告方式/(CFU/mL) 菌落数之比 (CFU/mL) 10" 10 10 1365 164 20 16400 16000或1.6×10" 46 1.6 2760 295 37750 38000或3.8×10" 2890 271 2.2" 2710o 27000或2.7×10' 60 150 30 1500 1500或1.5×10
GB/T5750.12一2006 表1(续 不同稀释度的平均菌落数 两个稀释度 菌落总数 实 例 报告方式/(CFU/ml) 菌落数之比 (CFU/ml) 10" 10" 10 1650 513 513000 多不可计 或5.I 510000 1×10 27 270 270或2.7×10" ll1 12 多不可计 305 30500 31000或3.1×10" 总大肠菌群 2.1多管发酵法 2.1.1范围 本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群 本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定 2.1.2术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 2.1.2.1 总大肠菌群totalcoliforms 总大肠菌群指一群在37C培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽袍 杆菌 2.1.3培养基与试剂 2.1.3.1乳糖蛋白陈培养液 2 .1.3.1.1成分 蛋白陈 10g A 牛肉膏 3g C 乳糖 5g D 氧化钠 5g E 1mL 澳甲酚紫乙醇溶液(16g/L) F 1000ml 蒸憎水 2.1.3.1.2制法 将蛋白陈,牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于燕僧水中,调整pH为7.2一7.4,再加人1ml16g/L的澳甲 酚紫乙醇溶液,充分混匀,分装于装有倒管的试管中,68.95kPa(115C,10Ib)高压灭菌20min.贮存于 冷暗处备用 2.1.3.2二倍浓缩乳糖蛋白膝培养液 按上述乳糖蛋白陈培养液(2.1.3.1),除燕水外,其他成分量加倍 2.1.3.3伊红美蓝培养基 2.1.3.3.1成分 蛋白陈 A l0g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 C 2g D 一30g 琼脂 20 g 1000mL 蒸圜水 20ml 伊红水溶液(20g/L)
GB/T5750.12一2006 G 美蓝水溶液(5g/L 13ml 2.1.3.3.2制法 将蛋白陈,磷酸盐和琼脂溶解于燕僧水中,校正pH为7.2,加人乳糖,混匀后分装,以68.95kPa 115C,10Ib)高压灭菌20min 临用时加热融化琼脂,冷至50C一55C,加人伊红和美蓝溶液,混匀. 倾注平皿 2.1.3.4革兰氏染色液 2 .1.3.4.1结晶紫染色液 成分 A 结晶紫 lg 乙醇(95%,体积分数) 20mL 草腹锁水溶液(0g/L) 80ml 制法;将结晶紫溶于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合 B 注;结晶紫不可用龙胆紫代替,前者是纯品,后者不是单一成分,易出现假阳性 结晶紫溶液放置过久会产生沉淀， 不能再用 2.1.3.4.2革兰氏碘液 成分 碘 1g 碘化钾 2g 蒸僧水 300ml 制法;将碘和碘化钾先进行混合,加人蒸僧水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加燕僧水 B 2.1.3.4.3脱色剂 乙醇(95%,体积分数) 2.1.3.4.4沙黄复染液 成分 A 沙黄 0.25g 乙醇(95%,体积分数 10ml 蒸细水 90mL B 制法;将沙黄溶解于乙醉醇中,待完全溶解后加人蒸溜水 2.1.3.4. 染色法 将培养18h一24h的培养物涂片 A 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1min,水洗 滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗 滴加脱色剂,摇动玻片,直至无紫色脱落为止,约30s,水洗 滴加复染剂,复染1min,水洗,待干,镜检 2.1.4仪器 2 1.4.1培养箱;36C士1c 2.1.4.2冰箱;0C一4C 2.1.4.3天平 2.1.4.4显微镜 2.1.4.5平皿,直径为9cem. 2.1.4.6试管 2.1.4.7分度吸管:1mL101 ml
GB/T5750.12一2006 2.1.4.8锥形瓶 2.1.4.9小倒管 2.1.4.10载玻片 2.1.5检验步骤 2.1.5.1乳糖发酵试验 2.1.5.1.1取10mL.水样接种到10mL双料乳糖蛋白陈培养液中,取1mlL水样接种到10mL单料 乳糖蛋白腺培养液中,另取1mL水样注人到9mL灭菌生理盐水中,混匀后吸取1mL(即0.1mL 水 样注人到10ml单料乳糖蛋白陈培养液中,每一稀释度接种5管 对已处理过的出厂自来水,需经常检验或每天检验一次的,可直接种5份10ml.水样双料培养基 每份接种10mL水样 2.1.5.1.2检验水源水时,如污染较严重,应加大稀释度,可接种1，0.1,0.01mL甚至0.1，0.01 0.001mL,每个稀释度接种5管,每个水样共接种15管 接种1ml以下水样时,必须作10倍递增稀 释后,取1mL接种,每递增稀释一次,换用1支1ml灭菌刻度吸管 2.1.5.1.3将接种管置36C士1C培养箱内,培养24h士2h,如所有乳糖蛋白陈培养管都不产气产 酸,则可报告为总大肠菌群阴性,如有产酸产气者,则按下列步骤进行 分离培养 2.1.5.2 将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,于36C士1C培养箱内培养18h~24h,观察 菌落形态,挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验 深紫黑色,具有金属光泽的菌落 紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落 淡紫红色、中心较深的菌落 2.1.5.3证实试验 经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽袍杆菌,同时接种乳糖蛋白陈培养液,置36C士1C培养箱中培 养24h士2h,有产酸产气者,即证实有总大肠菌群存在 2.1.6结果报告 根据证实为总大肠菌群阳性的管数,查MPN(mostprobablenumber,最可能数)检索表,报告每 100mL水样中的总大肠菌群最可能数(MPN)值 5管法结果见表2,15管法结果见表3 稀释样品查 表后所得结果应乘稀释倍数 如所有乳糖发酵管均阴性时,可报告总大肠菌群未检出 表2用5份10m水样时各种阳性和阴性结果组合时的最可能数(MMPN) 最可能数(MPN 5个10mL管中阳性管数 2.2 2.2 9 2 16.0 >16
GB/T5750.12一2006 表3总大肠菌群MPN检索表 总接种量55.5mL,其中5份10mL水样,5份1mL水样,5份0.1mL水样 接种量/ml. 接种量/ml 总大肠菌群 总大肠菌群， MPN/100ml MPN/100ml 10 10 0.1 0.l C 3 0 10 12 10 12 11 14 10 o 12 1m 15 13 17 10 0 17 3 15 19 l11 13 15 o 11 o 13 17 5 19 出 5 n 1: 0 15 17 0 2 19 24
GB/T5750.12一2006 表3(续 接种量/ml 接种量/ml 总大肠菌群" 总大肠菌群 MPN/100ml MPN/100ml 10 10 0.1 0.l 1l 13 12 16 20 14 2: l 1 2 14 12 0 In 2 I7 23 27 I l14 2 12 17 14 20 2 2 n7 21 致 19 31 2 14 21 I7 烈 2 然 2 0 s2 2 5 36 15 21 17 24 28 2 0 2 3 32 5 86 17 25 2 20 29 23 32 26 37 29 41 45 32
GB/T5750.12一2006 表3(续 接种量/ml 接种量/ml 总大肠菌群" 总大肠菌群 MPN/100ml MPN/100ml 10 0.1 10 0.l 13 23 31 43 21 "5 58 心 30 5 36 33 21 公 R8 sn 38 110 42 130 2 49 26 70 94 2 38 120 4 150 50 180 27 9 In 3 10 9 65 18o s 210 250 59 34 130 170 40 220 280 54 G2 350 9 430 41 240 48 350 56 540 920 64 72 1600 81 1600
GB/T5750.12一2006 2.2滤膜法 2.2.1范围 本标准规定了用滤膜法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群 本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定 2.2.2术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 2.2.2.1 fortotalcoliforms 总大肠菌群滤膜法 membranefiltertechnique 总大肠菌群滤膜法是指用孔径为0.454m的微孔滤膜过滤水样,将滤膜贴在添加乳糖的选择性培 养基上37C培养24h,能形成特征性菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌以检测水中总大 肠菌群的方法 2.2.3培养基与试剂 2.2.3.1品红亚硫酸钠培养基 2.2.3.1.1成分 蛋白陈 10 g 酵母浸膏 5g 牛肉膏 5g 乳糖 10g 琼脂 l5g20g 磷酸氢二钾 3.5 g 无水亚硫酸钠 5g H 碱性品红乙脾游液(60g/L 20ml 蒸馏水 1000ml 2.2.3.1.2储备培养基的制备 先将琼脂加到500ml蒸水中,煮沸溶解,于另500mL燕馏水中加人磷酸氢二钾,蛋白陈、酵母 浸膏和牛肉膏,加热溶解,倒人已溶解的琼脂,补足蒸侩水至1000mL,混匀后调pH为7.27.4,再加 人乳糖,分装,68.95kPa(115C,10lb)高压灭菌20min,储存于冷暗处备用 本培养基也可不加琼脂,制成液体培养基,使用时加2mL3mL于灭菌吸收垫上,再将滤膜置于 培养垫上培养 2.2.3.1.3平皿培养基的配制 将上法制备的储备培养基加热融化,用灭菌吸管按比例吸取一定量的50g/I的碱性品红乙醇溶液 置于灭菌空试管中,再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一灭菌试管中,加灭菌水少许,使其溶解 后,置沸水浴中煮沸10min以灭菌 用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液,滴加于碱性品红乙醉溶液至深红色退成淡粉色为止,将此 亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储备培养基内,并充分混匀(防止产生气泡),立即将此 种培养基15mL倾人已灭菌的空平皿内 待冷却凝固后置冰箱内备用 此种已制成的培养基于冰箱 内保存不宜超过两周 如培养基已由谈粉色变成深红色,则不能再用 2.2.3.2乳糖蛋白陈培养液 同2.1.3.1 2.2.4仪器 2.2.4.1滤器 2.2.4.2滤膜,孔径0.45m 2.2.4.3抽滤设备
GB/T5750.12一2006 2.2.4.4无齿锻子 2.2.4.5其他仪器同多管发酵法2.1.4 2.2.5检验步骤 2.2.5.1准备工作 2.2.5.1.1滤膜灭菌;将滤膜放人烧杯中,加人蒸憎水,置于沸水浴中煮沸灭菌3次,每次15min 前 两次煮沸后需更换水洗涤2次一3次,以除去残留溶剂 2.2.5.1.2滤器灭菌;用点燃的酒精棉球火焰灭菌 也可用蒸汽灭菌器103.43kPa121C,15Ib)高 压灭菌20min 2.2.5.2过滤水样 用无菌锻子夹取灭菌滤膜边缘部分,将粗糙面向上,贴放在已灭菌的滤床上,固定好滤器,将 00mL水样(如水样含菌数较多,可减少过滤水样量,或将水样稀释)注人滤器中,打开滤器阀门,在 -5.07×10'Pa(负0.5大气压)下抽滤 2.2.5.3培养 水样滤完后,再抽气约5s,关上滤器阀门,取下滤器,用灭菌锻子夹取滤膜边缘部分,移放在品红亚 硫酸钠培养基上,滤膜截留细菌面向上,滤膜应与培养基完全贴紧,两者间不得留有气泡.然后将平皿倒 置,放人37C恒温箱内培养24h士2h 2.2.6结果观察与报告 2.2.6.1挑取符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检， 紫红色、具有金属光泽的菌落; 深红色、不带或略带金属光泽的菌落; 淡红色、中心色较深的菌落 2.2.6.1.1凡革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,再接种乳糖蛋白陈培养液,于37C培养24h,有产酸产 气者,则判定为总大肠菌群阳性 2.2.6.1.2按式(1)计算滤膜上生长的总大肠菌群数,以每100ml水样中的总大肠菌群数(CFU/100mL) 报告之 数出的总大肠菌群菌落数x10o 总大肠菌群菌落数(CFU/100mL 过滤的水释体积mL 2.3酶底物法 2.3.1范围 本标准规定了用酶底物法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群 本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的检测 本法可在2!h判断水样中是否含有总大肠菌群及含有的总大肠菌群的最可能数(MPN). 本法可同时检测大肠埃希氏菌,见大肠埃希氏菌检测(4.3) 2.3.2术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 2.3.2. coliforms 总大肠菌群酶底物法enzyme Substratetech thniquefor t0tall 总大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生半乳糖苷酶(Dgalactosidase)的细菌群组,该 细菌群组能分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化,以此技术来检测水中总大肠菌群的方法 2.3.3培养基与试剂 2.3.3.1培养基 在本标准中酶底物法采用固定底物技术(DefinedSubst strate Teehnology,DST),本方法采用Mini malMediumONPGMUGMMOMUG)培养基,可选用市售商品化制品 每1000mLMMOMUG l0
GB/T5750.12一2006 培养基所含基本成分为: A 硫酸铵[(NHSO] 5.0g 硫酸MnSO 0.5mg 硫酸锌(ZnsO 0.5mg 硫酸镁MgSO 100mg 氧化钠(NaCI 10 g 氯化钙(CaCl) 50g 亚硫酸钠(NasO. 40mg G H 两性霉素BAmphoterieinB) 】mg" 500mg 邻硝基苯;BD毗喃半乳糖昔(ONPG) -甲基伞形啊-9-D葡萄糖醛酸苷(MUG) 75mg K 茄属植物萃取物(Solanium萃取物 500mg N-2-羚乙基哌嗓-N-2-乙磺酸钠盐(HEPES钠盐) 5.3g" M N-2-羚乙基噪嗓-N-2-乙磺酸(HEPES 6.9g 2.3.3.2生理盐水 8.5g/L的生理盐水,用于稀释样品 成分;氯化钠 8.5g 蒸馏水加至 1000mL 溶解后,分装到稀释瓶内,每瓶90mL,l03.43kPa(121C,15Ib)20min高压灭菌 2.3.4仪器设备 2.3.4.1量筒:l00ml,500ml、l000ml 2.3.42吸管;1mL、5mL及10mL的无菌玻璃吸管或塑料一次性吸管 2.34.3稀释瓶;100ml,250ml.500ml及1000ml能耐高压的灭菌玻璃瓶 2.3.44试管;可高压灭菌的玻璃或塑料试管,大小约15mmX10cm. 2.3.4.5培养箱.38C士1C 23.4.商压燕汽灭菌器 2.3.4.7干热灭菌器(烤箱》 2.3.4.8定量盘;定量培养用无菌塑料盘,含51个孔穴,每一孔穴可容纳2mL水样 .4.9程控定量封口机,用于51孔或97孔法(MPN法,最可能数法)定量盘的封口 2.3. 2.3.5检验步骤 2.3.5.1水样稀释 检测所需水样为100ml 若水样污染严重,可对水样进行稀释 取10ml.水样加人到90mL灭 菌生理盐水中,必要时可加大稀释度 2.3.5.2定性反应 用100ml的无菌稀释瓶量取100ml水样,加人2.7g士0.5gMMOMUG培养基粉末,混摇均 匀使之完全溶解后,放人36C士1C的培养箱内培养24h 2.3.5.310管法 2.3.5.3.1用100mL的无菌稀释瓶量取100mL水样,加人2.7g士0.5gMMO-MUG培养基粉末. 混摇均匀使之完全溶解 2.3.5.3.2准备10支15mm×10cm或适当大小的灭菌试管,用无菌吸管分别从前述稀释瓶中吸取 10ml水样至各试管中,放人36C士1C的培养箱中培养24h 2.3.5.451孔定量盘法 2.3.5.4.1用100mL的无菌稀释瓶量取100mL水样,加人2.7g士0.5gMMO-MUG培养基粉末 ll
GB/T5750.12一2006 混摇均匀使之完全溶解 2.3.5.4.2将前述100mL.水样全部倒人51孔无菌定量盘内,以手抚平定量盘背面以赶除孔穴内气 泡,然后用程控定量封口机封口 放人36C士1C的培养箱中培养24h. 2.3.6结果报告 2.3.6.1结果判读 将水样培养24h后进行结果判读,如果结果为可疑阳性,可延长培养时间到28h进行结果判读， 超过28h之后出现的颜色反应不作为阳性结果 2.3.6.2定性反应 水样经24h培养之后如果颜色变成黄色,判断为阳性反应,表示水中含有总大肠菌群 水样颜色 未发生变化,判断为阴性反应 定性反应结果以总大肠菌群检出或未检出报告 2.3.6.310管法 将培养24h之后的试管取出观察,如果试管内水样变成黄色则表示该试管含有总大肠 2.3.6.3.1 菌群 计算有黄色反应的试管数,对照表4查出其代表的总大肠菌群最可能数(MPN) 结果以 2.3.6.3.2 MPN/100mL表示 如听有管未产生黄色,则可报告为总大肠菌群未检出 表410管法不同阳性结果的最可能数(MPN)及95%可信范围 95%可信范围 总大肠菌群 阳性试管数 MPN/100ml.》y 限 限 3.0 1.1 0.03 2.2 0.26 8. 3.6 0,69 10.6 13.4 5.1 1.3 6.9 2.1 16.8 9.2 3.l 21.l 12.0 4.3 27.1 l6.1 5.9 36.8 59.5 23.0 8.l 10 >23.0 13,5 2.3.6.451孔定量盘法 2.3.6.4.1将培养24h之后的定量盘取出观察,如果孔穴内的水样变成黄色则表示该孔穴中含有总 大肠菌群 2.3.6.4.2计算有黄色反应的孔穴数,对照表5查出其代表的总大肠菌群最可能数(MPN) 结果以 MPN/100mL表示 如所有孔未产生黄色,则可报告为总大肠菌群未检出 12
GB/T5750.12一2006 表551孔定量盘法不同阳性结果的最可能数(MPN)及95%可信范围 95%可信范围 总大肠菌群" 性 数 阳 MPN/100mL 限 限 0.0 1.o 3 0. 2.0 0,6 7.3 3,1 9.0 4.2 1.7 10.7 5.3 2.3 12.3 6.4 3.0 3.9 5.5 8.7 17.1 4.5 9.9 5.3 18.8 1G 11.1 6.1 20.5 12.4 7.0 22.1 ll 12 13.7 7.9 23.9 13 15,0 8.8 25.7 27.5 14 16,4 9,8 15 17.8 0.8 29.4 16 19,2 11.9 31.3 n 20,7 13.0 33.3 18 22.2 14.1 35.2 19 23.8 15.3 37.3 39." 20 25,4 16.5 21 27.1 17." 41.6 2" 28.8 19.0 43.9 23 30.6 20,4 46.3 24 32.4 21.8 48.7 225 51.2 34.4 23.3 26 36.4 24.7 53.9 21 38,4 26.4 56.6 28 40.6 28.0 59.5 42.9 29.7 62. 5 29 30 45.3 31.5 65.6 31 47.8 33.4 69.o 32 50.4 35.4 72.5 33 53.1 37.5 76.2 13
GB/T5750.12一2006 表5(续 5%可信范围 总大肠菌群 阳性数 限 MPN/100ml 限 56.0 39,7 34 80.l 35 59.1 42.0 84.4 36 62.4 44.6 88.8 37 65.9 47.2 93. 38 69,7 50.0 99.0 39 73.8 53.l 104.8 40 78.2 56.4 ll1.2 83.1 59,9 41 118.3 42 88.5 63.9 126.2 43 94.5 68.2 135.4 44 101.3 73.1 146.0 45 109.1 78,6 158.7" 46 118.4 85.0 174.5 47 129.8 195.0 92.7 48 144.5 102.3 224.1 49 165.2 115.2 272.2 50 200.5 135.8 387.6 51 >200.5 146.1 耐热大肠菌群 3.1多管发酵法 3.1.1范围 本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的耐热大肠菌群 本法适用于生活饮用水及其水源水中耐热大肠菌群的测定 3.1.2术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1.2.1 therotolerantcoliformacteria 耐热大肠菌群 用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开,在44.5C仍能生长 的大肠菌群,称为耐热大肠菌群 3.1.3培养基与试剂 3.1.3.1EC培养基 3.1.3.1.1成分 胰蛋白陈 A 20g 乳糖 5g 3 号胆盐或混合胆盐 1.5g D 磷酸氢二钾 4g 14
GB/T5750.12一2006 磷酸二氢钾 1.5g 氯化钠 5g G 1000 蒸馏水 ml 3.1.3.1.2制法;将上述成分溶解于蒸僧水中,分装到带有倒管的试管中,68.95kPa115C,l0lIb)高 压灭菌20min,最终pH为6.9士0.2. 3.1.3.2伊红美蓝琼脂 同2.1.3.3. 3.1.4仪器 3.1.4.1恒温水浴:44.5C士0.5C或隔水式恒温培养箱 3.1.4.2其他同总大肠菌群多管发酵法(2.1.4.1 2.1.4.9) 3.1.5检验步骤 3.1.5.1自总大肠菌群乳糖发酵试验中的阳性管(产酸产气)中取1滴转种于C培养基中,置44.5C 水浴箱或隔水式恒温培养箱内水浴箱的水面应高于试管中培养基液面),培养24h士2h,如所有管均 不产气 气,则可报告为阴性,如有产气者,则转种于伊红美蓝琼脂平板上,置44.5C培养18h一24h,凡平 板上有典型菌落者,则证实为耐热大肠菌群阳性 3.1.5.2如检测未经氯化消毒的水,且只想检测耐热大肠菌群时,或调查水源水的耐热大肠菌群污染 时,可用直接多管耐热大肠菌群方法,即在第一步乳糖发酵试验时按总大肠菌群2.1.5.1接种乳糖蛋白 陈培养液在44.5C士0.5C水浴中培养,以下步骤同3.1.5.1 3.1.6结果报告 根据证实为耐热大肠菌群的阳性管数,查最可能数(MPN)检索表,报告每100mL.水样中耐热大肠 菌群的最可能数(MPN)值 3.2滤膜法 3.2.1范围 本标准规定了用滤膜法测定生活饮用水及低浊度水源水中的耐热大肠菌群 本法适用于生活饮用水及低浊度水源水中耐热大肠菌群的测定 3.2.2术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.2.2.1 耐热大肠菌群滤膜法membranefilterteehniqueforthermotolerantcoliformbacteria 耐热大肠菌群滤膜法是指用孔径为0.45Am的滤膜过滤水样，细菌被阻留在膜上,将滤膜贴在添 加乳糖的选择性培养基上,44.5C培养24h能形成特征性菌落以此来检测水中耐热大肠菌群的方法 3.2.3培养基与试剂 3.2.3.1MC培养基 3.2.3.1.1成分 陈 10g A 多陈 5长 酵母浸膏 a《 D 氯化钠 5g 乳糖 12.5g 3 号胆盐或混合胆盐 1.5g 琼脂 15g 苯胺蓝 2g o 1 000m 蒸馏水 15
GB/T5750.12一2006 3.2.3.1.2制法 在1000mL蒸水中先加人玫红酸(10g/L)的0.2mol/L氢氧化钠溶液10mL,混匀后,取 00mL加人琼脂煮沸溶解,于另外500mL蒸僧水中,加人除苯胺蓝以外的其他试剂,加热溶解,倒人已 溶解的琼脂,混匀调pH为7.4,加人苯胺蓝煮沸,迅速离开热源,待冷却至60C左右,制成平板,不可高 压灭菌 制好的培养基应存放于2C10C,不超过96h 本培养基也可不加琼脂,制成液体培养基,使用时加2ml3mL于灭菌吸收垫上,再将滤膜置于 培养垫上培养 3.2.3.2EC培养基 同3.1.3.1 3.2.4仪器 3.2.4.1隔水式恒温培养箱或恒温水浴 3.2. 玻璃或塑料培养皿.60mm×15nmm或50mm×12mm 4. 3.2.4.3其他仪器同2.2.4 3.2.5检验步骤 3.2.5. 准备工作同2.2.5.1 .2.5.2过滤水样同2.2.5.2 3. .2.5.3培养;水样滤完后,再抽气约5s,关上滤器阀门,取下滤器,用灭菌锻子夹取滤膜边缘部分,移 3 放在MFC培养基上,滤膜截留细菌面向上,滤膜应与培养基完全贴紧,两者间不得留有气泡,然后将平 皿倒置,放人44.5C隔水式培养箱内培养 h士2h 如使用恒温水浴,则需用塑料平皿,将皿盖紧,或 2！ 用防水胶带贴封每个平皿,将培养皿成叠封人塑料袋内,浸到44.5C恒温水浴里,培养24h士2h 耐 热大肠菌群在此培养基上菌落为蓝色,非耐热大肠菌群菌落为灰色至奶油色 3.2.5.4对可疑菌落转种EC培养基,44.5C培养24h士2h,如产气则证实为耐热大肠菌群 3.2.6结果报告 计数被证实的耐热大肠菌落数,水中耐热大肠菌群数系以100mL水样中耐热大肠菌群菌落形成 单位(CFU)表示,见式(2) 所计得的耐热大肠菌菌落数x1o0 耐热大肠菌菌落数(CFU/100mL 2 过滤的水释体积mL 大肠埃希氏菌 多管发酵法 范围 本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的大肠埃希氏菌 本法适用于生活饮用水及其水源水中大肠埃希氏菌的测定 4.1.2术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 4.1.2. forEscherichiacoli 大肠埃希氏菌多管发酵法multipletubefermentationteehnique 大肠埃希氏菌多管发酵法是指多管发酵法总大肠菌群阳性,在含有荧光底物的培养基上44.5C培 养24h产生葡萄糖醛酸酶(glucuronmi iase ,分解荧光底物释放出荧光产物,使培养基在紫外光下产 生特征性荧光的细菌,以此来检测水中大肠埃希氏菌的方法 4.1.3培养基与试剂 4.1.3.1EC-MUG培养基 16
GB/T5750.12一2006 4.1.3.1.1成分 A 胰蛋白陈 20.0g 乳糖 5. .0g C 3号胆盐或混合胆盐 1.5g 磷酸氢二钾 .0g 4 E 磷酸二氢钾 1.5g 氯化钠 5. .0g G 0. .05g 4-甲基伞形酮-D葡萄糖醛酸苷(MUG 4.1.3.1.2制法 将干燥成分加人水中,充分混匀,加热溶解,在366nm紫外光下检查无自发荧光后分装于试管中. 68.95kPa(115C,10lIb)高压灭菌20min,最终pH为6.9士0.2 4.1.4仪器 紫外光灯;6w,波长366nm的紫外灯,用于观测荧光反应 4.1.4.1 4.1.4.2培养箱;36C士1C 夭平 平M;直径为9 Cm 4.1.4.5试管 4.1.4.6分度吸管lmL,10ml 4.1.4.7锥形瓶 4.1.4.8小倒管 4.1.4.9金属接种环 4.1.4.10冰箱.0C一4c 4.1.5检验步骤 4.1.5.1接种 将总大肠菌群多管发酵法初发酵产酸或产气的管进行大肠埃希氏菌检测 用烧灼灭菌的金属接种 环或无菌棉签将上述试管中液体接种到EC-MUG管中 4.1.5.2培养 将已接种的EC-MUG管在培养箱或恒温水浴中44.5C士0.5C培养24h士2h 如使用恒温水 浴,在接种后30min内进行培养,使水浴的液面超过EC-MUG管的液面 4.1.6结果观察与报告 将培养后的E(C-MUG管在暗处用波长为366nm功率为6w的紫外光灯照射,如果有蓝色荧光产 生则表示水样中含有大肠埃希氏菌 计算EC-MUG阳性管数,查对应的最可能数(MPN)表得出大肠埃希氏菌的最可能数,结果以 MPN/100m报告 4.2滤膜法 4.2.1范围 本标准规定了用滤膜法测定生活饮用水及其水源水中的大肠埃希氏菌 本法适用于生活饮用水及其水源水中大肠埃希氏菌的测定 4.2.2术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 4.2.2. 大肠埃希氏菌滤膜法membranefilterteehmiqueforEscheriehia.coli 用滤膜法检测水样后,将总大肠菌群阳性的滤膜在含有荧光底物的培养基上培养,能产生仔葡萄糖 n
GB/T5750.12一2006 醛酸酶分解荧光底物释放出荧光产物,使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光,以此来检测水中大肠埃 希氏菌的方法 4.2.3培养基与试剂 4.2.3.1MUG营养琼脂培养基(NA-MUG 4.2.3.1.1成分 5.0g 蛋白陈 a.0g 牛肉浸膏 15.0 琼脂 g 0.1 4甲基伞形槲各D葡萄糖配酸#G g 蒸水 1000ml 4.2.3.1.2制法 将干燥成分加人水中,充分混匀,加热溶解,103.43kPa(121c,15b)高压灭菌15min,最终pH 为6.8士0.2 在无菌操作条件下倾倒直径50m平板备用 倾倒好的平板在4C条件下可保存两个 星期 本培养基也可不加琼脂,制成液体培养基,使用时加2mL一3mL于灭菌吸收垫上,再将滤膜置于 培养垫上培养 4.2.4仪器 紫外光灯:6w,波长3866nm的紫外灯,用于观测荧光反应 4.2.4.1 4.2.4.2其他仪器同2.2.4 4.2.5检验步骤 4.2.5.1接种 将总大肠菌群滤膜法有典型菌落生长的滤膜进行大肠埃希氏菌检测 在无菌操作条件下将滤膜转 移到NA-MUG平板上,细菌截留面朝上,进行培养 4.2.5.2培养 将已接种的NA-MUG平板36C士1C培养4h 4.2.6结果观察与报告 将培养后的NA-MUG平板在暗处用波长为366nm功率为6w的紫外光灯照射,如果菌落边缘或 菌落背面有蓝色荧光产生则表示水样中含有大肠埃希氏菌 记录有蓝色荧光产生的菌落数并报告,报告格式同总大肠菌群滤膜法格式 4.3酶底物法 4.3.1范围 本标准规定了用酶底物法测定生活饮用水及其水源水中的大肠埃希氏菌 本法适用于生活饮用水及其水源水中大肠埃希氏菌的检测 本法可在24h判断水样中是否含有大肠埃希氏菌及含有的大肠埃希氏菌的最可能数(MPN)值 本法可同时检测总大肠菌群,方法见2.3. 4.3.2术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 4.3.2.1 大肠埃希氏菌酶底物法enzymesubstratetechniqueforEscheriehiaeoi 在选择性培养基上能产生已半乳糖苷酶(gDgalactosidase)分解色原底物释放出色原体使培养基 呈现颜色变化.并能产生日葡萄糖醛酸酶(gglueuronidase)分解荧光底物释放出荧光产物,使菌落能够 在紫外光下产生特征性荧光;以此技术来检测大肠埃希氏菌的方法为大肠埃希氏菌酶底物法 18
GB/T5750.12一2006 4.3.3培养基与试剂 培养基与试剂同2.3.3 4.3.4仪器设备 4.3.4.1紫外光灯:6w,波长366nm的紫外灯,用于观测荧光反应 4.3.4.2其他仪器同2.3.4 4.3.5检验步骤 检验步骤同2.3.5 4.3.6结果观察与报告 4.3.6.1结果判读 结果判读同2.3.6.1,对照表同表4与表5 水样变黄色同时有蓝色荧光判断为大肠埃希氏菌阳 性,水样未变黄色而有荧光产生不判定为大肠埃希氏菌阳性 4.3.6.2定性反应 将经过24h培养颜色变成黄色的水样在暗处用波长为366nm的紫外光灯照射,如果有蓝色荧光 产生判断为阳性反应,表示水中含有大肠埃希氏菌 水样未产生蓝色荧光判断为阴性反应 结果以大 肠埃希氏菌检出或未检出报告 4.3.6.310管法 4.3.6.3.1将培养24h颜色变成黄色的水样的试管在暗处用波长为366nm的紫外光灯照射,如果有 蓝色荧光产生则表示有大肠埃希氏菌存在 4.3.6.3.2计算有荧光反应的试管数,对照表4查出其代表的大肠埃希氏菌最可能数 结果以MPN/ 00ml表示 如所有管未产生荧光,则可报告为大肠埃希氏菌未检出 4.3.6.451孔定量盘法 4.3.6.4.1 将培养24h颜色变成黄色的水样的定量盘在暗处用波长为366nmm的紫外光灯照射,如果 有蓝色的荧光产生则表示该定量盘孔穴中含有大肠埃希氏菌 4.3.6.4.2计算有荧光反应的孔穴数,对照表5查出其代表的大肠埃希氏菌最可能数 结果以MPN/ 100mL表示 如所有孔未产生茨光,则可报告为大肠埃希氏菌未检出 贾第鞭毛虫 5.1免疫磁分离荧光抗体法 5.1.1范围 本标准规定了用免疫磁分离荧光抗体法测定生活饮用水及其水源水中的贾第鞭毛虫抱囊和隐抱子 虫卵囊 本法适用于生活饮用水及水源水中贾第鞭毛虫抱囊和隐抱子虫卵囊的测定 5.1.2术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 5.1.2.1 贾第鞭毛虫siardit inlestinalis人 -种可能在水中或其他介质中发现的原虫类寄生虫 有两个种,它们的宿主是:G 类和G muris鼠类) 5.1.2.2 隐袍子虫 eryptosporidium -种可能在水中或其他介质中发现的原虫类寄生虫,有6个种,且它们可能的宿主是:C.arum 19
GB/T5750.12一2006 哺乳类动物,包括人类;Cboileyi和C meleagridis(鸟类);Cmuris鼠类;Cserpeatis爬行 类和C.nasorum(鱼类) 5.1.3器材与试剂 5.1.3.1采样器材 5.1.3.1.1Enviroehek方法 蠕动泵 B 泵管; C Evirocheck滤囊(鲑碱滤膜,有效过滤面积1300cm,孔径1.0m); D 夹子 E 水表; 流量控制阀 过滤管; G 塑料连接 H 5.1.3.1.2rFita-MMax方法 Filta-Max滤芯:压缩后的多孔海绵滤膜模块(共60层多孔海绵滤膜从600mm压缩到 A ,其中单层多孔海绵滤膜厚10mm,外径55mm,内径18mm); 30mm Filta-Max滤器;带进出水样口及配套软管和辅助工具的Filta-Max滤器 合适的压力泵(导流泵,蠕动泵等); 泵管; D E 夹子 水表; 流量控制阀(1L/min4L/min) 5.1.3.1.3Filta-MMaxXpres快速方法 Filta-MaxXpress快速滤芯; Filta-MaXpress滤器;带进出水样口及配套软管和辅助工具的Filta-MaxXpres滤器 合适的压力泵(导流泵,蠕动泵). C 系管 D 夹子; 水表; G 流量控制阀(1L/min一4L/min) 5.1.3.2淘洗/浓缩/纯化器材 5.1.3.2.1Envirochek方法 过滤夹;带臂水平振荡装置,臂有垂直安装的过滤夹,最大频率600r/nmin; A B 175ml锥形离心管; 离心机:容量175mL刻度锥形离心管和能达到1500的加速度的离心机 旋涡搅拌器; D E 塑料吸耳球 10mL移液管; 50m移液管; 100mL有刻度的量筒 H ×16 ×10mm -侧平面试管,125mnm mm,带管塞，一侧为60mm 平面; 20
GB/T5750.12一2006 用于一侧平面试管的磁颗粒浓缩器(MPC-M) 锥形具塞5mL微量离心管 巴斯德移液管 5.1.3.2.2Filta-Max方法 手动或自动Flta-Max淘洗主设备及配套装置(浓缩管及底座,洗涤管及不锈钢虹吸管); A 手动真空泵 B C 磁力搅拌器和搅拌棒; 滤膜(3.0pAm),直径73mm D 5.1.3.2.3Fita-Maxxpress快速法 Filta-MaxXpress快速淘洗装置 空气压缩机,至少0.4MPa以上压力,15I压缩空气; C 容量500ml刻度锥形离心管和能达到2000加速度的离心机 500mL锥形离心管; 蠕动系 5.1.3.3染色器材 5.1.3.3.1三通真空泵 5.1.3.3.2湿度孵化盒 5 1.3.3.3显微镜玻璃井形载玻片(井的直径为9mm),容积100l 5 1.3. 3. 4 玻璃盖玻片 5 1.3.3.537C培养箱 5. 1.3.3.6荧光显微镜 3.3. 450nm480nm 的蓝色滤光片 3.3.8330nm385nm 的紫外光滤光片 1.3.3.920倍、40倍、,100倍的目镜 1.3.3.10测微计 5. 5Al20Al的可调微量移液管 5. 1.3.3.1220pL200aL的可调微量移液管 -10ogaL的可调微量移液管 5.1.3.3.13200L 5.1.3.4接种器材 小口塑料瓶(20L) Mallasez或修改的Neubauer血球计数器 所有玻璃器皿和塑料管都必须在使用后及洗涤前经高压消毒 用热的浓洗涤剂溶液清洁器材,然 后将它们放到浓度最小为50g/L的次氯酸钠溶液中,至少在室温浸泡30nmin 用蒸憎水冲洗器材,然 后将其放到没有卵囊的环境中干燥 尽可能使用一次性物品 5.1.3.5试剂 5.1.3.5. 超纯水 5.1.3.5.2150mmol/L.PBS溶液(磷酸缓冲盐) 成分 A NaCl 8.5g 1.07g NaHPO NaHPO2H.O0.39g 加超纯水到 1000mL B 制法:用盐酸或氢氧化钠将pH调到7.2士0.1,在4C可储存1个星期 21
GB/T5750.12?2006 5.1.3.5.3???/???(IMS)?С ?浥??; A ???浥??; C 10SL?A(15mL),?? D 0SLTM?B(10mL),?? ??(IMS)?,4C档 5.1.3.5.4??С ?/???浥?-??5mL),4C 5.1.3.5.5?:2%DABCO/? ? 100mL /PBS?60%/40% DABCO 2g B :?12? 5.1.3.5.61mol/ITris,pH7.4 1000ml??132.2?Tis,??19.4?Ti ?pH7.4?0.1??0.p??,???С ?6? 5.1.3.5.70.5mol/INae-EDTA,pH8.0. 37.22g?ζ?(Na-EDTA??200mL??,? ?pH8.0?0.1,?6? 5.1.3.5.8?? Envirochek?? A ???-12(Laureth-12)y 4g 1mol/LTris,pH7.4 40ml 0,5mol/LNa-EDTA,pHH8.0 8ml A?? 600Al ?? 4000ml ?1g???-12?,?100ml??????,? ???-12?,????1000mLп???Сó???,? е?????С10mlpH?7.4Tris?;2mlpH?8.0Na;-EDTA? 150L.A??ó???1000ml?1? Filta-Max??(PBST?): Na,HPO 1.44g KH,PO. 0.24g KCI 0.2g NaCI 8g ??Tween-20 0.1ml ? 900mL 1.44g?0.24g,0.2g??8g??900ml?, 20 min??,0.1mL??Tween-2010min,?ó?? 1000 0ml Filta-MaxXpress???PETT?): (Sodiumpyrophosphate 0.2g tetra-basicdecahydrate 22
GB/T5750.12一2006 EDTA柠檬酸三钠(EDTAtr-sodiumsalt) 0.3g 10 Tris-HCl(1mol/L mL Tw 1-80 ween- 0.lml 将0.2g焦磷酸四钠和0.3gEDTA柠檬酸三钠加人900m超纯水,搅拌10min使之完全混合 ，Tw ween-80并搅拌 然后加人10mL1.0mol/LTi=Hcl并搅拌5min使之混合 再加人0.1m 0min混合Tween-80粘度高,吸取时务必注意) 最后用超纯水稀释至1000mL,并调节pH至 7.4士0 2 5.1.3.5.90.1mol/L盐酸溶液 5. 1.3.5 10 1mol/L氢氧化钠溶液 5 1.3.5.11纯甲醉 1.3.5.12DAP储存溶液;在一个含有1mg4'6-二氨基-2-苯基吁嗓(DAPI)的烧瓶中,注人500l 的纯甲醉醇2mg/L) 4C暗处储存15天 5. 1.3.5.13DAP染色溶液;用50mLPBS稀释10LDAPI母液 每日配制并将它储存在暗的4C 环境中 5.1.3.5.1450g/L的次氧酸钠溶液 5.1.3.5 15 碱性洗涤剂 5.1.3.5.16纯的Giardialamblia抱囊;浓度为100个抱囊/ml,能在4C储存2个月 u卵囊;浓度为100个卵囊/mL..能在4C储存2个月 5.1.3.5.17纯的Cryposporidiu m parvu 注:对于储存了2个月以上的卵囊存储液,可以在对其浓度和荧光的强度检查之后继续使用 5.1.4分析步骤 5.1.4.1采样/淘洗/浓缩 因水样中的卵囊数量很少,因此需要浓缩较大体积的水样,采样的体积取决于水样的类型 体积(L) 原水 20L 处理水 00L 5.1.4.1.1Envirehek方法 采样系统的组成 A -次性使用的,孔径1m,褶聚酰讽滤纸的滤囊; 压力标定在0.21MPa的控制阀(对于处理水来说是可任意选择的) 连接在滤囊出口的水表,能控制过滤水样的体积 流量能达到2L/min的蠕动泵 B 采样 连接滤囊以外的采样系统 打开蠕动泵的开关,并将流量调到2L/min 在作业线上安装滤囊,用适当的夹子将滤囊的进口和出口固牢 记录水表上指示的体积 将采样系统连接到自来水龙头或其他水源上 通过滤囊过滤适当体积的水样 在过滤结束的时候,记录滤囊过滤的水样体积 将连接在水源上的采样系统取下 打开泵,尽快把滤囊放空 过滤后,要将滤囊放到4C的暗处存放，一般不要超过72h C 淘洗 23
GB/T5750.12一2006 取下滤囊进水口的乙烯栓,用量筒加110m左右的淘洗缓冲液到每个滤囊的外腔中 将滤囊插到带臂水平振荡器的夹钳上,滤囊的出水阀在12点钟的位置 打开振荡器的开关,将速度设在最大速度的80%,然后将样本振荡10nmin 将滤囊中的淘洗液倾注到175ml的锥形离心管中,再用110mL 的淘洗缓冲液将滤囊的外腔 再充满 将过滤器插到振荡器的夹钳上,这次出水阀的位置是它原来位置沿着它的轴方向转90"角 在 80%的功率下,再摇10min. 重复操作步骤d.将乙烯帽小心取下,将滤囊中的淘洗液倾注到175nmL的锥形离心管中 浓缩 将装有淘洗液样本的175m离心管置1500片离心15min 自然地减速,以免扰乱沉淀物 用移液管小心地将上清液吸掉,使上清液刚好到沉淀物的上面为止(不要扰乱沉淀物) 如果压实的沉淀物体积小于或等于0.5mL,就要加试剂水到离心管中,使其总体积为10ml 将试管置于旋转式搅拌器10s15s,以便使沉淀物再悬浮 如果压实的沉淀物体积大于0.5mL,就要用式(3)确定在离心管中需要的总体积: 总需要体积(mL=沉淀物体积×10mL/0.5mL (3 以便将再悬浮的沉淀物调整到一个0.5mL相同压实的沉淀物体积,加试剂水到离心管中,使其总 体积达到上面计算的水平 将试管旋转搅拌10s15s,以便使沉淀物再悬浮 记录这个再悬浮物的 体积 5.1.4.1.2Fita-Max方法 采样 A 将滤芯(螺栓头朝下)安装在支架上,拧紧盖子盖子即为进样口) 将过滤装置连接到需采样的水源 注1为使液体流经滤芯需在顶部施加0.05MPa的压力 推荐的0.05！ MPa工作压力形成的液体流速为 3L/nmin4L/min，工作压力最大不应超过0.8MPa， 注2:采样时如使用导流系、蠕动系等泵类装置,应安装在过滤装置上游 注3:样品采集可在水源现场或实验室完成 B 淘洗与浓缩 在淘洗与浓缩过程中,参考生产商的手动或自动淘洗装置使用手册操作 手工淘洗步骤 第一次淘洗 将34m滤膜放置到浓缩器中,组装好浓缩管和洗涤管 将过滤模块(滤芯)从 支架上取下,安装到淘洗器的活塞顶部 将淘洗器的狭口与洗涤管用快接头连接 拉下淘洗器的延伸 臂至锁住,从过滤模块上去除螺栓 再连接上不锈钢虹吸管 向浓缩管注人600mlPsr缓冲液.,随 后连接到快接头上 将活塞上下活动20次,以冲洗解压的过滤模块 拆下浓缩管,挤压活塞5次以清 除过滤器中的残留液体 2 第一次淘洗液浓缩 将浓缩管与磁性搅拌棒连接,放置在磁性搅拌盘上,以60 r/min 120r/min搅拌 将真空泵连接到浓缩器上,形成压力为13.3kPa40.0kPa的真空 打开活栓,使流 出液浓缩到30ml一40ml. 将浓缩液轻轻倒人50mL.离心管中 3)第二次淘洗 浓缩管中重新加人600mPBST缓冲液,再连接到洗涤管上 重复第一次淘洗 过程,只需10次 4" 第二次淘洗液浓缩 将第一次的浓缩液加人到第二次的淘洗液中 按上述方法重复浓缩 过程 5 将3m滤膜转移到提供的袋子中,加人5mlPBST缓冲液,隔着袋子用手轻轻磨擦滤膜 如此,清洗2次 将清洗液与浓缩液混合 24
GB/T5750.12一2006 自动淘洗步骤 第一次淘洗 将3Am滤膜放置到浓缩器中,组装好浓缩管和洗涤管 打开自动淘洗器电源 将过滤模块从支架上取下,安装到淘洗器的活塞顶部 将淘洗器的狭口与淘洗管用快接头连接 按控 制面板上的F1键,卸下过滤模块上的螺栓 再连接上不锈钢虹吸管 向浓缩管注人600mLPBST缓 冲液,随后连接到快接头上 按F1键开始初次浸润,然后按F3键进行第一次淘洗 拆下浓缩管,按F4 键以清除过滤器中的残留液体 第一次淘洗液浓缩 将浓缩管与磁性搅拌棒连接,放置在磁性搅拌盘上,以60r/min~ 120r/min搅拌 将真空系连接到浓缩器上,形成压力为13.3kPa一40.0kPa的真空 打开活栓,使流 出液浓缩到30mL一40ml 将浓缩液轻轻倒人50mL离心管中 3 第二次淘洗 浓缩管中重新加人600mlPBST缓冲液,再连接到洗涤管上 按F3键开始淘 洗 拆下浓缩管,按F4键以清除过滤器中的残留液体 4)第二次淘洗液浓缩 将第一次的浓缩液加人第二次的淘洗液中 按上述方法重复浓缩过程 将3m滤膜转移到提供的袋子中,加人5mLPBST缓冲液,隔着袋子用手轻轻磨擦滤膜 5 如 此,清洗2次 将清洗液与浓缩液混合 5.1.4.1.3Filta-Maxxpress快速方法 采样 A 将过滤模块(螺栓头朝下)安装在支架上,拧紧盖子盖子即为进样口) 将过滤装置连接到需采样的水源 注1为使液体流经滤膜需在顶部施加0.05MPa的压力 推荐的0.05MPa工作压力形成的液体流速为 3L/min~4L/min 工作压力最大不应超过0.8MPa 注2:采样时如使用导流泵、蠕动泵等泵类装置,应安装在过滤装置上游 注3;样品采集可在水源现场或实验室完成 注4:本方法亦适用于浊度高的水源水的采样 淘洗 B 采用Fita-MaxXpress压力淘洗装置可使淘洗过程全自动完成 详细操作程序参见生产商使用指 南 将压力淘洗装置准备就绪,向缓冲液槽中加人足量的淘洗缓冲液,利用厂商提供的连接锁合将缓冲 液槽与压力淘洗装置连接,确保二者之间形成良好密封 连接压缩空气源和压力淘洗装置,保证足够的 空气压力和体积 打开压力淘洗装置后面的封闭阀 淘洗步骤为 打开压力淘洗器 过滤装置进样口朝上,移开样品阻留器,连接出样口分流装置(过滤模块仍在过滤装置内) 将过滤装置倒转,用快接头连接到压力淘洗器上 将500m锥形离心瓶放置在样品收集器支架上,关闭压力淘洗装置 按控制面板的键,开始自动淘洗 淘洗结束时.打开压力淘洗装置 卸下过滤装置,再拿开出样分流装置,打开过滤装置,弃掉过 滤模块 将离心瓶盖好,从样品收集器支架中取出 C 浓缩 将装有淘洗液样本的500mL离心管置2000从离心15 nmin 慢慢地减速,以免搅起沉淀物 记录沉淀物体积 注意;勿用制动器!！ 离心后,用吸气装置将沉淀物上层8ml~10ml处的悬浮物小心吸出(吸气装置的真空应小于 3.3kPa 25
GB/T5750.12一2006 如果压实的沉淀物体积小于或等于0.5mL,将试管置于旋转式搅拌器20s,然后将样品转人 L.eighton管中;用1ml试剂水冲洗离心瓶两次,清洗液转人同一L.eighton管中 如果压实的沉淀物体积大于0.5mL.就要用式(4)确定在离心管中需要的总体积.以便将再悬 浮的沉淀物调整到相当于0.5ml压实沉淀物的体积 总需要体积(mL=沉淀物体积×10mL/0.5mL (4 加试剂水到离心管中,使其总体积达到上面计算的水平 将试管旋转搅拌10s一15s,以便使沉淀 物再悬浮 记录这个再悬浮物的体积 5.1.4.2IMIs分离 5.1.4.2.1试剂制备 由10×sL-A型缓冲液配制稀释的1×SL-A型缓冲液 用试剂水作为稀释剂 每个样品制备 A lmL.的1×sL-A型缓冲液 注意;长时间在0c~4c储存后,可能会在10xSL-A型缓冲液中形成一些结晶沉淀 为了确保这 些沉淀的结晶能够再溶解,使用前应将其置室温(15c~22c恒温 B加1 10XSL-A型缓冲液和1mL.10×sL-B型缓冲液到一侧平面试管中 nL 5.142.2卵囊捕获 定量转移10mL水样浓缩物到含有sL-缓冲液的一侧平面试管中 A 将抗隐袍子虫抗体和抗贾第鞭毛虫的磁微粒原液置于漩涡混合器上搅拌,以便使珠粒悬浮 通过倒置试管的方法保证珠粒再悬浮,并确定底部没有残留的小团 C 在含有水样浓缩物和 -缓冲液样品的一侧试管中各加100L上述悬浮的微粒 Sl 将样品试管固定到旋转式的搅拌器上,在大约25r/min的条件下至少旋转1h E 至少旋转1h后,将试管从搅拌器上取下,然后再将其放在磁粒浓缩器(MPC1)上,并将试管 有平面的一边朝向磁铁 F 用手柔和地大约90"角头尾相连地摇动试管,使试管的盖顶和基底轮流上下倾斜 以每秒大约 倾斜一次的频率持续2min G 如果让MPC-1中的样品静置10s以上,就要在进行下一个步骤之前,重复前一个即步骤F) 步骤 立即打开顶端的盖,同时将保持在MMPC-1上的试管中的所有上清液倒到一个适当的容器中 H 做这一步骤时,不要摇动试管,也不要将试管从MPC-1上取下 将试管从MPC-1上取下,加1ml1×sL-A型缓冲液 非常柔和地将试管中的所有物质再悬 浮 不要形成漩涡 将样品试管中的所有液体定量转移到有标签的1.5mL微量离心管中 K 将微量离心管放到另一磁粒子浓缩器MPC-M)中,MPC-M在放微量离心管的位置有一根 磁条 用手180"角轻轻地摇动试管 每秒大约摇动一个180"角的频率,持续大约1min 在这一步结 束时,珠粒和卵囊会在试管的背面形成一个褐色圆点 M立即从留在MPC-M上的试管和顶盖中的上清液吸出 如果同时处理一个以上的样品,就要 在吸去每个试管的上清液之前,进行3个180"角的摇动或滚动的动作 小心不要扰乱与磁铁邻近管壁 上的附着物 不要摇动试管 当进行这些步骤时,不要将试管从MPC-M上取下 5.1.4.2.3磁珠与抱(卵)囊复合物的分离 将磁条从MPCcM上取下 A 加50L.0.1mol/1的盐酸(HCI)至上述微量离心管中,用涡旋混合10s 将试管放在MPC-M上,然后让它在室温垂直静止10min D 用力涡旋5s~10s E 保证所有样品都在试管的底部,然后将微量离心管放在DynalMPC-M上 26