畜禽肉中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉它霉素、交沙霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法

畜禽肉中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉它霉素、交沙霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T20762一2006 畜禽肉中林可霉素、竹桃霉素、红霉素 替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、 吉它霉素、交沙霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 ethodforthedeterminationoflinemycinoleandomyein erythromycin，tilmieosin，tylosin，clindamyein，spiramycin，kitasamyein amdjosamyeinresiduesinlivestoekandpoltry muscleS- LC-MS-MSmethod 2007-03-01实施 2006-12-31发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20762一2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由秦皇岛出人境检验检疫局提出 本标准由国家质量监督检验检疫总局归口 本标准起草单位:秦皇岛出人境检验检疫局、山东农业大学 本标准主要起草人:庞国芳、王飞、曹彦忠、贾光群,连玉晶、张进杰、李学民、范春林,刘永明、 石玉秋 本标准系首次发布的国家标准
GB/T20762一2006 畜禽肉中林可霉素、竹桃霉素、红霉素 替米考星、泰乐菌素克林霉素、螺旋霉素、 吉它霉素、交沙霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了牛肉、猪肉、羊肉和鸡肉中林可霉素,竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素,克林霉 素、螺旋霉素、吉它霉素和交沙霉素残留量的液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于牛肉猪肉、羊肉和鸡肉中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星,泰乐菌素、克林霉 素,螺旋霉素,吉它霉素和交沙霉素残留量的测定 本标准的方法检出限;林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉它 霉素和交沙霉素均为1.04g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是杏可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 (GB/T6379.1一2004,IsO5725-1;1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,.IsO5725-2;1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682-1992,neqIso3896.1987) 原理 畜禽肉中九种大环内酯类抗生素(林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素,克林霉素,螺 旋霉素、吉它霉素和交沙霉素)的残留用乙晴提取,提取液用正己婉去除脂肪后浓缩,再用磷酸盐溶液溶 解后,经OasisHLB固相萃取柱净化,甲醇洗脱,洗脱液浓缩定容后,供液相色谱-串联质谱法测定,内标 法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为优级纯.水为GB/T6682规定的 一级水 甲醇;色谱纯 4.2乙睛;色谱纯 4.3正已炕;色谱纯 4.4甲酸铵 4.5磷酸氢二钠 4.6氢氧化钠 氯化钠
GB/T20762一2006 4.82%氯化钠溶液;称取10.0氯化钠(4.7)，溶解于500m水中 4.9磷酸盐缓冲溶液;0.1nmol/L 6.0g磷酸氢二钠(4.5)溶解于450ml水中,用氢氧化钠(4.6)饱 和溶液调节pH=8,用水定容至500nml 使用前配制 4.10甲醇十水溶液(2+3):400mL甲醇(4.1)与600mL水混合 使用前配制 4.11甲酸铵溶液;0.1mmol/儿L， 0.63g甲酸铵(4.4)加水溶解至1000ml 4.12林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星,泰乐菌素,克林霉素、螺旋霉素、吉它霉素,交沙霉素和罗 红霉素(roxithromycin)标准物质:纯度95% 4.13标准储备溶液;1.0mg/mL 准确称取每种标准物质(4.12)10.0mg分别放人10mL.容量瓶 中 .用甲醉溶解并定容至刻度,混匀 4C保存 4.14混合标准储备溶液:10.0ug/mL 分别吸取0.1mL各标准储备溶液(4.13)于10mL容量瓶 中,用甲醉定容至刻度 4C保存,可使用一周 4.15混合标准工作溶液;1.04g/mL 吸取1.0mL混合标准储备溶液(4.14)于10mL容量瓶中,用 甲醇定容至刻度 用前配制 4.10内标储备溶液l.0mg/ml. 准确称取10.0mg罗红霉素(4.12)于10mL容量瓶中,用甲醉浴 解定容至刻度,混匀 4C保存 4.17中间浓度内标溶液;10.04g/mL 吸取0.1mL内标储备溶液(4.16)于10m容量瓶中,用甲 醉定容至刻度 4C保存 内标工作游液l.0国/nl 吸取1.0mL中间浓度内标标准游液(A.17)于10mL容量瓶中,用 4.18 甲醇定容至刻度 用前配制 4.19基质标准工作溶液;分别吸取1.0L、2.0AL、5.0L10.0AL、.50.0L混合标准工作溶液 L内标工作游液(413),用样品空白提取液定容至l.0ml配皮1.0ng/ml. 4.15),加人10.0 nl.0.0g/mL浓度系列基质标准工作溶液 用前配制 2.0ng/ml、,5.0ng/mlI0.0ng/m" 4.20OasisHLB固相萃取柱或相当者;500mg,6mL,或相当者 使用前,分别用10mL甲醇、10mL 水、5ml氯化钠溶液和5mL磷酸盐缓冲溶液(4.9)活化,保持柱体湿润 4.21 滤膜:0.2 2Am 仪器 5.1液相色谱-串联质谱仪;配有电喷雾离子源 天平.感量0.lg.0.0o0I 5.2 g 5.3固相萃取装置. 5.4氮气浓缩仪 5.5具塞聚丙烯离心管50mL 离心机 试样制备与保存 试样的制备 从全部样品中取出有代表性样品约1kg,充分搅碎,混匀,均分成两份,分别装人洁净容器内 密 封后作为试样,标明标记 在抽样和制样的操作过程中,应防止样品受到污染或发生残留物含量的 变化 试样的保存 将试样于一18C保存
GB/T20762一2006 测定步骤 7.1提取 称取5段试样,精确至0.01g,置于50m离心管(5,5)中,加人10.0l内标工作溶液(4.18)和 15.0ml乙睛(4.2),于振荡器上剧烈振荡10min 以4200r/min的转速离心5nmin,取上清液于另一 离心管中,加人2.0只氯化钠(4.7)和10.0mL正己烧(4.3),于振荡器上剧烈振荡10min 以 4200r/nmin的转速离心10min,小心吸取中间乙晴层12.0mL于另一离心管中,用氮气浓缩仪于55c 水浴中吹至近干 7.2净化 用7ml 磷酸盐缓冲溶液(4.9)分两次溶解残液(7.1),使样液以小于1.0nmL/min的流速通过 OasisHLB固相萃取柱(4.20) 样液全部流出后,再用10ml水和5mL甲醇十水溶液(4.10)洗柱,弃 去全部流出液,固相翠取柱用真空系抽干1h 再用10nmL甲醉(.1)洗脱于15nl锥形试管中,用知 气浓缩仪于55C水浴中吹至近干,准确加人1.0m甲酸铵溶液(4.11)溶解残渣 用阴性样品,按上述 步骤制备空白样品提取液 过0.2 24m滤膜(4.21)后,供液相色谱-串联质谐仪测定 测定 7.3.1液相色谱条件 色谱柱;lntersilCw,3pm,150mm×2.1mm 或相当者 a 进样量;20L bb 流速:0.5mL/min d柱温:20C; 流动相;A:0.1mmol/1 甲酸铵溶液,B:乙晴 梯度洗脱条件见表1 表1梯度洗脱条件 时间/nin 流速/mL/nmin) 流动相A/% 流动相B/% 95 0.0 0.50 95 1.0 0.50 60 40 6.0 0.50 95 6. 0,50 0.50 95 10,0 95 10.1 0.50o 95 20.0 0.50 质谱条件 离子源电喷雾离子源， a 扫描方式;正离子扫捕 b 检测方式;多反应监测; d 电喷雾电压:5500V; 雾化气压力;0.069MPa; 气帘气压力:0.69MPa; g 辅助气流速:0.414MPa; 离子源温度;350C; 碰撞室出口电压;2.0V 定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压,见表2
GB/T20762一2006 表2九种大环内酯类抗生素定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压 被测物名称 定性离子对(m/ 定量离子对(m/) 碰撞气能量/八V 去簇电压/八V 07.21. 50 林可霉素 407.2/126. 24 50 407.2/359.2 70 30 688.4/158.2 竹桃霉素 688.4/158.2 42 688.4/544.3 30 50 734.3/158,2 红霉素 734.3/158.2 734.3/576.3 50 62 869.4/174.2 90 替米考星 869.4/174.2 T0 90 869,4/132.1 916,4/174.2 80 ad 泰乐菌素 916,4/174.2 55 80 916.4/145.1 425.2/126. 53 克林霉素 425.2/126.1 28 53 425.2/377.3 60 843.3/142.2 螺旋霉素 843.3/142.2 50 60 843.3/174.2 70 772.3/215.2 吉它霉素 772.3/215.2 42 772.3/109.1 70 828.3/174.2 80 交沙霉素 828.3/174.2 45 828.3/109.1 80 液相色谱-串联质谱测定 3.3. 定性测定 在相同试验条件下,待测样品溶液(7.2)中被测物的保留时间与基质标准工作溶液(4.19)中被测物 的保留时间的比值,偏差在士2.5%之内 并且,待测样品游液中,被测物中各定性离子相对丰度与浓度 接近的基质标准工作溶液中被测物的各定性离子相对丰度的比值,若熊差不超过表3规定的范围,则可 判定为样品中存在对应的待测物 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 50 2050 l0一20 允许的最大偏差 士2o 士25 士5o 士30 7.3.3.2定量测定 在仪器最佳工作条件下,以基质标准工作溶液浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准工作曲 线 用基质标准工作溶液的工作曲线对样品进行定量,应使样品溶液中九种大环内酯类抗生素的响应 值在仪器测定的线性范围内 在上述色谱条件和质谱条件下,九种大环内酯类抗生素的参考保留时间 见表4,九种大环内酯类抗生素的标准物质多反应监测(MRM)色谱图参见图A.1 表4九种大环内酯类抗生素参考保留时间 被测物名称 保留时间/nmin 林可霉素 6.96 竹桃霉素 7.36 红霉素 8,06 替米考星 8.36
GB/T20762一2006 表4(续 被测物名称 保留时间/min 泰乐菌素 8,48 克林霉素 8.51 8.67 螺旋霉素 吉它霉素 8.83 交沙霉素 9,14 平行试验 按试样步骤,对同一试样进行平行试验测定 7.5空白试验 不称取样品,其余均按试样步骤进行 结果计算 结果按式(1)计算: 1000 X - × x会x是×六×" oo 式中 -试样中被测物残留量,单位为微克每千克(ee/ke) 基质标准工作溶液中被测物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL) 试样溶液中被测物的色谐峰面积 基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积 试样溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); 基质标准工作溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL) 基质标准工作溶液中内标物的色谐峰面积 试样溶液中内标物的色谱峰面积 样液最终定容体积,单位为毫升(mL); 试样溶液所代表试样的质量,单位为克(g) 7 注计算结果应扣除空白值 精密度 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,其重复性和再现性的 值以95%的可信度来计算 重复性 在重复性实验的条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,畜禽肉中九种大 环内酯类抗生素含量范围及重复性方程见表5 表5含量范围及重复性和再现性方程 被测物名称 含量范围/ 重复性限r" 再现性限R /4g/ 林可霉素 1.010,0 lgr=1.0940lgm-1.4214 lgR=0.9331lgm一0.8335 竹桃霉素 1.010.o lgr=1.0632lgm一1.4236 R=0.1461m一0.0124 1.0~l0.0 lg/=0.8820lgm一1.3150 lgR=1.0196lgm-0.8527 红霉素 替米考星 1.0~l0.0 gr=1.1543lgm-1.4568 R=0.1157川+0.0094
GB/T20762一2006 表5(续 被测物名称 含量范围/(g/kg 重复性限r" 再现性限R 泰乐菌素 l.010,0 lgr=1.l137lgm一1.4373 lgR=1.3973lgm-1.1955 克林霉素 r尸=0.0436一0.0137 1.0~10.0 lgR=1.4436lgm一l.1911 1.0~10.0 螺旋霉素 g"=1.1521lg"一1.4711 gR=0.9930g"一0.8379 吉它霉素 1.010.0 lgr=0.7018lgm一1.258o gR=1.0171gm-1l.0072 交沙霉素 1.010,0 lgr=0,9971lgm-1.4369 lgR=0.9865lgm-0.7972 注:m为两次测定值的算术平均值 如果差值超过重复性限r,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9.2再现性 在再现性实验的条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,畜禽肉中九种大 环内酯类抗生素的含量范围及再现性方程见表5
GB/T20762一2006 附 录 A 资料性附录 九种大环内酯类抗生素标准物质多反应监测(MRM)色谱图 九种大环内酯类抗生素标准物质多反应监测(MRM)色谱图,见图A.1 6,96 2.8e5 林可霉素 2.5e5 2.0e5 1.5e5 1.0e5 5.04 0.0 12 15 16 17 1/min 林可霉素 a 7.36 3.6e4 竹桃霉素 3.04 2.04 1.0e4 0.0" 6 12 3 15 1617 1/min 竹桃霉素 b 8,06 1.00e5 红霉素 8.00e4 6.004 4.00e4 2.00e4 0.00 1 12 13 14 15 16 17 1/min 红霉素 c 8.36 7.54 替米考星 6.0e4 4.0e4 2.0e4 0.0" 17 15 10 12 16 1/min 替米考星 dD 8,48 1.00e5 秦乐幽素 8.00e4 6.00e4 4.00e4 2.00e4 0.00 17 12 15 10 13 14 16 1/mim 泰乐菌素 e 图A.1九种大环内酯类抗生素标准物质多反应监测(MM)色谱图
GB/T20762?2006 8,51 1.7e5 i.55 1.0e5 .0e4 0.0" 7 1o 11 12 13 14 15 16 1/min f ù 8.67 9350 8000 6000 4000 2000 12 13 14 15 16 17 10 1/min ù g 8.83 15e4 ù 1.0e4 5000.0 0.0 I0 12 13 15 16 17 1/min h ù 9.14 8.0e4 ?ù 6.0u4 4.0e4 2.0e4 0.0 11 12 13 14 15 16 17 1/min i ?ù ?A.1()
GB/T20762一2006 附录 B 资料性附录 收率 本方法中九种大环内酯类抗生素添加浓度及其平均回收率的试验数据,见表B.1 表B.1九种大环内酯类抗生素添加浓度及其平均回收率的试验数据 被测物名称 添加浓度/ug/kg 平均回收率/(% 88.0o 2.0 88.2 林可霉素 5.0 87.1 0.0 8A.5 1.0 84.9 2.0 85.1 竹桃霉素 5.o 85." 10.o 86.4 1.0 84.9 2.0 82.7 红霉素 5.0 86.7 10.0o 88.6 86.9 2.0 87.8 替米考星 84.8 5.0 10.0 89,4 86.6 1.0 77.2 2.0 泰乐菌素 5.0 84.0 10.o 85.5 89.5 .0 2.0 82.0 克林霉素 5.0 88.8 87.0 10.0 1.0 86.8 2.0 86.6 螺旋霉素 5.o 88.4 10.o 86.8 3.3 2.o 88.2 吉它霉素 5.0 87.4 0.0 87. 1.0 85.9 2.0 84.2 交沙霉素 5.0 86.9 10.o