葡萄A病毒检疫鉴定方法

葡萄A病毒检疫鉴定方法

国家标准 GB/T35332一2017 葡萄A病毒检疫鉴定方法 DeteetionandidentificeationofGrapevine irrSA 2017-12-29发布 2018-07-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35332一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位:检验检疫科学研究院、福建省农业科学院、江苏出人境检验 检疫局、山东出人境检验检疫局 本标准主要起草人:张永江、谢丽雪、李彬、魏梅生、李桂芬、马洁、辛言言、张晓雷、吴兴海、朱水芳
GB/35332一2017 葡萄A病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了葡萄八病毒(Graprewnewirw、A)的检疫鉴定方法 本标准适用于可能携带葡萄A病毒的葡萄苗木、接穗、砧木、,插条等繁殖材料的检疫鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 S/T1840植物病毒免疫电镜检测方法 葡萄A病毒基本信息 学名:GrabezineirusA 缩写:GVA sociatedvirus 异名:葡萄茎痘相关病毒(Gra rapevinestempittingas 分类地位.日线形稍毒科(Balecriwrd),葡萄精毒属(iton GVA的其他信息参见附录A 方法原理 GVA的蛋白和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据 根据GVA与抗体之间的特异性反应,对植 物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAs-ELISA)和免疫电镜检测;依据GVA的基因组特征建 立RT-PCR,实时荧光RT-PCR;通过这些方法的有效组合,判断样品是否带有GVA S 仪器、用具及试剂 5.1仪器 电子天平(感量0.001g)、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超低温冰箱(一80C)、制 冰机,旋涡振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅,pH计,超净工作台、,PCR仪,微波炉电泳仪,电泳槽、凝胶 成像分析仪、酶标仪、透射电子显微镜 5.2用具 酶联板,可调移液器(2.5AL.10AL.,20AL.100AL.3200L、1o00AL)和可调移液器头、离心管,研 钵、微型磨杵等 5.3试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定 DAS-ELISA试剂
GB/T35332一2017 见附录B;RT-PCR检测试剂见附录C;实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D;免疫电镜检测试剂见 SN/T1840. 样品制备 6 将葡萄种苗种植于隔离温室中,在生长期间进行严格的症状检查 对可疑症状的植株,采基部发育 良好具症状的叶片1只单独制样,用于后续检测;无明显症状的,可5株混合采样用于后续检测 检测鉴定 7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAs-EL.IsA) 把制备的样品上清液加人已包被GVA抗体的酶联板中,进行DAS-ELISA检测 每个样品平行加 到两个孔中 健康的植物组织作为阴性对照,感染GVA的植物组织作为阳性对照,样品提取缓冲液作 为空白对照;其中阴性对照的种类和材料应尽量与检测样品相一 -致 具体操作见附录B. 7.2免疫电镜检测 免疫电镜检测方法见SN/T1840. 7.3RT-PCR检测 RTcR检测的阴性和用性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照 分别提取样晶和对照的总 RNA,反转录合成cDNA后进行PCR检测,具体操作见附录C 7.4实时荧光RT-CR检测 实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照 分别提取样品 和对照的总RNA,反转录合成eDNA后进行实时荧光PCR检测,具体操作见附录D 如采用商品化 步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行 8 结果判定 样品检测时,检测流程及结果判定按下述原则进行 采用DAs-ELISA或免疫电镜方法进行检测,若 检测结果为阳性时 RTPCR的检测结果为阳性,则判定样品携带GvA: 或用实时荧光RT-PCR进行检测,若检测结果为阳性,则判定样品携带GVA -检测结果为阴性时: RT-PCR的检测结果为阴性,则判定样品不携带GVA;检测结果为阳性,则对产物进行测序， 测定的序列为GVA序列,则判定样品携带GVA 或用实时荧光RT-PCR进行检测,若检测结果为阴性,则判定样品不携带GvA;若检测结果 为阳性,则判定样品携带GVA
GB/35332一2017 样品保存与结果记录 g.1样品保存 经检测确定携带GVA的样品应保存在适合的条件下以备复核 活体的病株在隔离温室中保存 其他的离体材料如叶片等样品可保存在一80C冰箱中;做好登记和标记工作,保存期限至少1年 9.2结果记录 记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字 DAS-ELISA检测应有酶 联反应数值;免疫电镜检测应有电镜图片;RT-PCR检测应有电泳图片;实时荧光RT-PCR检测应有荻 光曲线图
GB/T35332一2017 附 录 A 资料性附录) 葡萄A病毒相关资料 寄主范围 A.1 自然寄主仅限葡萄属植物(Viti、spp.),实验寄主包括烟草属一些植物(Nicotianaspp.),GVA也 门分离物可引起范色藜(Chenopodiwamaranticolor)和昆诺阿藜(C.quinoa)局部枯斑,并无症感染 曼陀罗(Daturastramonium),也门和意大利的分离物还可以侵染千日红(Gomphrenagloosa),引起 局部枯斑 A.2为害症状 葡萄A病毒为葡萄皱木综合症中Kober茎沟病的病原,嫁接后通常引起美洲砧木Kober5BB的茎 部产生纵向的茎沟,病毒可无症感染一些葡萄的品种和砧木 本生烟(Nicotianabenthamiana aa)摩擦接种10d~12d后,叶片出现系统明脉和畸形,植株矮缩 A.3分布地区 阿尔巴尼亚、塞浦路斯、,捷克法国,德国、希腊、意大利,马耳他、葡萄牙,塞尔维亚、斯洛伐克、斯洛 文尼亚、瑞士、乌克兰、阿富汗,亚美尼亚、,伊朗,.以色列、约旦、黎巴嫩、土耳其,也门、叙利亚、、阿尔 及利亚、埃及、摩洛哥、南非、突尼斯、加拿大、美国、智利,巴西、澳大利亚、新西兰 A.4传播方式 嫁接传播 病毒易于通过嫁接的方式在葡萄间传播,是病毒传播的主要途径 Kober5BB是嫁接 用的指示植物 昆虫传播 病毒可由拟长尾粉怆(Pseudococeuslongispinus),、P.afnis,无花果粉(Planococcus icus)、橘粉(P.citri)和Neopuleuinariainumerabilis传播 其中拟长尾粉和无花果粉以半持 久方式传播GVA,蜕皮后则不能传播 A.5粒体形态 病毒粒体呈弯曲线状,大小为(725nm825nm)×12nm,粒体有明显的横纹 螺距3.3nm,每螺 旋约有10个亚基 A.6基因组 单分体基因组,全序列已经测定含有7349nt RNA的5'端有一个甲基化的帽子结构,3'端有一个 Poly(A) 基因组含有5个相互重叠的ORF,分别编码195ku复制酶,19.8ku蛋白,31ku移动蛋白. 21.6ku外壳蛋白和10.1ku的RNA结合蛋白
GB/35332?2017 ? 淶?? ???(DAS-ELISA B.1? B.1.1 ?A B.1.2?? ??A B.1.3 (pNPP) B.1.41PBST?(pH7.4) ?(NaCI 8.0g (KHPO 0.2g (Na,HPO 1.15g ?(KCIy 0.2g -20(Tween-20) 0.5ml (NaN 0.2? 900m??,1000 mL,4C档 B.1.5???(pH7.4 1.3 (NagSO g 20.0 ??(PVP,Mw24000~40000) g 900ml1PBST,1000ml,4C档 B.1.6?(pH9.6 1.59g ?(NaeCO. ?(NaHCO. 2.938 900mL??,1000mL,4C档 B.1.7?????(pH7.4) ???(sA) 2.0g ??(PVP,Mw24000?40000) 20.0g 900m1PBST?,1000mL,4C B.1.8??(pH9.8 97 ? ml
GB/T35332一2017 氯化镁(Mg(C, 0.1g 溶于800ml灭菌双蒸水,用浓盐酸(HCI)调pH至9.8,定容至1000ml,4储存 B.2 实验步骤 B.2.1 包被抗体 按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体,每孔加100"l 酶联板加盖或用保鲜膜 包好,37C孵育2h 清空孔中溶液,用1×PHBST加满各孔,3min后倒掉孔中溶液,在吸水纸上拍干 再重复2次上述洗板过程 B.2.2样品制备与加样 待测样品按1:10质量'体积)加人抽提缓冲液,在研钵中研磨;2000r/min离心10min,上清液 即为制备好的检测样品 阴性对照,阳性对照作相应处理或按说明书进行 按100pL/孔分别加人制 备好的检测样品、阴性对照和阳性对照;酶联板加盖或用保鲜膜包好,4C孵育过夜 酶联板用自来水 彻底冲洗,再用1×PBST洗涤3次,每次3min. B.2.3加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度并加人到酶联板中,100AL/孔,酶联板 加盖或用保鲜膜包好,37C孵育4h 酶联板用自来水彻底冲洗,再用1×PBST洗涤3次,每次3min B.2.4加底物 将底物pNPP加人到底物缓冲液中,使终浓度为1nmg/mL现配现用,100AL/孔加人到酶联板 中,室温避光孵育 B.2.5读数 在不同的时间内如30min,.60min、,90nmin、120min或更长时间,用酶联仪在405nm处读OD值 B.3结果判定 B.3.1质量控制要求 对照孔的OD值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)应在质量控制范围内,即:缓冲液孔和阴性 对照孔的OD值<0.15,当阴性对照孔的OD值<0.05时,按0.05计算;阳性对照oD值/阴性对 照OD值>5;同一样品的重复性基本一致 B.3.2结果判定 在满足B.3.1的质量控制要求后,结果原则上可判定如下;样品OD值/阴性对照OD值>2,判 为阳性;样品oD值/阴性对照OD值在2左右,判为可疑样品,应重新做一次,或用其他方法加以验 证;样品OD值/阴性对照OD值一2,判为阴性 若不满足B.3.1的质量控制要求,则不能进行结果判定
GB/35332一2017 附录 C 规范性附录) Rr-CR检测 C.1试剂 C.1.1核酸提取试剂 Trizol或合格的RNA提取试剂盒 C.1.2电泳缓冲液TAE(50× 三胫甲基氨基甲婉(Tris) 242g 57.1m 冰乙酸(CH,O 乙二胺四乙酸二钠(NagEDTA2H.O) 37.2g 灭菌双燕水定容至1000mL,用时稀释至1×TAE. C.2检测步骤 C.2.1核酸提取 称取0.1g样品加液氮研磨成粉末状,迅速将其移人灭菌的1.5mL离心管中,加人1mL的Trizol 试剂,剧烈振荡3min;4C12000r/min离心l0min;将上清液移人一新离心管中,加人0.5mL三氯 甲炕,猛烈振荡15s;4C12000r/nmin离心15nmin;小心吸取上层无色水相到新离心管中;加人等体积 异丙醉,混匀;室温静置10min;4C12000r/min离心10min,弃上清液;加人1mL75%的冷乙醇洗 涤沉淀;4C10000r/min离心10min,弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后溶于30ALDEPC-HO中 -20C保存备用 注此处以0.1g样品为例进行核酸提取,实际检测时如样品量有变化,加人的试剂可按比例调整;或者按照商品化 RNA提取试剂盒进行操作 C.2.2引物序列 正向引物GVA-196f:5'-cCAGAGGAGTTTGAGACAATA-3 反向引物GVA-196r:5'-GTcccGAcCAAGGcGATGTAccC3' 扩增片段长度;196bp c.2.3反转录 反应体系;20AL;在0.2mLPCR管中加人总RNA1L,dNTPs(10mmol/L)1L,DEPCH.o 10AL,反向引物GVA-196r(20mol/几L)2AL,70C保温5min;冰上放置5min;再加人5×反转录缓冲 液4L,RNasin(40U/L)1AL,MMIV(200U/L)1AL,42保温1h,得到eDNA后用作PCR的 模板 设置阳性对照、阴性对照及空白对照 C.2.4CR扩增 mmol/L 反应体系;20AL;在0.2mlPCR管中加人10×PCR缓冲液(含Mg+)2AL,dNTPs(101
GB/T35332一2017 0.6L,正向引物GVA-196f及反向引物GVA-196r(均为20mol/L)各0.5AL,Taq酶(2U/L) lAL,模板2AL和DEPC-H,O13.4AL 设置阳性对照、阴性对照及空白对照 反应程序;94C5min;94C40. s,56"C45s,72"C1min 1,35个循环;72C7min. 注:如采用商品化一步法RT-PCR检测试剂盒,可按照说明书进行操作,将步骤C.2.3和C.2.4合并进行 C.2.5CR产物琼脂糖凝胶电泳 制备1.5%的琼脂糖凝胶,按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物,用DNAMarker作为分 子量标记,进行电泳 电泳结束后在凝胶成像仪中观察是否扩增出预期的特异性DNA条带,并拍摄 记录 c3结果判定 阳性对照在196bp左右处有条带,阴性对照和空白对照无特异性条带,待测样品出现与阳性对照 -致的条带,测定序列比对为GVA的,判定为阳性 阳性对照在196p左右处有条带,阴性对照、空白对照及待测样品无特异性条带,判定结果为 阴性
GB/35332一2017 录 附 D 规范性附录 实时荧光RT-PCR检测 D.1试剂 核酸提取试剂同C.1.1 TaqManOme-stepRT-PCRMixture D.2引物探针 上游引物GVA-F;5'-AcGAccGAAATATGTACCTGAATACTcTcC-3 下游引物GVA-R:5'-TCTACCTCTcCATAATGAACcGcCT-3" 探针GVA-Probe:5'-FAM-GGGTACATcGCcTTGGTcGG-TAMRA-3' D.3核酸提取 方法同C.2.1 D4实时荧光RT-PCR反应 反应体系:0.2mL离心管中加人2×On e-stepRT-PCR缓冲液10"L,ErTaqHs(5U/!L 0.4L.PrimesSseriptRTEngymeMixl0.4AL.GVAF(10mol/L)0.4AL.GVAR(10mol/L 0.4AL,GVA-Probe(10mol/L)0,.6ML,ROXReferenceDye0,4AL,模板RNA2AL,补DEPC H.0至20L 设置阳性对照、阴性对照及空白对照 反应程序;45C10min,95C10min;9515s,601min,共45个循环 D.5结果判定 在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值<30并出现典型扩增曲线的条 件下 待测样品的C值>40时,判定GV八阴性 待测样品的cC'值<35时,判定GVA阳性 待测样品的Ct值小于40而大于35时,应重新进行测试;如果重新测试的Ct值>40,判定 GVA阴性;如果重新测试的C值小于40而大于35,且分离曲线明显时,则判定结果为阳性

葡萄A病毒检疫鉴定方法GB/T35332-2017详解

葡萄A病毒是一种常见的葡萄病毒病害，能够严重影响葡萄的产量和品质。为了保障葡萄生产的健康可持续发展，国家颁布了《葡萄A病毒检疫鉴定方法GB/T35332-2017》标准，规定了该病毒的检测方法和评价标准。

该标准主要包括：样品采集、处理、分离纯化、鉴定等步骤。其中，样品采集应在植株生长活跃期进行，采用无菌工具采取叶片、枝条、果实等部位的组织；样品处理则要求将采集的植物材料进行分离，去除无关组织后制备成适宜的悬浮液。

在分离纯化步骤中，GB/T35332-2017标准要求使用石英砂或滑石粉法来提取葡萄A病毒的核酸。而鉴定步骤则要求通过PCR扩增和基因测序等手段，对该病原病毒进行鉴定。

检测时需要配合一些实验室设备和试剂，如PCR仪、RNA提取试剂盒、引物和Taq酶等。此外，在检测过程中也需要严格遵守操作规范和安全防护措施，以确保检测结果的准确性和人员的安全健康。

总之，《葡萄A病毒检疫鉴定方法GB/T35332-2017》标准的实施，是为了更好地保护葡萄生产，预防病害扩散，促进葡萄产业的可持续发展。

葡萄A病毒检疫鉴定方法的相关资料

和葡萄A病毒检疫鉴定方法类似的标准

GB/T35332-2017

葡萄A病毒检疫鉴定方法

2022/8/24 3:20:32 现行