蜂蜜中十四种喹诺酮类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

蜂蜜中十四种喹诺酮类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T20757一2006 蜂蜜中十四种麾诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Methodforthedeterminationoffourteenquinoone residuesinhomey- LC-MIS-Msmethod 2007-03-01实施 2006-12-31发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20757一2006 蜂蜜中十四种哇诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了蜂蜜中十四种唾诺酮类药物残留量液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于蜂蜜中十四种唾诺酮类药物残留量的测定 本标准的方法检出限:十四种畦诺酮类药物均为2ug/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 (GB/T6379.1一2004,Iso5725-l:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,IsO5725-2;1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T66821992,neqISO3696;1987) 原理 蜂中呤诺酮类药物残留用磷酸盐缓冲溶液(pH=3)提取,过滤后,经OasisHLB或相当的固相 萃取柱净化,用氢氧化铵甲醉溶液洗脱并燕干,残渣用定容液溶解,过0.2m滤膜后,样品溶液供液相 色谱-串联质谱仪测定,外标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为优级纯,水为GB/T6682规定的一级水 4.1甲醇;色谱纯 42乙脖色谱纯 4.3磷酸 4.4乙酸 4.5氢氧化铵 4.6磷酸氢二钠 4.7 磷酸二氢钾 4.8磷酸盐缓冲溶液:0.05mol/L 称取5.68g磷酸氢二钠(4.6)和1.36g磷酸二氢钾(4.7),放人 1000mL烧杯中,加人800mL水溶解,用磷酸(4.3)调至pH=3.0,再用水定容至1000mL 4.9氢氧化铵甲醉溶液:(1十19) 吸取10ml氢氧化铵(4.5)与190mL甲醉(4.1)混合 定容液;乙睛+0.01mol/1.乙酸溶液(1十4) 量取100ml乙睛与400ml.0.01mol/几乙酸溶 液混合 4.11依诺沙星、诺氟沙星、麻保沙星、氟罗沙星、环丙沙星、氧氟沙星、单诺沙星、恩诺沙星、奥比沙星、 沙拉沙星、司帕沙星、双氟沙星、曙唾酸、氟甲唾标准物质:纯度>95%
GB/T20757一2006 4.12唾诺酮标准储备溶液:1lmg/ml 准确称取适量的每种畦诺酮标准物质,用氢氧化铵甲醇溶液 4.9)配成1mg/m的标准储备溶液,该溶液在4C保存可使用6个月 44 13中间浓度唾诺酮混合标准储备溶液:l0mg/L 分别吸取0.1ml标准储备溶液(4.12)放人 10 mL 容量瓶中,用定容液(4.10)定容至刻度 4.14呸诺酮基质混合标准工作溶液吸取不同体积中间浓度混合标准储备溶液(4.13),用空白样品提 取液配成5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL不同浓度的基质混合标准工作溶液 当天配制 4.15 用前分别用6mL 甲醇、10ml水和5ml磷 OasisIHLB周相苹取柱或相当者,500mg.6nml. 酸盐缓冲溶液(4.8)处理 保持柱体湿润 4.16滤膜;0.24m 仪器 5.1液相色谱-串联质谱仪;配有电喷雾离子源 5.2固相萃取装置 5.3氮气浓缩仪 5.4液体混匀器 5.5分析天平;感量0.1 g,0.01 rmg g 5.6真空泵,最大负压80kPa 5.7pH计,渊量精度士0.02. 5.8玻璃贮液器50ml 试样制备与保存 试样的制备 对无结晶的实验室样品,将其搅拌均匀 对有结晶的样品,在密闭情况下,置于不超过60C的水浴 中温热,振荡,待样品全部融化后搅匀,冷却至室温 分出0.5kg作为试样 制备好的试样置于样品瓶 中,密封,并做上标记 试样的保存 将试样于常温下保存 测定步骤 提取 称取5g试样,精确至0.01g 置于150mL三角瓶中,加人30mL磷酸盐缓冲溶液(4.8),于液体 混匀器上快速混匀1min,使试样完全溶解 7.2净化 将塞有玻璃棉的玻璃贮液器连到OasisHLB固相萃取柱(4.15)上,把样液倒人玻璃贮液器(5.8) 中,调节流速<3mL/min使样液通过Oasi、HLB固相萃取柱,待样液完全流出后,分别用5ml水和 5mL甲醇十水(3十7)洗柱,弃去全部流出液 固相萃取柱在65kPa负压下,减压抽干30min.然后用 5mL氢氧化铵甲醇溶液(4.9)洗脱,收集洗脱液于10mL锥形试管中 在50C用氮气浓缩仪吹干 准 确加人1.0mL定容液溶解残渣,过0.2um滤膜后,供液相色谱-串联质谱仪测定 按7.1和7.2操作步骤,制备用于配制系列基质标准工作溶液的样品空白提取液 7.3色谱测定 7.3.1液相色谱条件 色请柱,hersilph3.5m.150mmx2.1mm(内径)或相当者" a b 柱温:40C;
GB/T20757一2006 进样量:40L c 流动相;A;乙睛,B;0.01mol/L乙酸溶液 梯度洗脱条件见表1 表1梯度洗脱条件 时间/min 流速/ml/min) A:乙晴/% B;0.01mol/1乙酸溶液/% 0,00 0.3 85.0 15.0 95.o 4.00 0.3 5.0 8.00 95.o 0.3 5.0 8.01 85.o 15.0 0.3 8,00 0.3 85.0 15,0 7.3.2质谱条件 离子源电喷雾离子源， a b)扫描方式:正离子扫描 检测方式;多反应监测; c d 电喷雾电压;5500V; 雾化气压力:0.083MPa; 气帘气压力:0.069MPa; 辅助气流速;6L/min; g h 离子源温度:500C; 去簇电压;45V; 定性离子对定量离子对,碰撞气能量和碰撞池出口电压见表2 十四种唾诺酮的定性离子对,定量离子对,碰撞气能量和碰撞池出口电压 定性离子对 定量离子对 碰撞气能量 碰撞池出口电压 药物名称 英文名称 /2 n/ 321/234 32 依诺沙星 enoxacin 321/234 18 28 321/257 320/276 26 诺氟沙星 norfloxaein 320/276 18 320/233 36 363/320 麻保沙星 marbofloxacein 363/320 18 363/277 370/326 29 氟罗沙星 fleroxaein 370/326 19 39 370/269 332/288 27 环丙沙星 ciprofloxacin 332/288 19 35 332/245 362/318 29 氧氟沙星 ofloxacin 362/318 19 40 362/261 358/314 27 单诺沙星 danofloxaeinm 358/314 358/283 360/316 29 恩诺沙星 enrofloxaeinm 360/316 19 39 360/245
GB/T20757一2006 表2(续 定性离子对 定量离子对 碰撞气能量 碰撞池出口电压 药物名称 英文名称 m/e) m/:) 396/352 27 奥比沙星 orbifloxacinm 396/352 21 35 396/295 386/342 28 沙拉沙星 sarafloxaeinm 386/342 20 386/299 40 393/349 29 司帕沙星 sparfloxacin 393/349 20 393/292 36 400/356 29 双氟沙星 difloxaeinm 400/356 9 400/299 42 262/244 27 嗯怆酸 oxolinicaeid 262/244 13 县 262/216 262/202 40 氟甲 262/202 flueguin 262/244 28 7.3.3液相色谱-串联质谱测定 用基质混合标准工作溶液(4.14)分别进样,以工作溶液浓度(ng/mL)为横坐标,峰面积为纵坐标 绘制标准工作曲线,用标准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中十四种唾诺酮的响应值均应在仪器测 定的线性范围内 在上述色谱条件和质谱条件下,十四种噎诺酮的参考保留时间见表3 十四种憧诺 酮的标准物质多反应监测(MRM)色谱图参见图A.1 表3十四种隆诺酮参考保留时间 药物名称 保留时间/min 依诺沙星 3,85 诺氟沙星 4.21 4.65 麻保沙星 氟罗沙星 4.98 环丙沙星 5.10 氧氟沙星 5.19 单诺沙星 5,52 恩诺沙星 5,65 奥比沙星 5. ..70 沙拉沙星 5.86 司帕沙星 5.91 双氟沙星 5.93 恶酸 6.57 氟甲峰 7.01 平行试验 按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定
GB/T20757一2006 7.5空白试验 除不称取样品外,均按上述步骤进行 结果计算 结果按式(1)计算: 00o -x X=d -× 000 式中 试样中被测组分残留量,单位为微克每千克(g/kg) -从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL)1 试样溶液定容体积,单位为毫升(mL); 试样溶液所代表试样的质量,单位为克(g) 7 注:计算结果应扣除空白值 精密度 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,其重复性和再现性的 值以95%的可信度来计算 9.1重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,蜂盥中十四种咋诺酮含 量范围及重复性方程见表4 表4含量范围及重复性和再现性方程 药物名称 再现性限R 含量范围/g/kg 重复性限r 依诺沙星 lgR=1.1213lgm一0.61738 2.020.0 lgr=1.010olgm一0.8398 诺氟沙星 2.020.0 lgr=0.9824lgm一l.2982" lgR=0.9984lgm-0.6945 麻保沙星 =0.937 1.2655 1.0068lg-0.562 6l 2.020.0 lgr 8lgmm lgR=1 氟罗沙星 2.020,0 lgr=1.2342lgm lgR=1.0854lgm-0.865 4332 环丙沙星 lgy=1.0544lgm1 1.381 gR=0,.7999lgm一0,5863 2.020.0 氧氟沙星 2.020.0 lgr=0,8264lgm 2088 lgR=1.311llgm-0,9888 单诺沙星 2.020.0 1.0812lgmn 1.3742 8569lgmn 0.719 gR 恩诺沙星 2.020.0 lg"=0.8140lgm-1.0683 lgR=1.1002lgm-0.932 奥比沙星 2.0~20,0 lgr=1.0032lgm-1.3366 lgR=1.2902lgm一0,9265 沙拉沙星 2.020.0 lgr=0.9146lgm一1.2046 lgR=07675lgm一0,589 司帕沙星 2.020.0o -1.0844lgm-1.3444 lgR=0.8562lgm .6052 Igr一 0. 双氟沙星 .0336 2.0一20.0 lgr=0.7067lgm" l. lgR=0.9339lgm-0.5986 嗯咋酸 2.0~20.o lgr=1.0998lgm一1.4398 lgR=0.857olgm-0.6139 941 1.1668 氧甲隆 .0733lgm一0.7792 2.020.0 lgr=0." 1lgm一 lgR=1. 注:川为两次测定值的算术平均值 如果差值超过重复性限r,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 再现性 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R.,蜂蜜中十四种瞎诺酮的 含量范围及再现性方程见表4
GB/T20757?2006 ? A ?? ????(MRM)?? ?????(MRM)??,?A.1 3.85 4.21 .65 6.8e4 7.0e41 4.0e4 6.0e4 3.5e4 6.0e4 ?? 鱣? ?? 5.0e4 3.0e4 5.0e4 2.5e4 4.0e4 2.0e4 3.0e4 1.5e4 2.0e4 2.0e .0e4 1.0e4 5000.0 0.0 0.0 1012 012 t/min /min l/minm 4.98 5.01 5.19 1.8e5 8. 2.0e5 oA .6hsb 7.0e4 .4e5 ? 1.5e5 ? A.et è3 ? 5.0e4 0e5 8.0e4 4Oe4 1.0e5 3.e4 6.0e4 2.0e4 4.0e4 5.0e4 1.Qe 2.0e4 0.0 0.0 0.0 012 10 12 /minm /min /min 5.52 5.70 5.65 1.07eb 5.6e5 5.e5 1.0e5- a.Oe5 45 8.00e4 3S 4.0e51 ±? ?? ?? 6.00e4 3.0e51 2S e 4.0e4 2.0e Te 2.00e4 O l.0e5 B.0e 0.00 0.0 Do 10 12 10 p 10 /min 1/min 1/min 5.86 5,91 5.93 4.Oe5 4.0e5 3.5e5 3.5e5 4.0e5 3.0eb5 3.0e5 3 ?? ?? 2.5e5 ?? 2S5 3.0e5 2.0e 2.0e5 2 1..5e5 1.5e5 3 1.0e5 5.0e4 5.0e4 5,0e4 0.0 10o 12 10 12 1012 /min /min /min 6.57 7.0or 9.0e4 3.0e51 8 0e4 2.5e5 7.e4 6.0e4 2.0e5 Ψ .0e4 1.5e5 L 1.0e5 .0e4 2.4 5.0e4 1.0et 0.0 0.0 1o12/min 12/in ?A.1??????(MRM)??
GB/T20757一2006 B 附录 资料性附录 回 收率 本方法中十四种唯诺酮添加浓度及其平均回收率的试验数据,见表B.1 表B.1十四种呸诺酮添加浓度及其平均回收率的试验数据 药物名称 添加浓度/(ag/ke 平均回收率/(% 2.0 1l0.9 5.0 87.4 依诺沙星 20.0 85.3 50.0 71.3 2.0 80.2 5,0 76.1 诺氟沙星 82.9 20.0 50.0 84.9 88.4 2.o 5.0 89.2 麻保沙星 20.0 86.7 50.0 89.0 2.0 102.4 102.6 5.0 氟罗沙星 20.0 78.6 80.4 50.0 2.0 85.7 5,0 79.9 环丙沙星 20.0 84.3 50.0 80.5 2.o 103.2 5,0 102.5 氧氟沙星 86.0 20.0 50.0 80.7 104.8 2.0 5,0 94.6 单诺沙星 20.0 86.2 50.o 76.7 2.0 97.1 2 5.o 90. 恩诺沙星 20.0 91.3 50.0 91.4
GB/T20757?2006 B.1( ? ?/" ke ?/% 2.o 90.1 5.0 91.0 ±? 20.0 78.3 50.o 82.4 2.0 92.9 5.o 77.7 ?? 20,0 84.9 50.o 84.7 2.0 82.7 5.0 94.0 ?? 20.0 66.3 50.0 79.1 94.8 2.o 5.0 86.1 ?? 20.o 91.6 50.0 93.3 2.0 100.8 5.o 89.8 ? 20.0 101.6 50.o 95.2 2.0 100.1 5.o 87.6 ? 20,0 101.6 50,0 97.6