海参及其制品中海参皂苷的测定高效液相色谱法

海参及其制品中海参皂苷的测定高效液相色谱法

国家标准 GB/T33108一2016 海参及其制品中海参皂苷的测定 高效液相色谱法 Determinationofseaeueumberglycosidesinseacucumberandsea eucumberproduets Highperformameliquidchromatography 2016-10-13发布 2017-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T33108一2016 海参及其制品中海参皂苷的测定 高效液相色谱法 范围 本标准规定了海参及其制品中海参皂苷含量的高效液相色谱测定方法 本标准适用于海参及其制品中海参皂苷含量(以唾诺糖计)的测定,畦诺糖为海参皂苷特征性单糖 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 水产品抽样方法 GB/T30891 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 唾诺糖quinovose 6-脱氧葡萄糖6-Deoxy-D-gulcose 分子式c,HO.,相对分子质量164.16 广泛存在于海参皂苷糖链中,每个海参皂苷分子中有且仅含有一个唾诺糖单元 3.2 海参皂苷seacuceumberglycosides 由羊毛笛婉衍生物和低聚糖组成的三帖皂苷化合物,其中瞠诺糖为其稳定的特征性单糖 原理 样品经乙醇提取、正丁醇萃取得到海参皂苷,再经三氟乙酸水解,水解液中畦诺糖与1-苯基-3-甲 基-5-毗幽啾酮(PMP)进行衍生反应,产物经C色谱柱分离,高效液相色谱紫外检测器测定,外标法定 量,以畦诺糖含量标示样品中海参皂苷的含量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯试剂 5.1水为符合GB/T6682规定的一级水 5.2甲醇(CH.OH):色谱纯 5.3乙睛(CH.CN):色谱纯 5.4乙醇(CH.CH.OH)
GB/T33108一2016 5.5正丁醇[CH.,(CH).CH,OH] 5.6三氧甲烧(CHCI):色谱谐纯 5.7氢氧化钠(NaOH) 5.8盐酸(Hcl. 5.9磷酸二氢钾(KH,PO. .10三氟乙酸(CF.cOOH) 55 5.111苯基子-甲基于肚眸啡剩(PMP)使用前用甲醉重结晶两次 将PMP加人到甲醉中加热(G60c 64C)溶解制成饱和溶液,冰水混合物冷却,析出晶体,抽滤洗涤晶体,重复结晶一次 5.12憧诺糖标准品;纯度>98.0%,CAs号7658-08-4 5.13乙醇溶液(60%);量取60ml乙醇,加40mL.水,混匀 5.14盐酸溶液(0.3mol/L):量取 L.分析纯盐酸(5.8),用水稀释并定容至100mlL 2.5ml 5.15三氟乙酸溶液(2mol/L)称取22.8甚三氟乙酸(S.10),用水稀释并定容至100mL 5.16氢氧化钠溶液(4mol/L)称取16.0g氢氧化钠(5.7),用水稀释并定容至100mL. 5.17氢氧化钠溶液(0.3mol/L);称取1.2g氢氧化钠(5.7),用水稀释并定容至100mL 5.18PMP衍生剂溶液( 0.5mol/l );称取8.71g重结晶后的1-苯基-3-甲基-5-咄哗琳酮(PMP)(5.1l). 用甲醉溶解并定容至100ml C保存,有效期1个月 5.19呤诺糖标准储备液(324mg/L);称取呤诺糖标准品(5.12)3.24mg,用水溶解并定容至10mL C密封保存,有效期1个月 L 5.20诺糖标准工作液;准确移取适量诺糖标准储备液(5.19),用水稀释成浓度为6.48mg/ L,25.92mg/L,32.4 12.96mg/L,19.44mg/L mg/L的畦诺糖系列标准工作液,当天配制,现用现配 5.210.0mol磷酸盐缓冲溶液;称取6.80g磷酸二氢钾(5.9)溶于约900mL水中,用氢氧化钠游 液(5,16)调节pH至5.1一5.3,用水定容至1L,0.45um滤膜过滤,现用现配 5.22磷酸盐-乙睛溶液:取乙睛(5.3)220ml,用0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(5.21)稀释至1000mL. 用气氧化的游液(51)调节p至5.2 仪器和设备 6.1高效液相色谱仪;配有紫外检测器 6.2分析天平;精度0.01mg 63均质机 6.4涡旋振荡器 6.5高速万能粉碎机 6.6旋转蒸发仪 6. 恒温水浴 6.8微孔滤膜;0.45m 6.9反应管:15ml,螺口,带聚四氟乙烯衬垫 6.105ml容量瓶 6.115ml安瓶 6.1210ml具塞试管 测定方法 7.1抽样 产品抽样按GB/T30891的规定进行
GB/T33108一2016 7.2试样制备 7.2.1鲜海参 去肠腺,灰嘴,剪成约0.5cm×0.5cm的小块,匀浆备用 7.2.2干海参 粉碎,过0.850mm筛,混匀备用 7.2.3即食海参及盐溃海参 剪成约0.5cmx0.5em的小块,匀浆备用 7.2.4其他海参制品 直接粉碎,匀浆或混匀,备用 7.3海参皂苷的提取 7.3.1固体样品 粉末状试样称取约2g(精确至0.01g),匀浆试样称取约10g(精确至0.01g),加人40ml乙醉溶 液(5.13),回流提取1h,重复提取3次,合并乙醇提取液于鸡心瓶中,50C旋转燕发除去乙醇,提取物 用20ml水溶解,加人20ml正丁醇,充分振荡,静置分层,吸取上层正丁醇层,按上述方法用正丁醇重 复萃取3次,合并正丁醇萃取液于鸡心瓶中,50C旋转蒸发至干,即得海参皂苷粗提物 7.3.2液体样品 准确移取20mL一50mL样品于分液漏斗中,加人等体积正丁醇萃取3次,合并正丁醇萃取液于鸡 心瓶中,50C旋转燕发至干,即得海参皂苷粗提物 7.4水解 将7.3得到的粗提物溶解于2ml三氟乙酸溶液(5.15)后,转移至5ml安瓶中,充氮封管， 120C水解2h,冷却至室温,用氢氧化钠溶液(5.16)中和至pH值为6.57.5后转移人10ml具塞试 管中,加1ml三氯甲炕,充分振荡,静置分层,吸弃下层三氯甲烧层,按上述方法重复萃取3次,将上层 水相转移至5mL容量瓶中,用水定容至5nmL,即得海参皂苷水解液 7.5衍生及净化 7.5.1衍生 准确移取7.4制备的试样海参皂苷水解液250L于15mL反应管中,加人250LPMP衍生剂溶 液(5.18)和250L的NaOH溶液(5.17),涡旋混合混匀,70C水浴反应30min,取出冷却至室温,加 250Al盐酸溶液(5.14),涡旋混合 7.5.2净化 加1 三氯甲婉,充分振荡,静置分层,吸弃下层三氧甲炕层,按上述方法用三氧甲烧重复萃取 nmL 3次 将上层水相过0.45Am滤膜,供高效液相色谱分析
GB/T33108一2016 7.6标准工作曲线制作 准确移取浓度为6.48mg/L,12.96mg/L,19,44mg/L,25.92mg/L,32.4mg/儿的憧诺糖标准工作 液(5.20)250L于15m具塞反应管中,加人250LPMP衍生剂溶液(5.18)和250L的氢氧化钠溶 液(5.17),涡旋混合混匀后,70C水浴反应30min,取出冷却至室温,加250L，盐酸溶液(5.14),涡旋 混合 加1ml三氧甲烧,充分振荡,静置分层,吸弃下层三氧甲婉层,按上述方法用三氯甲烧重复萃取 3次 将上层水相过0.45am滤膜 以唾诺糖标准工作溶液浓度为横坐标,以唾诺糖行生物峰面积为 纵坐标绘制标准工作曲线 7.7空白试验 除不加试样外,均按上述测定条件和步骤进行 7.8平行试验 对同一试样进行平行试验测定 7.9测定 7.9.1 液相色谱参考条件 7.9.1.1色谐柱;C柱,150mm×4.6mm,54m或其他性能相当者 7.9.1.2柱温:25C 7.9.1.3检测波长;250nm 7.9.1.4进样量;20AL 7.9.1.5流速:1.0mL/min. 7.9.1.6流动相;磷酸盐-乙晴溶液(5.22). 7.9.2色谱分析 分别注人20L唾诺糖系列标准行生液(7.6)试样衍生液(7.5)和空白衍生液(7.7)于高效液相色 谱仪中,按7.9.1规定的色谱条件进行分析,记录峰面积,试样液中呤诺糖衍生物的响应值均应在标准 曲线范围之内 根据标准品的保留时间定性,外标法定量 呤诺糖标准溶液衍生物和试样液衍生物液 相色谱图参见附录A 7.10结果计算与表述 7.10.1试样中海参皂甘的含量(以呤诺糖计)按式(1)计算 c一c× 5 X= 7 式中: 试样中海参皂苷的含量(以唾诺糖计),单位为毫克每千克(mg/kg)或毫克每升(mg/L); 试样海参皂苷水解液中唾诺糖的浓度,单位为毫克每升(mg/L); C1 -空白水解液中唯诺糖的浓度,单位为毫克每升(mw/L) C" 试样海参皂苷水解液的定容体积,单位为毫升(mL): -试样的质量或试样体积,单位为克(g)或毫升(mL). 1 计算结果保留三位有效数字
GB/T33108一2016 7.10.2海参皂昔与畦诺糖的换算参照附录B. 方法灵敏度、准确度和精密度 8.1 灵敏度 本方法定量限;固体样品5.0mg/kg,液体样品1.0mg/L 8.2 准确度 本方法唾诺糖在固体样品中添加回收率为85%100%,在液体样品中添加回收率为95%110% 8.3精密度 本方法批内相对标准偏差<10%,批间相对标准偏差<15%
GB/T33108一2016 附 录A 资料性附录 液相色谱图 A.1憧诺糖衍生物标准色谱图 憧诺糖衍生物标准色谱图见图A.1 mAU一 200 150 100 50 图A.1唾诺糖衍生物标准色谱图 A.2干海参中胯诺糖衍生物色谱图 干海参中呤诺糖衍生物色谱图见图A.2 mAu 200 150 100 50 图A.2干海参中呸诺糖衍生物色谱图 A.3海参口服液中唾诺糖衍生物色谱图 海参口服液中唾诺糖衍生物色谱图见图A.3
GB/T33108一2016 mAU 200 150 100 50 10 图A.3海参口服液中隆诺糖衍生物色谱图
GB/T33108一2016 附录B 资料性附录 海参皂苷与憧诺糖的换算 B.1海参皂苷的含量计算 试样中海参皂苷的含量按式(B,.1)进行计算,计算结果保留三位有效数字 X=r×F (B.1) 式中: X 试样中海参皂苷的含量,单位为毫克每千克(mg/lkg)或毫克每升(g/L); 试样中唾诺糖的含量,单位为毫克每千克(mg/kg)或毫克每升(mg/L); . 憧诺糖换算为海参皂苷的系数 B.2不同品种海参中海参皂苷的换算系数 不同品种海参中海参皂苷与唾诺糖的换算系数见表B.1 表B.1不同品种海参中海参皂苷与畦诺糖的换算系数 海参品种 换算系数F 8.5 刺参(Apostichopusjaponicus) 革皮氏海参(Holothuriaatru 7.2 黑海参(Holohuriaatra 7.3 北极海参(Holothuriumericaa 7.4 靴参(ActinopyKaechiniles 7.2 糙海参(Holohunmscobru) 7.3 7.3 乌皱参(Abm/ywamiliari)

高效液相色谱法测定海参制品中海参皂苷

海参是一种珍贵的食用和药用动物，被誉为“海味之宝”，其主要成分为蛋白质、多糖和皂苷等。其中，海参皂苷被认为是海参具有保健作用的重要成分之一。

因此，对于海参及其制品中海参皂苷的测定就显得格外重要。目前，高效液相色谱法已经成为测定海参皂苷的常用方法之一，并且在国家标准GB/T33108-2016中规定了该方法的详细操作步骤。

该方法首先需要将样品制备成适当的浓度，然后采用C18反相小柱进行分离，流动相为甲醇和0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH=2.7），梯度洗脱。最后，使用紫外检测器检测目标物质的吸收峰。

通过该方法的测定，可以实现对海参及其制品中海参皂苷的准确测定，并为海参的保健价值提供科学依据。

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