GB/T39914-2021
主要农作物品种真实性和纯度SSR分子标记检测玉米
VarietygenuinenessandpuritytestingofmaincropswithSSRmarkers—Maize
- 中国标准分类号（CCS）B21
- 国际标准分类号（ICS）65.020.20
- 实施日期2021-11-01
- 文件格式PDF
- 文本页数32页
- 文件大小1.90M
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主要农作物品种真实性和纯度SSR分子标记检测玉米
国家标准 GB/T39914一2021 主要农作物品种真实性和纯度SSR分子 标记检测 玉米 VarietygentmenessandpuritytestingfmaincrpswithssR m1arkerSMaize 2021-04-30发布 2021-11-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/39914一2021 目 次 前言 范围 2 规范性引用文件 术语,定义和缩略语 3.1术语和定义 3.2缩略语 总则 检测方案 5. 总则 5.2引物 5.3检测平台 5,4样品 5.5检测条件 仪器设备、试剂和溶液配制 6.1仪器设备 6.2试剂 6.3溶液配制 真实性检测程序 7.1引物合成 7.2DNA提取 7.3PCR扩增 扩增产物分离 7." 7.5数据分析 品种纯度检测程序 8.1DNA提取 8.2引物筛选和合成 8.3PCR扩增 12 8.4扩增产物分离 l12 8. 数据分析 13 13 结果计算与表示 13 9.1真实性鉴定 13 9.2纯度测定 13 0结果报告
GB/T39914一202 13 0.1真实性鉴定 14 0.2纯度测定 15 附录A规范性附录溶液配制 18 附录B资料性附录等位基因扩增片段信息 表1真实性鉴定引物 表2PCR扩增反应体系 12 表3纯度测定候选引物 18 表B.1已知品种主要等位基因扩增片段信息
GB/39914一2021 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
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本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任
本标准由农业农村部提出
本标准由全国农作物种子标准化技术委员会(SAC/TC37归口
本标准起草单位;全国农业技术推广服务中心、,北京市农林科学院玉米研究中心、北京市种子管 理站
本标准主要起草人:王凤格、支巨振、易红梅、赵建宗、张力科、田红丽、律宝春
GB/39914一2021 主要农作物品种真实性和纯度SSR分子 标记检测玉米 范围 本标准规定了玉米(ZeamaysL.)品种真实性和品种纯度SSR分子标记的检测原则、检测方案、检 测程序和结果报告
本标准适用于玉米品种真实性验证和真实性身份鉴定,不适用于实质性衍生品种(EDV)和转基因 品种的鉴定
本标准适用于玉米单交种品种纯度测定,自交系,双交种、三交种品种纯度测定可参照执行 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
件
GB/T3543.1！农作物种子检验规程总则 GB/T3543.2农作物种子检验规程托样 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
3.1.1 品种真实性验证 wrtetyveritel atiom 与其对应品种名称的标准样品比较,检测证实供检样品品种名称标注是否名副其实
3.1.2 品种真实性身份鉴定vrtety identification 经SSR分子标记检测并通过审定品种SSR指纹数据比对平台(3.1.4)筛查比较,确定供检样品的真 实品种名称
3.1.3 标准样品 standardsample 国家指定机构保存的经认定代表审定品种特征特性的实物种子样品
3.1.4 SSR指纹数据比对平台sSRfingerprintblastplatform 采用SSR分子标记的标准化方法对品种标准样品等位基因进行检测,并运用计算机数据库技术和 网络信息技术所构建的审定品种分子数据信息的检索比对载体
3.1.5 参照样品 referececontrolsample 用于校准检测样品SSR等位基因已定义扩增产物片段大小的样品
GB/T39914一2021 3.1.6 引物primer 条互补结合在模板DNA链上的短单链,能提供3'-OH末端作为DNA合成的起始点,延伸合 成模板DNA的互补链
3.1.7 组合引物 panel 能够组合在一起电泳的,具有不同颜色或相同颜色而扩增产物片段大小不同的荧光标记的一组 引物
3.1.8 等位基因 allele 在一对同源染色体上同一基因座上的一对基因
注1:对于sSR检测,等位基因差异以扩增产物片段大小来表示
注2:对于荧光标记引物,扩增产物片段大小是指一个已定义片段大小的区间范围,本标准将之称为Bin
3.2缩胳语 下列缩略语适用于本文件
p;basepair,碱基对 CTAB ammoniumbromide,十六烧基三甲基嗅化铵
trimethyl :cetylt DNA:deoxyribonucleicacid ,脱氧核糖核酸
deoxyribonucleoside triphosphates,脱氧核苷三磷酸
PAGE:polyacrylamidegelelectrophoresis,聚丙烯酰胺凝胶电泳
PCR;polymerasechainreaction， ,聚合酶链式反应
SDSsodiumdodeeylsulfate,十二烧基苯磺酸钠
SSR:simplesequencerepeat ,简单序列重复
Taq酶:Tag-DNApolymerase ,耐热DNA聚合酶 总则 玉米的不同品种,其基因组存在着能够世代稳定遗传的简单序列重复(sSR)的重复次数差异
这 种差异可以通过从抽取有代表性的检测样品中提取DNA,用sSR引物进行扩增和电泳,从而通过其护 增产物片段大小不同而加以区分品种
依据sSR检测原理,采用固定数目的ssR引物,通过与标准样品比较或与ssR指纹数据比对平台 比对的方式,对品种真实性进行验证或身份鉴定
真实性验证依据规定数目引物的ssR分子标记差异 数目而判定,品种真实性身份鉴定依据SSR分子标记数目没有差异的原则进行筛查、鉴定而确定
采用筛选能够准确识别品种异常个体指纹数据或图谐的适宜引物,通过对一定数量检测样品的异 常个体数目或百分率的品种纯度估测,从而对其整体的典型一致程度作出评价
检测方案 S 5.1总则 对于真实性鉴定和纯度测定,引物、检测平台、样品状况不同,其检测结果准确度、精确度可能有所 不同
应依据“适于检测目的”的原则,统筹考虑检测规模和检测能力,择定适宜的引物、检测平台、样品 状况,制定相应的检测方案
GB/39914一2021 在严格控制条件下,合成选择的引物,按照确定的检测平台对检测样品按DNA提取、PCR扩增,电 泳、数据分析的程序进行检测
按规定要求填报检测结果,检验报告应注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息
5.2引物 5.2.1真实性鉴定 5.2.1.1检测引物数目越多,结果漏检和误判的概率降低，工作量也随之增加,这需要依据检测目的在 可接受结果准确率的前提下进行兼顾
经对我国审定通过玉米品种进行全面试验后,依据高分辨率,染 色体均匀分布等筛选原则,本标准遴选了40对作为品种真实性鉴定的检测引物,具体见表1,并据此构 建了已知品种的sSSR指纹数据比对平台
表1引物可分为I、I两组,编号PM01PM20为I组,编 号PM21PM40为组,每组包含20对
5.2.1.2品种真实性验证强调的是对结果的否定,相对而言对引物数量要求不高,检测允许采用序贯方 式
先采用I组引物进行检测,若未检测到或检测到可以判定不符结果的差异位点数的,可终止检测
对于采用I组引物进行检测,若检测到而未达到可以判定不符结果的差异位点数的,则继续完成I组引 物的检测
品种真实性身份鉴定强调的是对结果的肯定,在已具备已知审定品种的ssR指纹数据比对平 5.2.1.3 台的前提下,通过已知检测信息能够筛查确定至具体品种
为尽量降低误判检测时会对引物数量要求 较高,可采用序贯方式,也可直接采用表" 的40对SSR引物进行检测,直至与SSR指纹数据比对平台 比较后能够确定为止
经比较后仍与已知品种存在没有位点差异而无法得出结论的,允许采用其他能 够区分的ssR分子标记进行检测
5.2.2纯度测定 纯度测定要明确所检测的异常个体类型,异常个体的类型不同,所选引物和数目也有所不同 5.2.2.1 有时还需借助相应父母本的DNA指纹数据
杂交种异常个体主要类型为自交、异交、混杂;自交系异 常个体为异交、混杂
5.2.2.2品种纯度测定所选的引物,应通过检测样品预试验,筛选出能够准确识别该样品品种的异常个 体
筛选时还需综合考虑引物的杂合度,DNA快速提取和多重组合电泳的潜力
筛选结果表明,样品 在个别位点存在遗传不稳定状况的可将其剔除,检测样品存在严重遗传不稳定状况的可终止纯度测定
5.3检测平台 5.3.1电泳是检测的关键环节,对于真实性鉴定,可选择采用变性PAGE电泳、毛细管电泳,但应注意 变性PAGE电泳检测数据与SSR指纹数据比对平台比对困难,难以进行真实性身份鉴定;对于纯度测 定,可以采用PAGE电泳、毛细管电泳,在选择等位基因扩增片段差异较大的引物前提下也可采用琼脂 糖电泳
5.3.2对于样品量较大的,可将样品粉碎仪、,DNA自动提取和移液工作站、高通量PCR扩增仪、多引物 组合的毛细管电泳进行组合,以提高检测的综合效率
5.3.3DNA提取、PCR扩增、电泳的技术条件要求,在适于检测目的和不影响检测质量的前提下,按照 检测平台的要求允许对本标准的规定做适宜的局部改进
5.4样品 5.4.1真实性鉴定 5.4.1.1送验样品为种子,质量应不低于200g或不少于500粒
在种子生产基地取样,送验样品可为
GB/T39914一202 果穗,数量应不低于5个(总粒数不少于500粒)
注在种子生产基地取样,送验样品可以为幼苗.叶片,苞叶等组织或器官,这时注意其检测比对对象
幼苗、叶片 或苞叶的数量至少含有20个个体,采用混合样品检测的先单独提取DNA,再取等量DNA混合
从送验样品中分取有代表性的试样,采用混合样或单个个体进行检测
混合样试样来源应至 5.4.1.2 少含有20个个体,单个个体试样应至少含有5个个体
5.4.2纯度测定 5.4.2.1送验样品为种子,对于杂交种质量应不低于200g或不少于500粒;对于自交系质量应不低于 400g或不少于1000粒
与真实性鉴定同时开展检测的,可以为同一送检样品
5.4.2.2从送验样品中分取规定数量的试样,试样采用单个个体进行独立检测
送验样品或试样的抽 取、分取应有代表性,符合GB/T3543.2的规定
试样的数量,对于杂交种,应至少含有96(适用时可含 对照)×2粒种子;对于自交系,应至少含有96(适用时可含对照)×4粒种子
5.5检测条件 真实性鉴定或纯度测定应在有利于检测正确实施的控制条件下进行,包括但不限于下列条件 -种子检验员具备熟悉所使用检测技术的知识和技能; 所有仪器与使用的技术相适应,并已经过定期维护,验证和校准; -使用适当等级的试剂和灭菌处理的耗材; 使用校准影响检测结果评定的适宜参照样品
6 仪器设备,试剂和溶液配制 6.1仪器设备 6.1.1DNA提取 高速冷冻离心机、水浴锅或金属浴、紫外分光光度计或核酸浓度测定仪、组织研磨仪
6.1.2PCR扩增 PCR扩增仪 6.1.3电泳 6.1.3.1 毛细管电泳 DNA分析仪
6.1.3.2PAGE电泳 高压电泳仪、垂直电泳槽及制胶附件、水平摇床、胶片观察灯、凝胶成像系统或数码相机
6.1.3.3琼脂糖凝胶电泳 电泳仪、水平电泳槽及制胶附件、凝胶成像系统或紫外透射仪
6.1.4其他器具 微量移液器、电子天平、高压灭菌锅、磁力搅拌器,微波炉,冰箱、染色盒
GB/39914一2021 6.2试剂 6.2.1DNA提取 CTAB,三氧甲烧、异戊醇,异丙醇,乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Nag2H.O)、三羚甲基氨基甲婉碱 Tris-base)、盐酸、氢氧化钠、氯化钠
6.2.2PCR扩增 dNTPs,Taq酶、10×缓冲液,矿物油、ddH,O引物和Mg 6.2.3 电泳 毛细管电泳 6.2.3.1 DNA分析仪专用的丙烯酰胺胶,分子量内标、去离子甲酰胺、电泳缓冲液 6.2.3.2PAGE电泳 去离子甲此胺(Formamide),澳酚蓝(BrphBlue)、二甲苯青FF,甲叉双丙烯酰胺(Bisacrylanmide) 丙烯酰胺(Aecrylamide)、砌酸(BorieAcid)、尿素,亲和硅炕(BindingSilane)、疏水硅烧(RepelSilane) DNA分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺(TEMED),过硫酸铵(APs)、冰醋酸、乙酸铵、硝酸银、甲 醛、氢氧化钠
6.2.3.3琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖、酚蓝(BrphBlue)、核酸染色剂Goldview或化乙锭
6.3溶液配制 DNA提取、PCR扩增、电泳、银染的溶液按照附录A规定的要求进行配制,所用试剂均为分析纯
试剂配制所用水应符合GB/T6682规定的一级水的要求,其中银染溶液配制可以使用符合三级要 求的水
真实性检测程序 7.1引物合成 根据真实性验证或身份鉴定的要求,选定表1的引物
选用变性PAGE电泳,只需合成普通引物 采用单引物电泳
选用荧光毛细管电泳,需在正向引物的5'端标记荧光染料合成引物,采用单引物或 组合引物电泳
表1标记荧光栏所列的仅作为示例,只适用于某一检测平台使用
表1真实性鉴定引物 染色体 标记 编号 引物名称 引物序列(5'3' 位置 荧光 正向;AGTTGAcATcGccATcTGGTGAc PMo1bnlg439w1 1.03 NED 反向:GAACAAGCCCTTAGCGGGTTGTC CCTcGTTAcGGTTACGcTGcTG; 正向;C PM02ume1335y5 1.06 PET 反向:GATGACCCCGCTTACTTcCGTTTATG
GB/T39914一202 表1续 染色体 标记 编号 引物名称 引物序列(5'一3 荧光 位置 l正向;TAcAcAAcGcAAcAcGAGGc PM03umc2007y4 2.04 FAM 反向:GCTATAGGCCGTAGCTTGGTAGACAC 正向cGTTTAAGAAcGGTTGATTGcATTcc PM04bnlg1940k7 2.08 PET 反向:(GCCTTTATTTCTCCCTTGCTTGCC 正向:GAAGGGCAATGAATAGAGCCATGAG PM05umme2105k3 3.00 PET 反向:ATGGACTCTGTGCGACTTGTACCG 正向;CCCTGCCTCTCAGATTCAGAGATTG PM06phi053k2 3.05 NED 反向:TAGGCTGGCTGGAAGTTTGTTGC 正向:(GCTC PM07phi072k4 4.01 VI 反向;CGTTGcCCATACATCATGCCTC CACCCGTAGTAGCTGAGACTTG 正向;(G( PM08bnlg2291k 4.06 VIc 反向:CATAACCTTGcCTccCAAAcc 正向:GGAGGTCGTCAGATGGAGTTcG PM09umc1705wl 5,03 VIc 反向:CACGTACGGCAATGCAGACAAG 正向.ccrTTTcTcAccACCTTG PM10bnlg2305k 5.07 NED 反向:CGTCTTGTCTCCGTCCGTGTG 正向;TcTcAGcTccTGcTTATTGcTTTcG PM11bnlgl61k8 VIc 6.00 反向:GATGGATGGAGCATGAGCTTGC GATccGCATTGTcAAATGAcCAc 正向:;GAT PM12bnlgl702kl 6.05 VI 反向;AGGACACGCCATCGTCATCAN 正向:AATGCCGTTATCATGCGAT(GC PM13ummel545y2 7.00 NED 反向:GCTTGCTGCTTCTTGAATTGCGT 正向:(GGATGAT(GGCGAGGATGATGTC PM14umel125ys3 7.04 VIC 反向:cCACCAACCCATACCCATACCAG 正向:GCAGGTGTCGGGGATTTTCTC PM15bnlg240k1l 8,06 PET 反向:GGAACTGAAGAACAGAAGGCATTGATAC 正向;TGAAccAcccGATGcAAcTTG PM16phi080k15 8,08 PET 反向:TTGATGGGCACGATCTCGTAGTC 正向;cGccTIcAAGAATATccTTGTGcc PM17phio65k9 9,03 NED 反向:(GGACCCAGACCAGGTTCCACC 正向;GcGGAAGAGTAGTcGTAGGGcTAGTGTAG PM18ummel492y13 9.04 PET 反向:AACCAAGTTCTTCAGACGCTTCAGG 正向:(GAGAAATCAAGAGGT(GCGAGCATC PM19ummel432y6 10.02 PE 反向:GGCCATGATACAGCAAGAAATGATAAGC 正向:(GAGGAATGATGTCCGCGAAGAAG PM20umel506k12 10.05 FAM 反向:TTCAGTCGAGCGCCCAACAC 正向:AAGAAcAGGACTAcATGAGGTGcGATAc PM21umcl147y4 1.07 NED 反向:GTTTcCTATGGTACAGTTCTccCTcGC
GB/39914一2021 表1(续 染色体 标记 编号 引物名称 引物序列(5'一3' 荧光 位置 正向.cccGAcAccTGAGTTGAccTG PM22bnlgl671y1l7 .10 FAM 反向:CTGGAGGGTGAAACAAGAGCAATG 正向;TTTTGcAcGAGcCATcGTATAAcG PM23phi96100yl 2.00 FAM 反向:CCATCTGCTGATCCGAATACCC AGcATATcccTGGTATcG 正向:TGATAGGTAGTTA PM24umel536k9 2.07 NED 反向:GAGCATAGAAAAAGTTGAGGTTAATATGGAGC ATATCAGACAACAcc 正向;C PM25bnlgl52ok1l 2.09 FAM 反向;(GCTTCTGCTGCTGT AGAATCTTC 正向;(GC" PM26umel489y3 3.07 NED TTACTcCTGT 正向:GGTGTT(GGAGTCGCTGGGAAAG PM27bnlg490y4 4.04 NED 反向:TTCTCAGCCAG,TGCCAGCTCTTATTA 正向:GGCCACGTTATTGCTCATTTGC PM28 umc1999y3 FAM 4.09 反向:GCAACAACAAATGGGATCTCCG 正向:GCACTGGCAACTGTACCCATCG PM29umc2115k3 5,02 VIC 反向:GGGTTTCACCAACGGGGATAGG 正向:CTTCTCCTCGGCATCATCCAAAC PM30umcl429y7 5.03 V1 反向:GGTGGCCCTGTTAATCCTCATCTG 正向;(GGCA PM31bnlg249k2 6.01 V1Ic 反向:CATCGGCGTTGATTTCGTCAG GTA(GGTGGAGGAAGG 正向;AGC PM32phi299852y2 6.07 V1Ic 反向:AGCTGTTGTGGCTC 正向:TCATTCCCAGAGTGCCTTAACACTG PM33umc216ok3 7.01 VC 反向:CTGTGCTcGTGCTTCTCTCTGAGTATT 正向:GCTTGAGGCGGTTGAGGTATGAG PM34umcl936k4 7.03 PET 反向;TGCACAGAATAAACATAGGTAGGTCAGGTC 正向:CGCACGGCACGATAGAGGTG PM35bnlg2235y5 8,02 VIC 反向:AACTGCTTGCCACTGGTACGGTCT 正向,ccGGcAGTcGATTAcTccAcG PM36phi233376yl PET 8.09 反向:CAGTAGCCCCTCAAGCAAAACATTC 正向,AcTGATcGcGAcGAGTTAATTcAAAC PM37 mc2084w2 9.01 NED 反向:TACCGAAGAACAACGTCATTTCAGC 正向:ACAGAGGAACGACGGGACCAAT PM38umel231k 9.05 FAM 反向:GGCACTCAGCAAAGAGCCAAATTC 正向:CAGCGccGcAAAcTTGGTT M69hio4lyo 10.00 PET 反向;TGGACGCGAACCAGAAACAGAC 正向:cAAGcGGGAATcTGAATcTTTGTTc PM40umc2163w3 10.04 NED 反向;CTTCGTACCATCTTCCC'TACTTCATTGC
GB/T39914一2021 7.2NA提取 7.2.1总则 DNA提取方法应保证提取的DNA质量符合PCR扩增的要求,DNA无降解,溶液的紫外光吸光 度OD与OD.的比值宜介于1.8~2.0之间
DNA提取可任选7.2.2至7.2.5所列的一种方法
其中CTAB和试剂盒法提取量大,质量好,可 长期保存;SDS法快速简单,提取量小,质量较好;碱煮法简单快速,提取量小,质量一般,不宜保存
7.2.2CTAB法 取试样的幼苗或叶片200mg~ 300mg置于2.0mL离心管,加液氮充分研磨,或取种子充分磨碎 后移人2.0mL离心管
每管加人700L经65C预热的CTAB提取液,充分混合,65C水浴60min 期间不时多次轻缓颠倒混匀
每管加人等体积的三氧甲烧/异戊醇(24:1)混合液,充分混合后静置 10min,在12000r/min离心15min至分相
吸取上清液转移至新的离心管中,加人等体积预冷的异 丙醇,轻轻颠倒混匀，一20C放置30min后在4C、12000r/min离心10min
弃上清液,加人70%乙 醇,旋转数次后弃去乙醉溶液,并倒立于垫有滤纸的实验台上,室温放置10min以上
加人l00L超 纯水或TE缓冲液1,充分溶解后供备用
7.2.3试剂盒法 选用适宜SSR分子标记法的商业试剂盒,并经验证合格后使用
DNA提取方法,按照提供的使用 说明进行操作
7.2.4SDs法 取试样的幼苗或叶片,或切取干种子的胚,置于1.5mL离心管,加人100AL氯仿后研磨,再加人 300LSDS提取液,混匀后在10000r/min离心2min
吸取上清液,转移至预先装有300AL
异丙醇 和300L5mol/几氯化钠溶液的1.5mL.离心管中
待成团后,挑出DNA,经70%乙醉洗涤后,加人 200LTE缓冲液1,充分溶解后供备用
7.2.5碱煮法 切取试样干种子的胚,或将种子发芽至幼苗长度达到3cm左右时剪取1.5cm长的幼苗,放人96 孔深孔板中
每孔加人150ML氢氧化钠提取液,沸水加热5min,然后加人150LTE缓冲液2,充分 溶解后供备用
7.3CR扩增 7.3.1反应体系 PCR扩增反应体系的总体积和组分的终浓度参照表2进行配量,可以依据试验条件不同做相应调 整
表2中的缓冲液若含有MgCl,不再加MgCI溶液,加等体积无菌水替代 表2PCR扩增反应体系 反应组分 原浓度 终浓度 体积/L ddlH.O 12.35 10×缓冲液 10X
GB/39914一2021 表2(续 反应组分 原浓度 终浓度 体积/4l MgC 25mmol/L 2.5mmol/1 dNTP 2.5mmol/I 0.15mmmol/I" l.2 5U/L 0.05U/aL 0.2 Taq阱 20mol/1 0.25Hmol/几 0.25 引物 DNA 25ng/l 2.5ng/al 每一种类的浓度
反应程序 7.3.2 反应程序的反应参数可根据PCR扩增仪型号、酶、引物等不同而做适当的调整
通常采用下列反 应程序 预变性;94C,5nmin a b) 扩增;94C变性40s,60C退火35s,72C延伸45s,进行35次循环 终延伸;72C,l0min. c 形成的扩增产物于4C保存
7.4扩增产物分离 7.4.1荧光毛细管电泳 7.4.1.1对于玉米,sSR分子标记扩增片段大小范围较广,可以依据不同仪器选择采用不多于10重的 组合引物进行电泳
按照预先确定的组合引物,分别取等体积的同一组合引物的不同荧光标记的扩增 产物见7.3.2),充分混匀
从混合液中吸取1L,加人DNA分析仪专用96孔板孔中
各孔再分别加 人0.1L分子量内标和8.9L去离子甲酰胺,在PCR仪上95C变性5min,取出立即置于冰上,冷却 0min以上
瞬时离心10s后供备用
7.4.1.2打开DNA分析仪,检查仪器工作状态和试剂状态
7.4.1.3将装有样品的微孔板放置于样品架基座上,打开数据收集软件,按照DNNA分析仪使用手册进 行操作
DNA分析仪将自动运行参数,并保存电泳原始数据文件
7.4.2变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 7.4.2.1制胶 沾洗涤灵用清水将玻璃板反复擦洗干净,再用双蒸水,95%乙醇分别擦洗两遍
玻璃板干燥后,将 0.5 mL亲和硅炕工作液,均匀涂在无凹槽的玻璃板上;将0.5mL，疏水硅烧工作液,均匀涂在带凹槽的 玻璃板上
操作过程中两块玻璃板分别处理,防止相互污染;玻璃板彻底干燥后,将塑料隔条整齐放在 无凹槽玻璃板两侧,盖上凹槽玻璃板,夹子固定后,用水平仪检测玻璃胶室是否水平;取100ml
4.5% PAGE胶,加人各100L的TEMED,25%过硫酸铵,迅速混匀,将胶灌人玻璃胶室,灌胶过程应防止气 泡的出现
待胶室灌满后,在凹槽处将鲨鱼齿朝外轻轻插人样品梳,在室温下聚合1h以上 7.4.2.2变性 取20L扩增产物(见7.3.2),加人4AL.6×加样缓冲液,混匀
在PCR扩增仪上运行95C变性
GB/T39914一2021 5min， ！ C冷却10min后供备用 7.4.2.3电泳 7.4.2.3.1在电泳正极槽下槽)加人1×TBE缓冲液600mL,负极槽(上槽)加人经65C预热的1× 20 TBE缓冲液600ml,拔出样品梳,在90W恒功率下预电泳10min min,用移液器吹或吸清除加样 槽孔气泡和杂质,插人样品杭鲨鱼齿朝下)
每一个加样孔点人5L样品见7.4.2.2),在80w恒功 率下进行电泳
7.4.2.3.2电泳的适宜时间,参考二甲苯青指示带移动的位置和扩增产物预期片段大小范围(参见表 B.1)加以确定
二甲苯青指示带在4.5%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中,所移动的位置与150bp扩增 产物泳动的位置大致相当
扩增产物片段大小在(150士50)bp,(250士50)bp,(350士50)bp范围的,指 示带从上到下应分别到达胶板1/2、2/3,3/4处后,才可结束电泳
电泳结束后关闭电源,取下玻璃板并 轻轻撬开,通常凝胶附着在无凹槽的玻璃板上
7.4.2.4染色 将附着凝胶的玻璃板浸人固定液中,轻轻晃动3min后取出,在双蒸水中快速漂洗,时间不超过 10s;将胶板放人染色液中,轻轻晃动5min后取出.在双蒸水中快迷漂洗时间不超过10s;将胶板放 人显影液中,轻轻晃动待条带清晰后取出,再迅速放人固定液中定影5min取出,在双蒸水中漂洗 1nmin;取出胶板,晾干,放在胶片观察灯上观察,记录结果,拍照保存
注:固定液、染色液,双蒸水和显影液的用量,可依据胶板数量和大小调整,以淹没胶面为准
7.5数据分析 7.5.1总则 7.5.1.1为了获得一致的比对结果,电泳结果特别是毛细管电泳,需要通过规定程序进行数据分析
在 引物等位基因片段大小范围内(参见表B.1),对于毛细管电泳,特异峰呈现为稳定的尖锐峰型,纯合位 点显示为单峰,杂合位点显示为双峰;对于PAGE电泳,特异谱带呈现明显,纯合位点显示为单条,杂合 位点显示为双条
7.5.1.2对于毛细管电泳,由于引物扩增表现不同、引物不对称扩增、试验条件干扰等因素,可能出现不 同状况的峰型,按照以峰高为主、兼顾峰型的原则依据下列规则进行甄别、过滤处置 a 对于连带(pullup)峰,即因某一位置某一颜色荧光的峰值较高而引起同一位置其他颜色荧光 峰值升高的,应预先将其干扰消除后再进行分析 对于(n十1)峰,即同一位置出现两个相距1bp左右的峰,应视为单蜂; b c -个重复序列的连续多个峰.,应视为单峰,取其 对于连续多峰,即峰高递增或峰高接近的相差- 最右边的峰,峰高值为连续多个峰的叠加值 对于多个特异峰,峰高值应只采集位于前两位的两个峰,不采集其他峰， d e 对于高低峰,应通过设定一定阂值不予采集低于阂值的峰
7.5.1.3对于PAGE电泳,位于其相应的等位基因扩增片段大小范围之外的谱带需要甄别是非特异性 扩增带还是新增的稀有等位基因谱带
采用单个个体提取的,出现双带以上的多带则可能为非特异性 扩增带;采用混合样提取的,某些位点出现三带、强弱带等状况,则需要通过单个个体提取进行甄别
7.5.1.4采用混合样检测,无论是毛细管电泳还是PAGE电泳,结果表明在引物位点出现异质性而无 法识别特异谱带或特异峰的,应采用单个个体独立检测,试样至少含有20个个体的数量
若样品在 半以上的引物位点中呈现明显的异质性,可终止真实性鉴定
10
GB/39914一2021 7.5.2数据分析和读取 7.5.2.1 毛细管电泳 导出电泳原始数据文件,采用数据分析软件按照下列步骤进行数据甄别 设置参数:在数据分析软件中预先设置好panel、分子量内标、panel的相应引物的Bim; a b 导人原始数据文件;将电泳原始数据文件导人分析软件,选择panel,分子量内标,Bin,质量控 制参数等进行分析; 甄别过滤处置数据;执行7.5.1的规定
分析软件会对检测质量赋以颜色标志进行评分,绿色表示质量可靠无需干预,红色表示质量不过关 或未落人Bin范围内,黄色表示有疑问需要查验原始图像进行确认
数据比对采用7.5.3.1、7.5.3.2方式的,应分别通过同时进行试验的标准样品、参照样品(依据引物 选择少量的对照),校准不同电泳板间的数据偏差后再读取扩增片段大小
甄别后的特异峰落人Bin范 围内,直接读取扩增片段大小;若其峰大多不在Bin范围内,可将其整体平移尽量使峰落人Bin设置范 围内后读取数据
7.5.2.2变性PAGE电泳 对甄别后的特异谱带(见7.5.1)进行读取
扩增片段大小的读取,统一采用两段式数据记录方式
纯合位点数据记录为X/X,杂合位点数据记录为X/Y(其中X、Y分别为该位点两个等位基因扩增片 段),小片段数据在前,大片段数据在后,缺失位点数据记录为0/0
7.5.3数据比对 7.5.3.1采用与标准样品比较的,对甄别后的特异谱带(见7.5.2.2)或特异峰(见7.5.2.1),按照在同一 电泳板上的检测样品与标准样品逐个位点进行两两比较,确定其位点差异
7.5.3.2采用毛细管电泳与SSR指纹数据比对平台比对的,按照数据导人模板的要求,将数据及其指 纹截图上传到ssR指纹数据比对平台,进行逐个位点在线比对,核实确定相互间的指纹数据的异同
7.5.3.3采用PAGE电泳与SSR指纹数据比对平台比对的,按照数据导人模板的要求,将数据上传到 SSR指纹数据比对平台,进行逐个位点的两两比 ,核实确定相互间的指纹数据的异同 对， 注:采用PAGE电泳与SSR指纹数据比对平台比对较为困难,建议作为参考使用,比对前采取以下措施: 读取扩增产物片段大小数据的,检测样品与参照样品附录B)同时在同一电泳板上电泳 a bD) 电泳时间足够,符合7.4.2.3.2的要求 检测样品存在扩增片段差异较小的,按片段大小顺序重新电泳进行复核确定后读取
c 7.5.4数据记录 数据比对后,按照位点存在差异或完全相同、数据缺失,无法判定等情形,记录每个引物的位点 状况
品种纯度检测程序 8.1NA提取 DNA提取可任选7.2所列方法,优先推荐7.2.5碱煮法
8.2引物筛选和合成 8.2.1针对杂交种品种纯度不同类型异常个体的引物筛选,可参照下列规则进行确定 11
GB/T39914一202 对于鉴定自交个体,识别特征为该等位基因具有母本而父本缺失,筛选1对能检测杂合位点 通常表现为双亲互补带)的引物 对于鉴定异交个体,识别特征为该等位基因具有母本而父本错误,在具备父母本对照或其 SSR指纹数据的条件下,筛选2对以上的引物 -对于鉴定混杂个体,识别特征为该等位基因具有父本而母本错误或不具有父母本,在具备父母 本对照或其ssR指纹数据的条件下,筛选2对以上的引物 对于同时鉴定自交、异交、混杂个体或者其中两者的,应综合考虑筛选3对以上的引物
对于自交系品种纯度测定,鉴定异交个体,混杂个体的,各需筛选2对以上的引物
8.2.2 本标准推荐了8对品种纯度测定引物(见表3),作为优先筛选的候选引物
缩选时,可用至少含 20粒的小样品进行试验,依据5.2.2的要求,确定适宜的引物或引物组合
推荐8对引物仍未达到筛选 效果的,可选择表1另外32对引物或其他引物进行筛选
表3纯度测定候选引物 染色体 扩增片段 编号 引物名称 引物序列(5' 标记荧光 杂合度 -3 位置 范围/bp 正向:;AGTTGACATCGCCATCT'TGGTGAC PMo1 NED bnlg439wl 1.03 320368 0.83 反向;GAACAAGCCCTTAGC(GGGTTGTC 正向:TTT'TGCACGAGCCATCGTATAACG PM23 FAM 245一27？7 2.00 0.62 phi96100yl 反向;CCATCTGCTGATCCGAATACC 正向:GCACACCCGTAGTAGCTGAGACTTG PM08 VIc 4.06 26l301 bnlg2291k 0.81 反向:CATAACCTTGCCTCCCAAACCC 正向:AATGCCGTTATCATGCGATGC PM13 umel545y2 NED 7.00 364一404 0.82 反向GCTTGCTGcTTCTTGAATTGCGT 正向:(GCAGGTGTCGGGGATTTTCTC PM15 190246 PET mle240k" 8.06 0.83 反向:GGAACTGAAGAACAGAAGGCATTGATAC 正向:CGCCTTCAAGAATATCCTTGTGCC PM17 NED phi065k9 9.03 166190 0.78 反向GGACcCAGACCAGGTTcCACc 正向:GAGGAATGATGTCCGCGAAGAAG PM2oumc1506k12 FAM 10.05 221239 0.74 反向;TTCAGTcGAGcGCCCAACAC 正向:GGCAACGGCAATAATCCACAAG VIc PM31 6.0] 393413 0.63 bnlg249k2 反向:CATcGGCGTTGATTTCGTCAG 注:本表标记荧光栏所列的仅作为示例,只适用于某一检测平台的使用,8个引物可以进行8重组合电泳
8.2.3选定引物后,按照电泳方法的不同,依据7.1要求合成引物
8.3PCR扩增 反应体系和反应程序执行7.3的要求,形成扩增产物
8.4扩增产物分离 8.4.1琼脂糖凝胶电泳 8.4.1.1 制胶 按琼脂糖浓度为2.0%比例的要求,称取一定量琼脂糖,加人1×TAE电泳缓冲液,混合煮沸溶解
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GB/39914一2021 溶液冷却至60C,加人核酸染色剂混匀,倒人已封好的凝胶灌制平台上,插上样品梳
待凝胶完全凝固 后,从制胶平台上除去封带,拔出梳子,置人盛有1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中,缓冲液液面高出凝 胶表面约1 mm
8.4.1.2电泳 取10AL扩增产物见8.3),加人24L澳酚蓝,混匀,用微量移液器加到样品孔中
接通电极,在最 高电压不超过5V/em(100V~150V恒压电泳)下进行电泳,使扩增产物从负极向正极移动
当澳盼 蓝迁移的位置表明DNA扩增片段已足够分离时,才可结束电泳
8.4.1.3鉴定 电泳结束后关闭电源,取下凝胶,在凝胶成像系统或紫外投射仪上观察鉴定,并照相保存
8.4.2荧光毛细管电泳 荧光毛细管电泳执行7.4.1的要求
8.5数据分析 通过电泳后呈现的特异谱带(见8,4.1.3)或特异峰(见8.4.2),依据8.2.1的规定,准确识别该品种正 常个体、,异常个体指纹图谱或数据,记录每个检测引物位点的信息
结果计算与表示 9.1真实性鉴定 统计位点差异记录的结果,计算差异位点数,核实差异位点的引物编号
检测结果用检测样品和标准样品比较的位点差异数目表示,检测结果的容许差距不能大于2个等 位位点
9.2纯度测定 检测结果根据检测目的,选择使用检测样品的自交个体,其他异常个体数目表示,也可使用正常个 体数目(检测试样总数减去异常个体数目)占检测试样总数的百分率表示
统计与检测样品正常表现不一致的异常个体数,计数个体数目或计算百分率,检测结果的容许差距 应符合GB/T3543.1的要求
10结果报告 10.1真实性鉴定 10.1.1按照GB/T3543.1的检验报告要求,对品种真实性验证或身份鉴定的检测结果进行填报
10.1.2对于真实性验证,选择下列方式之一进行填报 a 通过 对引物,采用 电泳方法进行检测,与标准样品比较未能检测出位点差异
b)通过 对引物,采用 电泳方法进行检测,与标准样品比较检测出差异位点数 个,差异位点的引物编号为 10.1.3对于真实性身份鉴定,采用下列方式进行填报 通过 对引物,采用 电泳方法进行检测,经与DNA指纹数据比对平台筛查并鉴定,检 13
GB/T39914一202 大 测样品属于XXX品种,或者属于XXX,XXXX其中的 0.1.4属于下列情形之一的,需在检验报告中注明 -送验样品低于5.4.1.1规定数量的; 与DNA指纹数据比对平台进行数据比对的 -检测样品遗传不稳定严重的位点(引物编号)清单; -检测采用了其他SSR引物的名称及序列
10.2纯度测定 10.2.1按照GB/T3543.1的检验报告要求,可以选择下列方式之一进行品种纯度检测结果的填报: 通过编号为 的引物,检测了 个个体,采用 电泳方法，检测出自交个 a 体 个,其他类型杂株个体 b 个个体,采用 通过编号为 电泳方法,检测出自交个体和其 的引物,检测了 他类型杂株个体 个,品种纯度为 0.2.2属于下列情形之一的,需在检验报告中注明 送验样品低于5,4.2.1规定数量的 异常个体仅检测自交个体的 检测样品因遗传不稳定严重的位点(引物编号)清单， 检测采用了其他sSR引物的名称及序列
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GB/39914一2021 附 录 A 规范性附录 溶液配制 A.1NA提取 A.1.10.5mol/LEDTA溶液 Na,EDTA2H.o186.1段溶于800mL.水中,加固体NaOH调pH至8.0,加水定容至1000mL. 高压灭菌
A.1.21mol/LTris-HCI溶液 Tris碱60.55g溶于适量水中,加HCl调pH至8.0,加水定容至500mL,高压灭菌
A.1.30.5mol/LHHC溶液 浓盐酸(36%一38%)25mL.加水定容至500mL A.1.4CTAB提取液 固体NaOH81.7g,CTAB20g、lmol/ILTris-HCl100ml和0.5mol/EDTA40ml,加水定容 至1000mL,4C贮存
A.1.5sSDS提取液 mol/1Tris-HCl50ml.0.5mol/LEDTA50ml,5mol/几NaCl50ml和SDS7.5g混合,加水 定容至500mL A.1.6NaOH提取液 固体NaOH2g,加水定容至500mL A.1.7TE缓冲液1 1mol/几Tris-HCl5mL和0.5mol/LEDTA1mL,加HC调pH至8.0,加水定容至500mL
A.1.8TE缓冲液2 mol/儿LTris-HCl5mlL,0.5mol/几EDTAlml和0.5mol/LHCl100ml,加水定容至500 ml
A.1.95mo/LNaCI溶液 固体NaCl14og,加水定容至500mL A.2PCR扩增 A.2.1dNTP 用TE缓冲液1分别配制dATP,dG;TP,dCTP,dTTP终浓度100mmol/儿的储存液
各取20"l 15
GB/T39914一2021 混合,用720ALTE缓冲液1定容至每种核苷酸终浓度为2.5mmol/L的工作液
A.2.2sSR引物 用TE缓冲液1分别配制正向引物、反向引物终浓度均为40mol/L的储存液,等体积混合成 204mol/L的工作液
A.2.36×加样缓冲液 去离子甲酰胺49mlL,0.5mol/1EDTA1mL澳酚蓝0.125g和二甲苯青0.125g混合
A.3电泳 A.3.140%PAGE胶 丙烯酰胺190g和甲叉双丙烯酰胺10g,加水定容至500ml A.3.24.5%PAGE胶 尿索450从.0xTE缓冲液100ml和40%PAGE胶112.5" ml,加水定容至1000ml
A.3.3Bind缓冲液 无水乙醇49.75mL和冰醋酸250L,加水定容至50mL
A.3.4亲和硅婉工作液 Bind缓冲液1m和Bind原液5L混合
A.3.5疏水硅烧工作液 2%二甲基二氯硅烧
A.3.625"%过硫酸铵溶液 0.25只过硫酸铵溶于1mL超纯水中
A.3.710×IBE缓冲液 Tris碱108g、棚酸55g和0.5mol/1EDTA37mL,加水定容至1000mL A.3.81×TBE缓冲液 10×TBE缓冲液500mL,加水定容至5000mL
A.3.950×TAE缓冲液 Ti碱212[.冰醋酸7.1mL和00sma儿EDTAI0mL..加水定容至100 mL
A.3.101×TAE缓冲液 50×TAE缓冲液100ml,加水定容至5000mL 16
GB/39914一2021 A.4银染 A.4.1固定液 00mL冰醋酸,加水定容至1000ml A.4.2染色液 硝酸银2g,加水定容至1000mL A.4.3显影液 固体NaOH30g和甲醛5mL,加水定容至1000mL 17
GB/T39914一2021 附 录 B 资料性附录) 等位基因扩增片段信息 表B.1列出了40对引物在已知玉米品种中扩增的片段长度范围,主要等位基因扩增片段大小与频 率,以及参照样品对应的扩增片段信息
其中参照样品只是列举,考虑到在某一SSR位点多个品种存 在相同的扩增片段大小,确认某一品种在该位点扩增片段大小与参照样品是相同的,该品种也可替代相 应的参照样品
表B.1已知品种主要等位基因扩增片段信息 引物 参照样品 等位基因扩增片段 编号 名称 范围/bp 片段定义/bp 片段频率 名称 扩增片段/bp 绵单1 号 320 0,007 320/350 322 郑单
0.115 958 322/354 0.085 农大108 325/350 325 331 0.004 335 0,027 桂青贮1号 335/350 339 0.,009 344 0.,078 农华10 344/350 辽单527 346 0,034 322/346 PMo1 0.028 348 320一368 bnlg439wl 350 0.348 350/350 先玉335 352 0.035 354 0.14 郑单958 322/354 356 0,027 358 0,023 玉16 350/358 362 0,014 遵糯1号 325/362 366 0.019 368 344/368 金玉甜1号 0.009 0.076 绵单1号 234/234 234 238 0.074 京玉7号 238/238 PM02 umel335y5 234~254 240 0.681 泼单20 240/240 252 0,161 郑单958 252/252 本玉9号 254 0,009 254/254 18
GB/39914一2021 表B.1续 等位基因扩增片段 参照样品 引物 编号 范围/bp 片段定义/bp 片段频率 扩增片段/bp 名称 名称 238 0.025 238/282 正大619 川单14 246/25o 246 0.085 248 0.157 郑单958 248/255 250 0.094 先玉335 250/255 252 0.041 255 0.435 郑单958 248/255 257 0.009 26o 238/26o 遵糯1号 0.03 PM03 umc2007y4 238~292 264 0.046 盖玉16 255/264 266 0.007 271 0.002 屯玉27 255/270 273 0.021 279 0.005 金玉甜1号 252/279 82 238/282 0.005 正大619 兴垦 284 0.032 10 246/284 288 0.005 284/292 292 0.002 奥玉28 344 0.018 正大619 344/362 346 0.11 中科4号 346/360 348 0.247 郑单958 348/362 350 0.021 0.051 352/362 352 成单22 354 0.035 360 0.269 先玉335 360/36o PMo4 344386 bnlg1940k? 362 0.159 郑单958 348/362 364 0.007 366 0.004 奥玉28 360/366 368 360/368 0.004 金海5号 370o 0.002 378 0.057 本玉9号 352/378 386 0.018 京科968 386/386 19
GB/T39914一2021 表B.1续 等位基因扩增片段 参照样品 引物 编号 名称 范围/bp 片段定义/bp 片段频率 扩增片段/bp 名称 288 0.018 288/317 本玉9号 290/335 290 0.376 郑单958 292 0.233 中科4号 292/335 294 0.049 农华101 294/317 300 0.,002 绵单1号 288335 PM05 umc2105k3 302 0,019 292/302 万糯！ 号 305 305/323 0,044 309 0.005 317 0.115 290/317 先玉335 323 0.085 泼单20 323/335 335 0.053 郑单958 290/335 333 0.,032 万糯1号 333/336 0.39 336 郑单958 336/362 341 0,053 奥玉28 341/362 PM06 phi053k2 333362 0.329 343/362 343 泼单20 357 0.023 正大619 343/357 336/362 362 0,173 郑单958 410 0.622 郑单958 410/410 416 0,018 正大619 416/421 421 0.,088 正大619 416/421 PM07 phi072k 410430 424 0,049 盏玉16 424/430 0.035 27 430 0.187 盏玉16 424/430 364 0.314 郑单958 364/380 374 374/376 金玉甜1 0.0l4 号 374/376 376 0.,009 金玉甜l 378 0.012 380 0,175 郑单958 364/380 PM08 0.26 农华1o1 382/404 382 nle291ke 364一404 386 0.012 盖玉6号 386/404 388 0.002 390 0.,005 川单l4 390/404 396 0.021 404 0,175 农华101 382/404 20
GB/39914一2021 表B.1续 等位基因扩增片段 参照样品 引物 编号 片段定义/bp 片段频率 扩增片段/bp 名称 范围/bp 名称 269 0.035 万糯1号 269/275 271 0.016 273 0.269 郑单958 273/275 275 0.14 郑单958 273/275 279 0.034 川单14 279/301 289 0.011 291 0.021 中科4号 273/291 PM09 umcl705wl 269319 293 0.005 297 0.004 郑加甜5039 275/297 299 0.004 301 0.228 泼单20 275/301 303 0.005 273/311 31l 0.012 京科甜126 319 0.217 先玉335 319/319 号 244 0.039 中科 244/268 248 0.15 郑单958 248/252 252 0.283 郑单958 248/252 正大619 254 0.009 248/254 号 26o 0,06 绵单1 252/260 PM1o bnlg2305k4 244290 252/262 262 0.141 成单22 268 0.186 农华101 252/268 274 0.027 本玉9号 262/274 281 0.002 290 0.104 先玉335 252/290 154 0.004 成单22 154/183 158 0.064 中科10 158/181 165 0.177 农华101 165/173 170 0.002 173 0.196 郑单958 173/197 175 0.018 PM11 bnlg161k8 154219 177 0.069 泼单20 177/197 179 0.002 181 0.064 辽单527 173/181 183 0.125 先玉335 173/183 85 0.083 成单19 165/185 187 0.009 89 0.014 金海5号 177/189
GB/T39914一2021 表B.1续 等位基因扩增片段 引物 参照样品 编号 名称 范围/bp 片段定义/bp 片段频率 扩增片段/bp 名称 191 0.037 0.002 遵糯1号 183/193 193 195 0.012 197 0.085 郑单958 173/197 PMl1 bnlgl61k8 154一219 199 0,012 号 201 0,016 金玉甜1 158/201 211 158/211 0,005 雅玉青贮04889 213 0.002 219 0.004 资玉3号 219/219 265 0.267 先玉335 265/265 267 0.099 成单19 267/305 269 0.,007 271 0,012 雅玉青贮04889 265/271 273/275 73 波单 20 0,152 0.147 275/29g 275 郑单958 277 0.005 正大619 277/27？ 273/279 279 0,046 川单14 PM12 bnlg1702k1 265~321 281 0.005 兴垦10 265/281 283 0,021 金玉甜1号 283/289 287 0.,004 号 283/289 289 0,002 金玉甜1 291 0.065 265/291 农华101 299 0.102 郑单958 275/299 305 0.06 中科4号 275/305 315 0,002 321 0.,004 农乐988 275/321 190 0,148 先玉335 190/206 郑单 958 202 0,226 202/212 206 0.375 190/206 先玉335 PMl3 umel545y2 190~246 213 0.177 郑单958 202/212 230 0.011 206/246 246 0.064 农大108 22
GB/39914一2021 表B.1续 等位基因扩增片段 参照样品 引物 编号 范围/bp 片段定义/bp 片段频率 扩增片段/bp 名称 名称 150 0.027 150/173 川单14 152 152/173 0.155 先玉335 PMl4 umcl125y3 150~173 154 0.253 郑单958 154/173 169 0.168 农大108 169/173 73 0.398 郑单958 154/173 郑单958 221 0.216 221/237 229/233 29 0.069 农大108 231 0.08 231/237 正大619 PM15 bnlg240k1 221~239 233 0.147 229/233 农大108 235 0.074 成单22 231/235 237 0.376 郑单958 221/237 239 0.037 金玉甜1号 233/239 郑单958 202 0.032 202/222 207 0.012 212 212/212 中科4 0.092 号 PMl6 phi080k15 202228 217 0.495 先玉335 217/217 202/222 222 0.217 郑单958 228 0.152 农华101 217/228 393 0.362 郑单958 393/413 403 0.005 PM17 phio65k9 393413 先玉335 408 0.15 408/413 413 0.482 393/413 郑单958 273 0.014 273/284 正大619 273~284 PM18 umel492y13 278 0.843 278/284 农华101 284 0.143 农华101 278/284 220 0.041 农华101 220/224 郑单958 224 0.726 224/240 号 226 0.023 遵糯1 220/226 PM19 umel432y6 220257 230 0.062 224/230 本玉9号 240 0.136 郑单958 224/240 257 0.012 奥玉28 224/257 23
GB/T39914一2021 表B.1续 等位基因扩增片段 参照样品 引物 编号 名称 范围/bp 片段定义/bp 片段频率 扩增片段/bp 名称 166 166/166 遵糯1 0.0l4 号 0.092 川单14 169/176 169 173 0.037 金海5号 173/176 PM20 umel506k12 166~190 176 0.164 金海5号 173/176 179 0.2 成单19 179/185 先玉335 185 0,373 185/190 185/190 190 0.12 先玉335 154 0.804 154/168 先玉335 PM21 umel147y4 154168 168 0.196 154/168 先玉335 175 0.133 中科4号 175/184 180 0.034 184 0.23 郑单958 184/194 186 0,04l 郑单 958 194 0,322 184/194 207 0.005 PM22 bnlgl671yl7 175230 209 0.009 194/209 金海5号 0.081 本玉9号 184/211 211 213 0.051 中科10 213/123 215 0,072 盖玉6号 184/215 219 0.,007 230 0,016 金甜678 230/230 245/257 2415 桂青贮1号 0.034 253 0.373 253/266 先玉335 257 0.064 盏玉16 257/266 259 0,002 PM23 245一277 phi96100y1l 262 0,049 农华101 253/262 266 0.42 先玉335 253/266 273 0,041 金海5 266/273 277 0.018 253/277 鲜玉糯2号 216 0,014 成单22 216/224 222/222 222 0.398 先玉335 PM24 umel536k9 216238 224 0,053 成单22 216/224 233 0.38 郑单958 233/238 238 0,155 郑单958 233/238 24
GB/39914一2021 表B.1续 等位基因扩增片段 参照样品 引物 编号 片段定义/bp 片段频率 扩增片段/bp 名称 范围/bp 名称 160o 0.01 160/173 铁单20 165 165/173 0.329 郑单958 171 0.012 173 0.426 郑单958 165/173 175 0.004 179 0.041 先玉335 165/179 PM25 bnlg1520k1 160195 183 0.009 87 0.012 173/187 正大619 189 0.005 191 0.104 农大108 173/191 193 0.046 195 0.002 川单14 173/195 231 0.673 231/254 农华1o1 246 0.122 辽单527 231/246 PM26 umcl489y3 231一266 254 0.189 231/254 农华1o1 号 266 0.016 231/266 遵糯1 0.406 先玉335 271/294 271 294 0.203 先玉335 271/294 297 0.095 成单22 297/328 PM27 bnlg490y4 271一330 0.018 辽单527 294/301 30l 308 0.014 328 0.214 郑单958 328/328 330 0.049 兴基1o 294/330 0.521 先玉335 176 176/197 182 0.03 号 185 0.007 金玉甜1 185/191 PM28 umc1999y3 176- 1188 200 0.004 号 191 0.101 中科 176/191 197 0.336 先玉335 176/197 号 200 176/200 郑青贮 0.002 270/275 270 0.222 郑单958 275 郑单958 270/275 0.362 农华101 275/279 279 0.163 284 0.149 号 284/287 PM29 umc2115k3 270293 中科4 287 0.098 中科4号 284/287 289 0.002 293 0.005 成单19 270/293 25
GB/T39914一2021 表B.1续 等位基因扩增片段 参照样品 引物 编号 名称 范围/bp 片段定义/bp 片段频率 扩增片段/bp 名称 126 0.571 126/144 先玉 335 0.115 134/144 134 郑单958 PM30 umel429y7 126~144 136 0.037 144 0.277 郑单958 134/144 261 0.005 261/265 鄂玉25 263 0.373 263/275 先玉335 265 0.129 郑单958 265/269 269 0.053 郑单958 265/269 275 0.072 263/275 先玉335 278 0.078 278/297 盖玉16 PM31 261301 28o 0.074 川单14 uale24sk2 263/280 京科 282 0.088 968 275/282 284 0.016 济单 290 0.002 94 278/290 293 0.002 297 0.104 泼单 20 269/297 兴 301l 0.004 l0 263/30l 桂青贮1号 210 0.,002 210/225 222 0.284 郑单958 222/228 25 225/228 0,256 农大108 228 0.071 222/228 郑单958 h282y2 210~255 0.235 234/234 PM32 234 先玉335 239 0.055 万糯1号 239/239 246 0,004 251 0,048 辽单527 234/251 255 0,046 绵单1号 199 0.009 199/205 郑单958 205/207 205 0,163 207 0.277 郑单958 205/207 213 0.016 PM33 umc2160k3 199一244 215 0.194 先玉335 207/215 号 224 0.01l 金玉甜1 224/244 230 0,011 232 0,044 盖玉16 232/244 26
农作物品种真实性和纯度SSR分子标记检测玉米GB/T39914-2021
农作物是人类生存和发展的基础之一，其品种真实性和纯度是影响产量和质量的重要因素。GB/T39914-2021标准是我国针对农作物DNA检测领域的最新标准之一，其中玉米的品种真实性和纯度检测采用了SSR分子标记技术。
SSR（Simple Sequence Repeat）分子标记，也称微卫星标记，是一种常用的分子遗传学工具。它是由短串联重复序列构成的DNA片段，具有多态性、稳定性和高度可重复性等特点，可以作为遗传多样性和品种鉴定的分子标记。
在玉米品种真实性和纯度检测中，通过PCR扩增目标位点，再通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行分离和检测。通过比对样品和模板的扩增产物大小和数量，可以判断玉米品种是否纯度高、真实性强。
相比传统的形态学和生理学方法，SSR分子标记技术具有高度的敏感性和准确性，可以有效避免人为因素的影响，提高检测效率和精度。在玉米育种、种质资源保护和种子生产等领域中具有广泛应用价值。
总的来说，随着DNA检测技术不断发展，农作物品种真实性和纯度的检测也将更加准确、高效、经济。GB/T39914-2021标准下，采用SSR分子标记技术检测玉米品种真实性和纯度，无疑是一种先进的、可靠的检测手段。
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