GB/T36875-2018
猪瘟病毒RT-nPCR检测方法
MethodofRT-nPCRfordetectionofclassicalswinefevervirus
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2019-04-01
- 文件格式PDF
- 文本页数10页
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猪瘟病毒RT-nPCR检测方法
国家标准 GB/T36875一2018 猪瘟病毒RI-nPCR检测方法 MethodofT-nPCRforleteetionofelassiealswinefevervirus 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36875一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由农业农村部提出
本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口
本标准起草单位:军事医学科学院军事兽医研究所、兽医药品监察所 本标准主要起草人:郭焕成、王琴,徐璐、冯烨、张乾义、赵启祖,邹兴启,朱元源,涂长春
GB/36875一2018 猪瘟病毒RT-nPCR检测方法 范围 本标准规定了猪瘟病毒特异的反转录-套式聚合酶链反应(RT-nPCR)方法的技术要求
本标准适用于可能感染猪瘟病毒的猪脏器,血液、粪便和细胞培养物中猪瘟病毒核酸的检测,可用 于猪瘟的诊断和监测
本标准的猪瘟病毒RT-nPCR方法不能区分感染的猪瘟病毒野毒株和免疫的疫苗株
缩略语 下列缩略语适用于本文件
DEPC;焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate EDTA-2Na;乙二胺四乙酸二钠(ethylenediaminetetraaceticaceddisodiumsalt) RNA;核糖核酸(ribonucleicacid) RT-nPCR:反转录-套式聚合酶链反应(reversetranseriptionandnestedpolymerasechainreac ion 实验前准备 3.1实验室条件 3.1.1实验室分区 PCR实验室分区包括核酸提取区、PCR反应体系配制区配液区、扩增区,电泳区
流程顺序为 核酸提取区-配液区-扩增区-电泳区
各区仪器和耗材专用
3.1.2实验室应配备的仪器及器材 3.1.2.1仪器:I级生物安全柜、台式高速冷冻离心机、普通冰箱(一20C和4C),分析天平、PCR扩增 仪、电泳仪,电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、组织研磨器、扁桃体采样器、微波炉、单道可调移 液器(2L、10L、200lL、1000AL)
3.1.2.2器材;无菌注射器、眼科剪,眼科锻、称量纸、棉拭子,灭菌牙签,500mL量筒、,500mL锥形瓶、 -次性无RNA酶吸头(10L200AL、1000aL)、1.5mL无RNA酶离心管,0.2mL薄壁PCR管
3.2化学药品及试剂 3.2.1总RNA提取试剂Trizol
3.2.2TAE电泳缓冲液的制备,配制方法见附录A
3.2.31%琼脂糖凝胶,配制方法见附录A 3.2.4其他试剂:200U/ALM-MILV反转录酶,5×M-MLV缓冲液,40U/LRNA酶抑制剂,DEPC H.O,5U/aLExTaqDNA聚合酶,10×ExTaq缓冲液(Mg+Plus),6碱基随机引物(50Amol/L). 6×上样缓冲液,dNTPs(2.5mmol/L/dNTP),异丙醇,三氧甲烧,75%乙醇,ddH.0,嗅化乙替代染
GB/T36875一2018 料,DL.2000DNAMarker,阴性对照(DEPC-H,O),阳性对照(猪瘟兔化弱毒疫苗、灭活的猪瘟病毒或已 知的阳性样品. 3.2.5引物序列及配制方法,参见附录B 方法 4.1样品的采集、保存和运送 4.1.1采样注意事项 采样及样品前处理过程中应戴一次性手套,样品间不得交叉污染
4.1.2采样工具 扁桃体采样器;鼻捻子、开口器和采样枪
使用前均应用3%氢氧化钠溶液浸泡消毒5min 10min，经清水冲洗;牙签经121C高压灭菌15min;剪、锻经160C干烤2h
4.1.3采样及样品处理方法 4.1.3.1 扁桃体样品 用鼻捻子固定活猪的上骥,用开口器打开口腔,用采样枪采取扁桃体样品,用灭菌牙签挑至1.5ml. 离心管并做标记,编号,置于样品冷藏箱送至实验室
在实验室生物安全柜中取出待检样品置于组织研磨器,加人5倍体积4C预冷的DEPCH.O,充 分研磨,4C、3000×离心15min. 上清液转人离心管中编号备用
,取 4.1.3.2组织样品 采取病死猪或安乐死的猪组织和脏器(淋巴结、脾脏、肾脏肝脏和回肠等)装人一次性塑料袋或其 他灭菌容器,编号,置于样品冷藏箱送至实验室
在实验室生物安全柜中取50mg -10x待检组织样品置于组织研岩器,加人了倍体积4C预冷 的DEPc-H.O,充分研磨,4C.3000×区离心15min,取上清液转人离心管中编号备用
4.1.3.3全血样品 用无菌注射器采集全血,注人含1/10体积4%EDTA溶液的无菌容器中,充分混匀后编号备用
4.1.3.4粪便样品 用棉拭子挑取少许新鲜粪便样品于离心管中,加人1mL生理盐水,震荡混匀,4C、3000×从离心 15nmin,取上清液转人离心管中编号备用
其余液体排泄物离心后直接转人离心管编号备用
4.1.3.5细胞培养物 细胞培养物反复冻融3次,转人离心管中编号备用
4.1.3.6存放与运送 采集或处理的样品在2t一8C条件下保存应不超过24h;若需长期保存,应放置于一0c冰箱 且应避免反复冻融冻融不超过3次)
采集的样品放人样品管中密封后,采用保温容器加冰袋或干冰
在24h内运送到实验室
GB/36875一2018 4.2核酸提取 4.2.1提取样品总RNA,可采用本标准中的Trizol法,也可采用其他等效试剂盒,按照试剂盒说明书 进行
4.2.2以猪癌兔化弱毒疫苗,灭活的猪瘟病毒或已知的阳性样品作为阳性对照,以DEPCHl.O为阴性 对照
4.2.3按以下Trizol法进行样品总RNA提取 取待检样品、阳性对照和阴性对照各250"L置于1.5mL离心管,每管加人750ALTrizol. a 份样品换一个吸头,充分混匀,静置101 m1n; b 每个样品管中加200L三氯甲婉,混匀器上振荡混匀5s(不能过于强烈,以免产生乳化层,也 可以用手颠倒混匀),于4C,13000×区离心15min; 用移液器转移离心后的上清液400!L(注意不要吸出中间层)至新1.5ml无RNA酶离心管 中,加等体积的异丙醉4预冷),顺倒混匀一aC静置20mmr 于4c、13000×只离心15min,小心倒去上清液,加人700aLDEPC-H.o配制的75%乙醇， 颠倒洗涤 C.8000×区离心6min,小心倒去上清液,沉淀,室温干燥10min一15mmnr 于4 e 加人20LDEPC-HH,O,轻轻混勾匀,溶解管壁上的RNA沉淀,冰上保存备用
提取的RNA应 f 在2h内进行RT扩增,若需长期保存应放至一80C冰箱
43反转录 以随机引物为反转录引物,建立20aL反转录体系,制备cDNA dNTPs 4.0从L 随机引物 1.5l 5×M-MLV缓冲液 4.0l 反转录酶MMLV 1.0AL RNA酶抑制剂 1.0L 总RNA 8.5AL 42C1.5h,95C5min
4.4建立50L外套PCR反应体系 ddH,O 36.7L 0×ExTaq缓冲液(MgPlus 5.0AL 外套上游引物 1.0L 外套下游引物 .0l dNTP 4.0l ExTaqDNA聚合酶 0.3L cDNA 2.0L .(95C45s一55C1min--72Cl 4C
PCR条件;955min- 1min)35个循环--72C7min- 4.5建立50内套PCR反应体系 取2L外套PCR产物作为内套PCR的模板进行套式PCR,建立50"L内套PCR反应体系 ddH.O 36.7AL. 0×ExTaq缓冲液(MgPlus) 5.0L
GB/T36875一2018 内套上游引物 1.0AL 内套下游引物 1.0AL dNTPs 4.0 l ExTaqDNA聚合酶 0.3AL 外套PCR产物 2.0AL. PCR条件:95C5" min一(95C45s一551min一一72c45s)35个循环一72c7min一一4C 4.6电泳 4.6.1配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(通常是1×TAE). 4.6.2配制1%琼脂糖凝胶(见附录A mm一5mm
4.6.3将琼脂糖溶液倒人制胶模中,然后在适当位置处插上梳子
凝胶厚度一般为4" 4.6.4取5L内套PCR产物与lL6×上样缓冲液混匀,用移液器将其加人加样孔中
4.6.5接通电源,以120V电压进行电泳,30min后停止电泳
4.6.6用凝胶成像仪观察并保存结果
4.7结果判定 阳性对照样品的内套PCR产物出现272bp扩增带,阴性对照无扩增带出现(引物二聚体带除外y 时,实验成立
被检样品的内套PCR产物出现272bp特异性条带时,判定样品为猪瘟病毒核酸检测阳 性,否则为阴性(见图1
M -272p 说明: M -DL.2000DNAMarker 阳性对照 2 阴性对照
图1套式RT-PCR检测结果的电泳图示例 4.8基因测序 根据需要,可进一步将阳性PCR扩增产物用内套CR上游、下游引物进行双向测序,获得CSrv 的PCR扩增区基因序列
注意事项 5 5.1样品的处理和检测应在生物安全】级(EBSL-2级)或以上的实验室进行
疑似猪痛样品的分装、研 磨、离心及添加RNA提取裂解液需在I级生物安全柜内进行
检测后的废弃物品需浸人1%次氧酸钠
GB/36875一2018 溶液的污物缸内30min,后经高压灭菌后处理
5.2RT-nPCR实验室各分区器材试剂专用,不可跨区流动使用,防止污染
实验结束后立即用75% 酒精或紫外灯对工作环境消毒处理
5.3所用试剂应在规定的温度下保存,用毕立即放回原处
反转录酶和DNA聚合酶现用现取,其他试 剂使用前需室温融化
配制反转录和PCR反应体系时,应将反应体系和融化的试剂暂放于冰盒
5.4提取RNA时,应戴口罩、乳胶手套,尽量避免交谈,缩短操作时间,防止唾液和皮肤上RNA酶的 污染
使用酒精棉清洁实验工作台、移液器等实验器材 5.5因套式PCR极其敏感,样品处理和核酸提取过程中使用的塑料管和吸头等材料均需一次性使用 不得重复利用
5.6推荐使用DEPC处理的无核酸酶的一次性耗材
用灭菌的锻子夹取离心管,且离心管开盖,扣盖 时避免接触管口
5.7检测试剂在使用前需经2000X
离心15s,使液体全部沉降于管底
配制分装反应体系时应避 免产生气泡
移液器,PCR仪等应定期校验 5.8
GB/T36875?2018 ? A 淶??) ?? A.1TAE??? A.1.10.5mo/L?(EDIA-2Na)?(pH8.0) ?? 18.61g ?? 80mL pH8.0 ?? 100mL A.1.2TAE??(50) 242 ??(Tris 2g 57.1mL 100mL 0.5mol/L.??(pH8.0 ?? 10001 ml A.21%? ? 1g 2ml TAE??(50 98ml ?? ????,????5AL
GB/36875一2018 附录 B 资料性附录 引 物 引物信息见表B,1
表B.1猪瘟病毒套式RT-PCR引物信息 引物名称 引物序列(5'-3' 扩增片段长度 外套上游引物 5 AGRcCCAGACTGGTGGcCNTAYGA3'2228-2250 671bp 外套下游引物 TTYACACTTCTGTTCTcA3'2898-2880 内套上游引物 5'TCRwCAACCAAYGAGATAGGG3'2477-2497 272bp CAcAGYccRAAYcCRAAGTCATc3'(2748-2726)y 内套下游引物 注1:RA/G),Y(C/T),NA/T/C/G),W(A/T 注2引物使用时以DEP(-H.0稀释至10pmol ol/L,于一20C保存 括号中数字为引物序列在CSFVAlfort-187株基因组中的位置
GB/T36875一2018 参 考 文 献 [1]GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 [2]GB19489实验室生物安全通用要求 [3]GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫 TechnicalPartSecond [4]EUDhiagnosticManualforClassicalSwinefever(CSFDia iagnosis DraftMarch2002). [5]OIEBiologiealStandardsCommissionManualofdiagnostictestsandvaccinesfor terrestrialanimal.2014.
猪瘟病毒RT-nPCR检测方法GB/T36875-2018
引言
猪瘟是一种极富传染性的猪病，对养殖业造成了严重的危害。为了及早发现并控制猪瘟病情，需要对其进行快速、准确的检测。RT-nPCR技术因其高度敏感性和特异性而被广泛应用于猪瘟病毒的检测中。
GB/T36875-2018标准介绍
GB/T36875-2018是由中国标准化协会发布的《动物源性食品检验 猪瘟病毒RT-nPCR检测方法》标准，主要规定了猪瘟病毒RT-nPCR检测的方法和技术要求。
检测方法
猪瘟病毒RT-nPCR检测主要包括样品采集、核酸提取、RT-nPCR检测等步骤。
样品采集
样品采集应选择有疑似猪瘟病毒感染的动物组织进行，如脾脏、肺等。在采集前需要消毒操作，避免污染。
核酸提取
将采集到的样品进行分离，然后通过核酸提取试剂盒提取样品中的病毒RNA，并将提取出的RNA转化成cDNA。
RT-nPCR检测
将转化后的cDNA作为模板引物，在PCR反应过程中扩增目标区域并在实时荧光定量PCR仪上进行实时检测，确定是否存在猪瘟病毒的存在。
技术要求
根据GB/T36875-2018标准规定，进行猪瘟病毒RT-nPCR检测应满足以下技术要求：
- 试剂盒质量稳定，能够准确检测出猪瘟病毒；
- 检测灵敏度高，能够在低病毒载量样品中准确检测出猪瘟病毒；
- 检测精度高，避免误判，降低假阳性率和假阴性率；
- 操作简便，易于推广应用。
结论
猪瘟病毒RT-nPCR检测方法是一种快速、准确、可靠的猪瘟病毒检测方法，可以有效地控制和预防猪瘟的传播。按照国家标准GB/T36875-2018进行猪瘟病毒检测，将有助于提高测试结果的准确性和可靠性，为畜牧业的健康发展提供有力支持。
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