犬瘟热诊断技术

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国家标准 GB/T27532一2011 犬瘟热诊断技术 Diagnostictechniquesforcaninedistemper 2011-11-21发布 2012-03-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27532一2011 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口 本标准起草单位:青岛农业大学动物科技学院、上海出人境检验检疫局、中华人民 共和国山东出人境检验检疫局 本标准主要起草人:单虎、黄娟、熊炜、温建新、秦晓冰,朱来华宫文妮、袁小远、孙园园、马晶
GB/T27532一2011 犬瘟热诊断技术 范围 本标准规定了犬瘟热的临床诊断,犬瘟热病毒的病原分离免疫酶检测、免疫组织化学检测,RT PCR检测的操作方法 本标准适用于犬瘟热的鉴定及其流行病学调查,诊断和监测 其中病毒分离免疫酶检测,免疫组 织化学检测,RT-PCR检测适用于犬瘟热的病原诊断 试剂和材料 2.1改良最低要素营养液(DMEM)培养基;配方参见附录A 2.2非洲绿猴肾细胞(Vero细胞 2.3磷酸盐缓冲液(PEBs)配制参见附录A 青霉素,链霉素;配方参见附录A 24 2.5cDV阳性血清中和抗体效价11024 2.6 CDV阴性血清;无CDV感染的犬血清 27 酶结合物;HRP标记的葡萄球菌A蛋白(SPA. 2.8底物溶液;配制参见附录A 2.9过氧化氢甲醉游液;配制参见附录A 10盐酸酒精溶液配制参见附录A 2 " 胰蛋白酶溶液:配制参见附录A 212 Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液;Taq酶浓度为5U/pl，一20保存 n3 逆转录酶及10倍逆转录酶反应缓冲液;逆转录酶浓度为50U/L一20C保存 22 1 RRNA酶抑制剂(40U/L):一20保存 22 dNTP含dATP,d(G;TP,dcTP,dTTP各10mmol/L,-20C保存 .15 2. 16引物浓度为20ma/L,其序列如下 2. 上游引物(cDvF):5'cGAGTcTTTGAGATAGGGTT3'; 下游引物(CDVR):5'cCTccAAAGGGTTccCATGA3' 2.17随机引物;含有9个碱基的随机序列引物,浓度为504mol/L一20它保存 2.18DErPC水;自配(参见附录A),或购买商品化DEPC水 9 22 Trizol试剂:4C保存 2.20异丙醇使用前颜冷至一20七. 2.2175%乙醇;用新开启的无水乙醇和DEPC水配制,使用前预冷至一20C 2.221.5mL无RNA酶的Eppendorf管 2. .23 0. .2ml无RNA酶的PCR薄壁管 器材和设备 3.1细胞培养瓶(中号瓶) 2 3 二氧化碳培养箱 33 3 恒温水浴箱(5C100C). 3.4普通光学显微镜
GB/T27532一2011 3.5 .45m微孔滤膜 0. 3.6离心机 3.7PCR扩增仪 3.8水平电泳仪 3.940个小孔的室玻片 3.10冷冻切片机 3.11高速台式冷冻离心机;可控温至4C,离心速度可达12000以上 .12凝胶成像系统 3. 临床检查 4.1临床症状 4.1.1病犬体温升高至40以上,鼻流清涕至脓性鼻汁,脓性眼屎,有咳嗽,呼吸急促等肺炎症状 4.1.2腹下可见米粒大丘疹 1.了构后期cDv侵害大脑时则出现神经症状,头、预,四肢抽插 4.2病理变化 4.2.1新生幼犬感染CDV表现胸腺萎缩;成年犬多表现结膜炎、鼻炎、气管支气管炎和卡他性肠炎 42.2表现神经症状的犬可见鼻和脚垫的皮肤角化病 42.3中枢神经系统的病变包括脑膜充血,脑室扩张和因脑水肿所致的脑脊液增加 4.2.4犬瘟热病毒的包涵体呈嗜酸性,位于胞浆内,直径14m5Am,可在黏膜上皮细胞、网状细胞 白细胞,神经胶质细胞和神经元中发现,核内包涵体多位于被覆上皮细胞、腺上皮细胞和神经节细胞 4.3判定 若临床症状符合4.1.1或4.1.3且出现4.2.4的病理变化,则可判定疑似犬癌热,其他临床症状和 病理变化可作为参考指标;疑似病例可采用病毒分离、免疫酶检测,免疫组织化学检测和RT-PCR检测 等方法确诊 病毒分离 5.1样品采集和处理 5 1.1活犬可采集泪液,鼻液,唾液,粪便,病死犬可采集肝、脾,肺等组织器官 5.1.2上述样品用无血清DMEM制成20%组织悬液,10000r/min离心20min,取上清液,经 0.45um微孔滤膜过滤,滤液用于CDV分离 5.2操作方法 细胞培养 5.2.1 用含8%新生牛血清的MEM培养基在绸胞培养瓶(中号瓶)培养Ve细胞,置7c二氧化碳培 养箱,单层细胞长至80%90%时,接种样品上清 5.2.2病料接种 取0.1ml处理好的样品上清接种Vero细胞,置37C二氧化碳培养箱吸附1h,加人无血清 DMEM继续培养5d一7d,观察结果 5.3结果判定 若接种未出现细胞病变,应将细胞培养物冻融后盲传三代,如仍无细胞病变,则判为CDV病原分 若Vero细胞培养4d一5d出现细胞病变(如细胞变圆,胞浆内颗粒变性和空泡形成,随后形 离阴性 成合胞体,并在胞浆中出现包涵体),可用免疫酶检测免疫组织化学检测和RT-PCR三种方法之一进 行确诊
GB/T27532一2011 6 免疫酶检测 6.1操作方法 6.1.1将CDV标准株和待鉴定的样品分别接种Vero细胞,接种后5d一7d,病变达50%一75%时 用胰蛋白酶消化分散感染细胞,PBS液洗涤3次后,稀释至1×10个/ml细胞 取有40个小孔的室 玻片,每孔滴加10L 室温自然干燥后,冷丙酮(4C)固定10min 密封包装,置一20C备用 6. 1. 取出室玻片,室温干燥后,每份10倍稀释的CDV阳性血清和阴性血清,每份血清滴加到两个病 毒细胞孔和一个正常细胞孔,置湿盒内,置恒温水浴箱37C孵育30min. PBs漂洗3次,每次5nmin,室温干燥 6.1.4滴加1:100稀释的酶结合物,置湿盒内,用恒温水浴箱37C孵育30min .1.5PBS漂洗3次,每次5min 6. 6. .1.6将室玻片放人底物溶液中,室温下显色5nin10min PBS漂洗2次,再用蒸憎水漂洗1次 吹干后,在普通光学显微镜下观察,判定结果 6.2结果判定 6.2.1若CDV阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均无色，且CDV阳性血清与正常细胞反应 无色,与CDV标准毒株感染细胞反应呈棕黄色或棕褐色,则判定阴、阳性对照成立 6.2.2在符合6.2.1的条件下,待鉴定病毒感染细胞与CDV阳性血清和阴性血清反应均呈无色,判为 CDV阴性,相应动物犬瘟热感染阴性 6.2.3在符合6.2.1的条件下,待鉴定病毒感染细胞与阴性血清反应呈无色,而与CDV阳性血清反应 呈棕黄色或棕褐色,判为CDV阳性,相应动物犬瘟热感染阳性 免疫组织化学检测 样品处理 对疑似CD的病死犬或扑杀犬,立即采集肺、脾、胸腺、淋巴结和脑等组织,置冰瓶内立即送检 不 能立即送检者,将组织块切成1cem×1cm左右大小,置体积分数为10%的福尔马林溶液中固定,保存， 送检 7.2操作方法 7.2.1新鲜组织按常规方法制备冰冻切片 冰冻切片机切片风干后用丙酮固定10min一15min,新 鲜组织或固定组织按常规方法制备石蜡切片(切片应用白胶或铬砚明胶做粘合剂,以防脱 7.2.2去内源酶:用过氧化氢甲醇溶液或盐酸酒精溶液37C作用20min. 7.2.3胰蛋白酶消化;室温下,用胰蛋白酶溶液消化处理2min,以便充分暴露抗原 7.2.4漂洗;PBs漂洗了次,每次了min 7.2.5封闭;滴加体积分数为5%的新生牛血清或1:10稀释的正常马血清,37C湿盒中孵育 30min 7.2.6加10倍稀释的CDV阳性血清或阴性血清,37C湿盒中孵育1h或37C湿盒中孵育30nmin后 4C过夜 7.2.7漂洗;PBS漂洗3次,每次5min 7.2.8加1:100稀释的酶结合物,37C湿盒孵育1h 7.2.9漂洗;PBS漂洗3次,每次5min 底物显色;新鲜配制的底物溶液显色5min~10min后漂洗 7.2.10 从90%乙酵开始脱水,透明,封片、普通光学显微镜观察 7.2.11 7.2.12试验同时设阳性、阴性血清对照
GB/T27532一2011 7.3结果判定 7.3.1被检组织与阴性血清作用后应无着染,若出现黄色或棕褐色着染,判定阴性对照不成立,应重复 实验 7.3.2在符合7.3.1的条件下,被检组织与CDV阳性血清作用后本底清晰,细胞浆内呈现黄色或棕褐 色着染,判为CDV阳性,相应动物犬瘟热感染阳性 RT-PCR检测 病料的采集及处理 采集的样品包括犬的泪液、鼻液、唾液,粪便及病死犬的肝,脾,肺等组织器官 将待检组织或粪便 样品加等体积生理盐水研磨匀浆.300og离心15min,收集上清液待检 口腔拭子,粪拭子用少量生理 盐水浸润后,取上清液待检 经细胞病原分离培养的样品,收集细胞沉淀待检 CDV阳性对照样品和 阴性对照样品的同样处理 8.2RNA抽提 分别取100L待检样品.CDV阳性样品和阴性样品的上清液各装人1.5mL无RNA酶的Eppenr do管,加人1nml.Tial试剂,用枪头充分吹打20次一30次;l30o离心15mm;取上层水相,加 00L异丙醉,颠倒数次混匀,一20C放置20min;1300og离心10mimn;弃上清,沉淀用1mlDEPc 水配制的75%乙醉清洗;80o离心1o" min;弃上清,沉淀室温干燥10min;加20MlDEPC水溶解 RNA沉淀 RNA溶液在2h内进行逆转录合成cDNA模板 另外,RNA抽提也可采用市售的商品化 RNA抽提试剂盒进行 8.3eDNA模板制备 取17LRNA溶液,加10倍逆转录酶浓缩缓冲液2.5L,dNTP1.5L,随机引物2ALRNA酶 抑制剂1l,逆转录酶1aL,室温放置10min后,置CR仪上经42、60min.70、,10min rCR检测 8 在0.2mLPCR薄壁管中,按每个样品10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5L、dNTP0.5L、Taq酶 0.5L.cDNA模板2pl、上游引物和下游引物(cDvF.cDvR)各0.5pl、三蒸水18.5l配制CR 检测体系 将PCR管置PCR仪上按如下程序扩增;首先94C变性2min;再9！C,30s,55C,30s, 72C、40s进行35个循环;最后72C,3min 用TBE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖平板含 0.54g/mlEB,参见附录A中A.11,将平板放人水平电泳仪,使电泳缓冲液刚好没过胶面,将10l PCR产物和2al加样缓冲液(6×)混匀后加人样品孔 在电泳时设立DNA标准分子量作对照 5V/cm电泳约30min,当澳酚蓝到达底部时停止,用凝胶成像系统观察结果 8.5结果判定 8 .5.1经RT-PCR检测,CDV阳性对照样品可扩增出大小为455bp的核酸片段,且阴性对照样品无 扩增条带,否则试验结果视为无效 8.5.2在符合8.5.1的条件下,若待检样品扩增出了大小为455bp的核酸片段,则初步判定犬瘟热病 毒核酸阳性;若待检样品无扩增条带或扩增条带大小不为455bp,则判定犬瘟热病毒核酸阴性 .5.3待检样品扩增出的阳性基因片段应进行核酸序列测定,若其序列与提供的比对序列的同源性 8 >90%,则可确诊为犬癌热病毒核酸阳性,否则判定犬瘟热病毒核酸阴性 8.5.4若犬瘟热病毒核酸阳性且病原分离也呈阳性,则可判定犬瘟热病毒感染阳性
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GB/27532一2011 A.8DEPC溶液(0.1% DEPC 1mL 蒸馏水 加至1000ml 磁力搅拌至溶解,高压灭菌121C,30min后4C冰箱保存备用 A.g生理盐水 称取9g无水氯化钠溶于1000mL去离子水中配成0.9%生理盐水,121.3笔灭菌151 min A.105×TBE电泳缓冲液 ,研酸27.5 每升三蒸水中加人三胫甲基氨基甲烧(Tris)54.0g,乙二胺四乙酸(EDTA)2.9" mg g" 用5mol/的盐酸调pH值至8.0. A.11EB核酸染色剂 在10ml 三燕水中加人i00mx澳化乙锭(EB)配制成10mg/iml的浓缩液 A.12加样缓冲液(6x) 每100ml三蒸水中加人澳盼蓝0.25【和蔗糖40g
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犬瘟热诊断技术GB/T27532-2011

犬瘟热是一种由犬瘟病毒引起的高度传染性疾病，对犬类健康造成严重威胁。为了及时、准确地诊断犬瘟热，需要使用高灵敏度、高特异性的检测技术。目前，GB/T27532-2011标准已经被广泛应用于犬瘟热的诊断。

GB/T27532-2011标准规定了一系列针对犬瘟热的检测方法和诊断标准，包括病毒检测、抗体检测和病理学检测等方面。其中，最常用的是病毒检测和抗体检测。

病毒检测是通过检测样本中的犬瘟病毒RNA或蛋白质来确定是否感染该病毒。常用的方法包括PCR、RT-PCR和ELISA等。这些技术具有高度灵敏性和特异性，能够快速准确地检测出病原体存在。

抗体检测则是通过检测血清中的犬瘟病毒抗体水平来确定免疫状态。常用的方法包括血清学试验和免疫层析法等。这些方法不仅可以诊断感染情况，还可以指导疫苗接种策略。

除了病毒检测和抗体检测，GB/T27532-2011标准还规定了病理学检测方法。这种方法通过对死亡动物进行组织学检查，确定是否为犬瘟热所致的病变，从而诊断犬瘟热。

总之，GB/T27532-2011标准规范了犬瘟热的检测方法和诊断标准，为该疾病的早期诊断和治疗提供了重要的支持。通过采用这些技术，可以更好地控制疾病的传播，保护犬类的健康和生命安全。

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2022/10/29 15:07:20 现行