工具酶纯度的检测方法

工具酶纯度的检测方法

国家标准 GB/T40174一2021 工具酶纯度的检测方法 Puritydeteetionmethodofreagentenzymes 2021-05-21发布 2021-12-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/40174一2021 前 言 本文件按照GB/T1.1一2020<标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由全国工具酶标准化工作组(SAC/SwG11)提出并归口 本文件起草单位;福建南生科技有限公司、夏禾(深圳)生物技术有限公司,苏州坤琪生物科技有限 公司、上海鹰姿生命科技有限公司、雷谷(厦门)生物医药有限公司、福建华灿制药有限公司、厦门大学、 安琪酵母股份有限公司、山东大学、北京化工大学、复旦大学、科学院微生物研究所、深圳华因康基 因科技有限公司 本文件主要起草人;黄发灿,詹学雄,郑登忠、赵晶,朱力钟江、张永有、姚鹃、陈秀兰、陈劲春、刘文军、 郭延巍
GB/40174一2021 工具酶纯度的检测方法 范围 本文件描述了工具酶纯度检测方法的术语和定义、原理,试剂或材料、仪器设备、样品制备,试验步 骤、结果计算及质量控制 本文件适用于工具酶纯度的检测 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 YY/T0087 电泳装置 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 工具酶纯度purityofreagentenzymes 目标工具酶在样品总蛋白质或固含物中所占的质量百分比 3.2 蛋白质含量contentofprotein 样品经福林酚法测定出每毫克或每毫升样品中的蛋白质所占的质量 3.3 固含物含量contentofsolidl 样品烘干后获得的无水固体物质在每毫克或每毫升样品中所占的质量 原理 用牛血清白蛋白标准品作对照,对样品经十二炕基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳后的胶带进 行扫面,再进行灰度值计算,获得样品中目标工具酶的质量,再采用福林法测定样品总蛋白质的质量 或用炽灼残渣检查法测定样品固含物含量,从而计算出工具酶纯度 试剂或材料 除非另有规定,所用的试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的二级水 5.1碱性铜溶液 称取氢氧化钠10g,碳酸钠50g,加水400mL使溶解,作为甲液;取酒石酸钾0.5g,加水50mL使
GB/T40174一2021 溶解,另取硫酸铜0.25g,加水30mL使溶解,将两液混合作为乙液 临用前,甲液、乙液按50:l体积 比)混合 5.2福林酚溶液 称取鹤酸钠100g、钼酸钠25g,加水700mL,85%磷酸50mL与盐酸100mL.,置磨口圆底烧瓶 中,缓缓加热回流10h,放冷,再加硫酸锂150g,水50mlL和澳数滴,加热煮沸15 ,冷却,加水稀释 min， 至1000ml,过滤,滤液作为贮备液,置棕色瓶中 临用前加一倍的水,摇匀,即得 5.3标准溶液的配制 准确称取牛血清白蛋白标准品适量,用合适的溶液溶解制成1mg/ml的标准溶液 5.430%丙烯酰胺溶液-0.8%N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(AcerBis)溶液 取丙烯酰胺30.0g,AcrBis0.8g,溶于水,定容到100ml 用0.45 "m微孔滤膜过滤,储于棕色 瓶,宜4C避光保存 05mlL三羚甲基氨基甲烧-盐酸(Tist)缓冲液 5.5 称取三羚甲基氨基甲烧6.05g,加适量水使溶解,用盐酸调pH值至6.8,加水定容至100mL,宜 4C保存 5.61.5mol/I的Iris-Hc缓冲液 称取三羚甲基氨基甲婉18.15g,加适量水溶解,用盐酸调pH值至8.8,加水定容至100mL,宜4C 保存 5.710%的SDs溶液 称取2.5gSDs,加适量水溶解,定容至25ml.,室温保存备用 5.810%过硫酸铵溶液 称取1.0g过硫酸铵.加适量水溶解,定容至10mL.宜现配现用 5.9样品缓冲液 称取三胫甲基氨基甲婉0.152g、澳酚蓝1mg、,SDs0.4g,甘油2mL,用盐酸调pH值至6.8,加水 溶解并稀释至10mL 该缓冲液用于非还原型sDs聚丙烯酰胺凝胶电泳 如用于还原型SDs聚丙烯 酰胺凝胶电泳,则再加8疏基乙醇1tmL 5.10电泳缓冲液 称取三胫甲基氨基甲烧3g,甘氨酸14.4g,SDs1.0g,加适量水溶解,用盐酸调pH值至8.3,加水 稀释至1000 Dml 5.11固定液 称取三氯醋酸5g,加水200mL溶解后,加甲醇200mL,再加水定容至500mL 5.12染色液 称取1.0g考马斯亮蓝R250,加人甲醇200ml,冰醋酸50ml,加水定容至250mL,混匀
GB/40174一2021 5.13脱色液 取甲醇400mL、冰醋酸100mL.,加水定容至1000mL,混匀 仪器设备 6.1紫外-可见分光光度计 6.2电泳装置,应符合YY/T0087的要求 6.3凝胶薄层扫描仪 6.4电子分析天平,分度值为0.0001g 样品制备 准确称取样品w(若样晶为液体时,准确量取),用合适的溶被溶解制成Inmx/L的样品游液.按 照附录A的方法测得样品中蛋白质含量C，, 试验步骤 8.1电泳 分别取样品8AL,标准溶液2L、4AL8L、12L、16L、20AL,加水至20AL,再加人20!L的 样品缓冲液,100C煮沸3min,按照附录B的方法进行电泳 8.2扫描 取脱色好的胶片,置凝胶薄层扫描仪中,分别对样品和牛血清白蛋白电泳胶带进行扫描 8.3标准曲线的绘制 用软件计算牛血清、白蛋白电泳胶带灰度值,以灰度值为横坐标,蛋白质含量为纵坐标,绘制标准曲 线,见公式(1): w=bH十a4 式中: W 蛋白质的质量,单位为毫克(mg); H 灰度值; 截距 斜率 结果计算 g.1样品中目标工具酶质量的计算 用软件计算样品中目标工具酶电泳胶带的灰度值代人公式(1),计算出上样样品中目标工具酶的 质量(w.) 样品中目标工具酶质量按公式(2)计算 W=W×F
GB/T40174一2021 式中 W -样品中目标工具酶的质量,单位为毫克(mg); W， 上样样品中目标工具酶的质量,单位为毫克(mg); F 稀释倍数 g.2样品总蛋白质中工具酶纯度的计算 样品总蛋白质中工具酶纯度按公式(3)计算 W 一×100% C,wI 式中 样品总蛋白质中工具酶纯度; C w -样品中目标工具酶的质量,单位为毫克(mg); W 样品质量或体积,单位为毫克(mg)或毫升(ml) C mL -样品中的蛋白质含量,单位为毫克每毫克(mg/mg)或毫克每毫升(mg/ g.3样品固含物中工具酶纯度的计算 样品固含物中工具酶的纯度按公式(4)计算 W -×100% C， w又C 式中 样品固含物中工具酶纯度; W 样品中目标工具酶的质量,单位为毫克(mg); W 样品质量或体积,单位为毫克(mg)或毫升(mL); C 样品中的固含物含量,单位为毫克每毫克(mg/mg)或毫克每毫升(mg/ml). 10质量控制 在重复性条件下,获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算数平均低 的10%
GB/40174一2021 附 录 A 规范性 福林酚法测定蛋白质含量 A.1原理 依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu赘合形成蛋白质-铜复合物,此复合物使酚试 剂的磷钼酸还原,产生蓝色化合物,同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中的酪氨酸,色氨酸、半胱氨酸 还原呈蓝色反应 在一定范围内其颜色深浅与蛋白质的浓度呈正比,以蛋白质标准溶液作标准曲线,计 算出样品中蛋白质的含量 A.2试验步骤 A.2.1牛血清白蛋白标准溶液的配制 准确称取适量的牛血清白蛋白标准品,加水溶解并制成0.2mg/ml的标准溶液 A.2.2标准曲线的绘制 准确量取标准溶液0.0mL、0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL、1.0mL,分别置于具塞试管中,加水 至1.0ml,再分别加人碱性铜溶液(5.1)1.0ml,摇匀,室温放置10min后,分别加人福林酚溶液(5.2) 4.0mL,立即混匀,室温放置30min后,在650nm的波长处测定吸光度 以标准溶液浓度与其相对应 的吸光度绘制标准曲线,回归方程见公式(A.1).: C=bX十u A.1) 式中 蛋白质含量,单位为毫克每毫升(mg/mL). 在650nm的波长处测定吸光值; 截距 斜率 A.2.3样品测定 将第7章中制备得到的样品溶液用水稀释为0.1mg/mL的试样溶液,准确量取试样溶液适量,按 A.2.2的操作进行测定 从标准曲线计算出每毫升测定样品溶液中的蛋白质含量 A.3结果计算 按照A.2.3测出样品溶液的吸光值,再将吸光值代人公式(A.1),计算出每毫升测定样品溶液中的 蛋白质含量(C) 样品中的蛋白质含量(C,),按公式(A.2)计算: C×V×F A.2 W 式中: C 样品中的蛋白质含量,单位为毫克每毫克(mg/mg)或毫克每毫升(mg/ml); 每毫升测定样品溶液中的蛋白质含量,单位为毫克每毫升(mg/mL); C -测定样品溶液的体积,单位为毫升(mL); F -稀释倍数 W 样品质量或体积,单位为毫克(mg)或毫升(mL
GB/T40174一2021 附录 B 规范性 SDs聚丙烯酰胺凝胶电泳 B.1原理 依据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂SDS按质量比结合成复合物,使蛋白质分子所带的负 电荷远超过天然蛋白质分子的净电荷,消除了蛋白质分子的电荷效应,使蛋白质按相对分子质量大小进 行分离 B.2试验步骤 B.2.1分离胶溶液的制备 根据不同相对分子质量的需要,按表B.1制成分离胶溶液,灌人模具内至一定高加水封顶,室温下 聚合 表B.1分离胶和浓缩胶配制比例 凝胶种类 分离胶 浓缩胶 凝胶浓度 5% 7.5% 10% 12.5% 5% 17.5% 5% .5molLT=HC(pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 0.5mol/LTris-Hcl 0.63 l(pH6.8 8,45 5.95 4.7 3.45 7.2 2.2 3,4 试液体积 0%SDS 0.15 0.,15 0,15 0.05 ml 0.15 0.15 0.15 10%过硫酸胺 0.15 0.15 0.15 0.15 0,15 0,15 0.05 四甲基乙二胺(TEMED 0.006 0.006 0,006 0.006 0.006 0.006 0.005 注 ”为空白 B.2.2浓缩胶溶液的制备 待分离胶溶液聚合后,用滤纸吸去上面的水层,再灌人浓缩胶溶液,配方见表B.1,插人样品梳,应 避免出现气泡 B.2.3加样 待浓缩胶溶液聚合后小心拔出样品梳,将电泳缓冲液注满电泳槽前后槽,在加样孔中加人样品溶 液,样品溶液与标准溶液均不应超过20L B.2.4电泳 将正负电极与电泳仪连接好,开始电泳 刚开始电泳时,将电压调至80V;当染料溴酚蓝进人分离 胶后,将电压调至150V200V 直到染料迁移至离分离胶底部1.5cm时,停止电泳
GB/40174一2021 B.2.5固定、染色和脱色 电泳结束后,取出胶片(条),置固定液中30min,取出胶片(条),置染色液中染色1h2h,用脱色 液脱色至凝胶背景为透明

工具酶纯度的检测方法GB/T40174-2021

背景

工具酶是一类在分子生物学和生物化学实验中广泛使用的酶类，如限制性内切酶、聚合酶、磷酸酯酶等。这些酶在实验研究中起到了至关重要的作用，因此其纯度的检测十分重要。

GB/T40174-2021标准介绍

GB/T40174-2021标准是我国针对工具酶纯度检测制定的标准，其中规定了三种检测方法：

• 比色法
• 薄层色谱法
• 高效液相色谱法

这些方法都能够准确地检测工具酶的纯度，但各有优缺点。比色法简便易行，但适用性较差；薄层色谱法分离效果好，但需要使用放射性示踪剂；高效液相色谱法则是目前最常用的检测方法之一，具有灵敏度高、分离效果好等优点。

高效液相色谱法

以下将重点介绍高效液相色谱法的流程：

1. 样品制备：将所需样品按照要求制备，注意避免污染和损失。
2. 色谱柱选择：根据待测物性质选择合适的色谱柱。
3. 流动相配置：按照实验要求配置出合适的流动相。
4. 标准曲线绘制：按照一定浓度梯度制备标准品，然后进行检测并绘制标准曲线。
5. 样品检测：将待测样品注入色谱柱中，按照标准曲线对其进行检测。

通过以上步骤可以得到准确的工具酶纯度。

工具酶纯度的检测方法的相关资料

和工具酶纯度的检测方法类似的标准