牛肌肉中氟胺烟酸残留量的测定液相色谱-紫外检测法

牛肌肉中氟胺烟酸残留量的测定液相色谱-紫外检测法

国家标准 GB/T20750一2006 牛肌肉中氟胺烟酸残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 Determinationofflunmixinmeglumineresidue iinbovinemuscletissue LC-UVmethod 2007-03-01实施 2006-12-31发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20750一2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由秦皇岛出人境检验检疫局提出 本标准由质量监督检验检疫总局归口 本标准起草单位:秦皇岛出人境检验检疫局、辽宁出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:庞国芳、李军、宋文斌、董振霖、李一尘、薛大方、于一茫 本标准系首次发布的国家标准
GB/T20750一2006 牛肌肉中氟胺烟酸残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 范围 本标准规定了牛肌肉中氟胺烟酸残留量的液相色谱-紫外检测法 本标准适用于牛肌肉中氟胺烟酸残留量的测定 本标准的方法检出限为:0.005mg/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注明日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测定方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 (GB/T6379.1一2004,Iso5725-l:1994,IDT) GB/T6379.2测定方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,IsO5725-2;1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T66821992,neqISO3696;1987) 原理 样品中氟胶烟酸采用葡萄糖苷酸酶降解,然后用乙睛提取,浓缩,磷酸盐缓冲溶液溶解,sPECI8 净化和富集,利用适当的洗脱溶剂对固相萃取柱上富集的组分进行选择性淋洗,通过高效液相色谐的紫 外检测器进行分析测定,外标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所有试剂均为分析纯 水为GB/T6682规定的一级水 甲酸 4.2冰乙酸 4.3已葡萄糖苷酸酶(glucuronidase)15000U/mL例如;肚葡萄糖苷酸酶(600.000U/g),准确称取 1尼 0.0500g葡萄糖苷酸酶于5ml玻璃试管中,加2ml的磷酸盐(PBS)缓冲溶液溶解,用0.45m 龙滤膜过滤 使用前现配制 4.4葡萄糖 4.5浓盐酸 4.6流动相A;乙酸铵0.05mol/L,pH5.0;准确称取3.90g乙酸铵于1000ml的烧杯中,加900ml 1滤膜 水溶解并用甲酸调整至pH5.0,转移至1000mL容量瓶中,使用前过0.45Am 4.7流动相B甲醇,色谱纯 4.8流动相C:乙睛,色谱纯 4.9混合流动相将40mL流动相B,30mL流动相C以及30ml流动相A相混合 4.10磷酸盐(PBS)缓冲溶液;称取0.8g氯化钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,0.115g磷酸氢 二钠和o.02【葡萄糖于250mL烧杯中加约90mL的水溶解,用0.1mol儿磷酸调整pH6.0,转移至
GB/T20750一2006 00mL容量瓶中并稀释至刻度 4.1185%磷酸 4.12乙酸钾溶液:0.04mol/L 称取1.95g乙酸钾于500ml容量瓶中,加约450ml.水溶解并稀释 至刻度 13氯化钾 4 4.14磷酸二氢钾 44 15磷酸二氢钾缓冲溶液:0.25mol/L,pH7.0 称取17.01g磷酸二氢钾溶于400ml水中,定容到 00ml.,然后用0.25mol/儿磷酸氢二钠调节pH至7.0(约500ml),定容到1 4.16氯化钠 T7无水磷脆氢二的 4.18磷酸氢二钠溶液;0.25mol/L 称17.75g磷酸氢二钠溶于400mL.水中,定容到500ml 4.19乙酸正己烧溶液:乙酸十正己烧(10十90) 4.20正己烧:色谱纯 4.21标准物质;氟胺炯酸,纯度>99% 4.22标准储备液;50g/ml 称取适量的氟胶烟酸标准物质,用甲醉配成504g/'mL的标准储备液 2C4C保存,有效期为3个月 注:称取标准物的质量是按纯度修正过的质量 4.23标准工作溶液;24g/ml 吸取适量的氟胺烟酸的标准储备液(4.22),用甲醉配制成2ug/ml 的混合标准工作溶液,2C一4C保存,有效期为1个月 4.24标准基质溶液;根据氟胺烟酸的灵敏度和仪器线性范围,用空白样品提取液配制成不同浓度 ug/mL)标准基质溶液 仪器 5.1液相色谱仪;配有紫外检测器 5.2电子天平;感量为0.01【和0.0001g 5.3离心机;最大转速为10000r/min 5.4离心管;50m聚丙烯离心管 5.5均质机 5. 6 振荡器 5.7微量移液器,10l一100L和1000L~5000L S 氨气浓缩仪 5. 酸度计;测量精度为士0.02. 5. .10样品过滤器;PTFE,0.45m 5 .11固相萃取柱;BondElutCertifyI,3nmL .,200mg或相当者 5 .12真空固相萃取装置 13 旋转蒸发仪 5 试样的制备与保存 试样的制备 6 去掉牛肌肉中的骨头和皮,将其搅拌均匀 分出0.5kg作为试样,将制备好的试样密封,并贴上 标签 6. 试样的保存 将试样置于一18C条件下贮存
GB/T20750一2006 分析步骤 7.1提取 称取2.0g试样,于50ml聚丙烯离心管中,加人乙酸钾溶液(4.12)5mL,高速旋涡混合10s 混 合后向样品中加人30L乙酸,调节样品pH至4.5,旋涡混合 再加人70A新配制的-葡萄糖苷酸 酶溶液(4.3)混合,于振荡器37C条件下低速振荡16h 分别向样品中加人5mL乙睛,旋涡混合5s， 离心10min(3200r/min) 转移上清液至50ml离心管中 在原液中加人5ml乙睛和1mL乙酸钾 溶液(4.12)旋涡混合,离心,将上清液转移至50mL离心管中,合并上清液,待净化 7.2净化 在混合的上清液中加人5mL正已烧和50L浓盐酸,旋涡混合15s,离心5min(3200r/min) 弃去正己烧层,重复上述步骤一次 55C条件下氮吹使其体积小于5mL 加人磷酸二氢钾缓冲溶液 4.15)7mL,旋涡混合,超声20s,5C条件下离心15min(3200r/min) 采用固相萃取柱(5.11),用 3m甲醇和3nmL水活化柱.将样品过柱,弃去过柱液,然后用3mL水和6mL甲醇洗柱,弃去过柱 液 加大真空度抽滤10min 用2ml正己炕淋洗柱子两次并弃去淋洗液 用2ml乙酸正己烧溶液 4.19)洗提柱子两次,用15mL离心管收集洗脱液 在55C条件下将洗脱液氮吹至干 随后.在每个 样品中加人混合流动相(4.9)1mL,旋涡混合5s,超声5s 样液用0.454m的滤膜过滤到进样瓶中 待测 7.3测定 7.3.1液相色谱测定条件 色谱柱;Inertsil.ODs3.250mm×4.6mm.5am或相当者; a b)流速;0.4mL/min; 检测波长:285nm c 柱温:35C; d 进样量:20L 运行时间;20nmin 延迟时间:10min g 7.3.2液相色谱测定 用氟胺烟酸的标准基质溶液(4.24)分别进样,以峰面积和工作标准溶液浓度绘制标准工作曲线,样 品溶液中氟胺烟酸的响应值应在仪器测定的线性范围内 在上述色谱条件下,氟胺烟酸保留时间约为 13.0nmin,标准物质色谱图参见图A.1 氟胺烟酸的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见表B.1 7.4平行试验 按照上述步骤,对同一试样进行平行试验 7.5回收率试验 空白样品中添加标准溶液按7.1和7.2操作,测定后计算样品添加的回收率 结果计算 按式(1)计算试样中氟胺烟酸的残留量 x=cxxI0 n 式中 试样中被测组分残留量,单位为毫克每千克(mg/kg) -从标准曲线上得到被测组分溶液的浓度,单位为微克每毫升(4g/mL) 样品溶液定容体积,单位为毫升(mL);
GB/T20750一2006 样品溶液所代表试样的质量,单位为克(g) m 注:计算结果需将空白值扣除 精密度 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,其重复性和再现性的 值以95%的可信度来计算 9.1重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,牛肌肉中氟胺烟酸含量 范围及重复性限方程为;0.01mg/kg一0.20mg/kg和lgr=0.8361lg-0.8509 如果差值超过重复性r,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9.2再现性 在线性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,牛肌肉中氟胺烟酸含量范 围及再现性方程为:0.01g/kg一0.20mg/kg和R=0.1987m+0.0046
GB/T20750一2006 附 录 A 资料性附录 标准物质色谱图 氟胺烟酸色谱图,见图A.1 nmAU 12.957 笨胺烟股 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 /minm 图A.1 氟胺烟酸色谱图 附录 B 资料性附录》 回 收率 氟胺烟酸添加浓度及其平均回收率的试验数据,见表B.1 表B.1氟胺烟酸添加浓度及其平均回收率的试验数据 兽药名称 添加浓度/mg/kg 平均回收率/(% 0.010 81.4 0.025 85.3 氟胺烟酸 0,100 82.5 0.200 91.0o