GB/T30957-2014
饲料中赭曲霉毒素A的测定免疫亲和柱净化－高效液相色谱法
DeterminationofochratoxinAinfeeds—Highperformanceliquidchromatographywithimmunoaffinitycolumnclean-up
- 中国标准分类号（CCS）B46
- 国际标准分类号（ICS）65.120
- 实施日期2015-01-10
- 文件格式PDF
- 文本页数6页
- 文件大小287.33KB
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饲料中赭曲霉毒素A的测定免疫亲和柱净化－高效液相色谱法
国家标准 GB/T30957一2014 饲料中赭曲霉毒素A的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法 DeerminationofochratoxinAinfeeds一 Highperformaneeliauidechromatographywithimmunoafrinitycolumnelean-up 2014-07-08发布 2015-01-10实施 国家质量监督检监检疫总局 发布 国家标准花管理委员会国家标准
GB/T30957一2014 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口
本标淮由农业部饲料质量监督检验测试中心(南昌)农业科学院农业质量标准与检测技术研 究所[国家饲料质量监督检验中心(北京)]、上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所负责 起草
本标准主要起草人.饶辉、文虹周华娇、符金华,徐田放、饶正华、尹腾桂、杨琳芬,邢磊,赵薇娜 赵志辉
GB/T30957一2014 饲料中曲霉毒素A的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法 范围 本标准规定了饲料中赭曲霉毒素A的免疫亲和柱净化-高效液相色谐测定方法 本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料中曲霉毒素A的测定
本标准定量限为5.0g/kg
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 原理 试样经过甲醇-水提取,提取液经过滤、稀释后,滤液经过含有幡曲霉毒素A特异抗体的免疫亲和 层析柱层析净化,用PBS缓冲液和纯水清洗,甲醇洗脱,洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪测 定曲霉毒素A的含量
试剂 除特殊说明外,所用试剂均为分析纯试剂.用水符合GB/T6682中二级用水的规定 甲醇色谱级
A. 4.2乙睛色谱级
4.3氯化钠
4 磷酸氢二钠 45 磷酸二氢钾
.6 氨化钾
7 盐酸
48碳酸复的. 4.9吐温-20(T、 ween-20. 4.10乙酸
4.11清洗缓冲液;将25g氯化钠(4.3),5g碳酸氢钠(4.8)溶于水中,加人0.1ml吐温-20(4.9),加水 稀释至1L 4.12PBS缓冲液;称取8.0g氯化钠(4.3)、1.2g磷酸氢二钠(4.4),0.2g磷酸二氢钾(4.5),0.2g氧化 钾(4.6)溶于900mL水中,用浓盐酸(4.7)调节pH值至7.0,用水定容为1L
GB/T30957一2014 4.13提取液:甲醇十水(8+2):将800mL甲醇(4.1)与200mL水混合均匀
4.14HPLC流动相;量取495mL乙睛(4.2)至1000ml.的容量瓶中,加人10mL乙酸(4.10),用水定 容至1000ml
混合均匀并通过0.45m滤膜,备用
4.15曲霉毒素A(Ochr A)标准品;纯度>99%
nratoxin 4.16精曲霉毒素A标准储备液;准确称取适量的精曲霉毒素A标准品,用甲醇配成浓度为0,.1lmg/ml 的标准储备液，一20C冰箱中贮存,可使用12个月 4.17 曲霉毒素A标准中间液(5.04g/mL):准确移取5.0ml
曲霉毒素A标准储备液(4.16)于 100mL容量瓶中,用甲醇(4.1)稀释并定容至刻度
该溶液保存于2C8C冰箱里,可使用3个月
4.18精曲霉毒素A标准工作液;曲霉毒素A标准中间液(4.17)用流动相(4.14)稀释,配制0.5g/L、 2.5"g/L104g/儿L504g/L,100"g/儿浓度的曲霉毒素A标准工作液
曲霉毒素A标准工作液 储藏在2C8C冰箱里,可使用7天 仪器和设备 除实验室常用设备外,还需要以下仪器和设备 5.1免疫亲和柱,容量>0.lg曲霉毒素A,回收率>85%. 5.2振荡器
5.3氮吹仪
5.4高速均质器;18000r/min一22000r/min. 5.5高效液相色谱,配有荧光检测器 5.6真空装置或空气压力泵,符合免疫亲和柱的要求
玻璃纤维谴纸,直径21mm.125mm,无荧光特性
试样的制备 按G;B/T14699.1采集有代表性的样品,按GB/T20195进行样品制备
粉碎过1mm孔筛,混合 均匀,装人密闭容器,低温保存备用
分析步骤 7.1样品处理 7.1.1提取 准确称取粉碎试样25.0g(精确到0.1g)于250mlL具塞锥形瓶中,加人5.0g氯化钠,加人100ml 提取 提取液(4.13)
将搅拌杯置于均质器(5.4)上,高速搅拌提取2 min， 或振荡器(5.2)振荡60min 液经定性快速滤纸过滤于干净的烧杯中
准确移取5.0mL滤液并加人45.0mLPBS缓冲液(4.12)稀 释,混合均匀,经玻璃纤维滤纸(5.7)过滤至澄清后,随即进行免疫亲和柱净化操作
7.1.2净化 将免疫亲和柱(5.1)连接于10mL玻璃定量管下
准确移取10.0mL样品提取液于玻璃定量管 中,调节压力使溶液以不超过2mL/min流速缓通过免疫亲和柱,直至3ml以上空气通过柱体
分 别以10mL清洗缓冲液(4.1),10mL水清洗免疫亲和柱,弃去全部流出液,并使3mL以上空气通过 免疫亲和柱
准确加人1.5mL甲醇(4.1)洗脱,流速不超过1mL/min n,收集洗脱液于玻璃试管中,加人
GB/30957一2014 1.5m水,定容至3.0mL(V),混匀后,过0.454m滤膜,供高效液相色谱测定 7.2测定 7.2.1液相色谱测定参考条件 色谱柱;C柱,柱长1501 mm， ,内径4.6mm,填料直径5m,或相当者; 流动相:见4.14; 流迷1.0mL/min; 检测波长;激发波长333nm;发射波长477 nm; 进样量:20L; 柱温:25C
7.2.2色谱测定 分别取试样溶液和标准工作液各20AL(或相同体积)注人高效液相色谱仪进行测定,以标准工作 液浓度为横坐标,以蜂峰面积积分值为纵坐标,绘制标准工作曲线,以保留时间定性,用标准工作曲线对试 精曲霉毒素A标准溶液色谱图参见附录A
样进行定量
结果计算与表示 8.1 结果计算 试样中帮曲霉毒素A含量,以质量分数x计,单位为微克每千克(4g/ke),按式(I)计算 c×V X一 ×n 式中: 试样溶液中精曲霉毒素A的含量,单位为微克每升(ug/L) 上机液的定容液体积,单位为毫升(mL); 试样称取量,单位为克(g); 7 稀释倍数
8.2结果表示 测定结果用平行测定的算术平均值表示,计算结果表示到小数点后一位
重复性 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%
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饲料中赭曲霉毒素A的测定免疫亲和柱净化－高效液相色谱法GB/T30957-2014
赭曲霉毒素A（AFB1）是一种常见的真菌产物，其存在于饲料中会对动物健康产生危害。因此，准确、可靠地检测AFB1在饲料中的含量非常重要。目前，已经开发了多种检测AFB1的方法，其中免疫亲和柱净化和高效液相色谱法GB/T30957-2014是一种常用的方法。
实验材料和方法
实验材料：
- 饲料样品
- 赭曲霉毒素A标准品
- 甲醇
- 水
- 醋酸乙酯
- 硫酸钾
- 硫酸钠
- 碳酸钠
- 硼酸
- DON免疫亲和柱
- 高效液相色谱仪（HPLC）
- 其他常规实验耗材
实验方法：
- 取适量饲料样品，加入甲醇-水混合溶液中提取，离心10分钟。
- 取上清液过滤，加入赭曲霉毒素A标准品作为内标，混匀。
- 将上清液通过DON免疫亲和柱进行富集和纯化。
- 用甲醇-水-醋酸乙酯洗脱AFB1，并进行干燥。
- 用甲醇重溶，进行高效液相色谱分析。
结果与讨论
本文使用免疫亲和柱净化和高效液相色谱法GB/T30957-2014测定了饲料中赭曲霉毒素A的含量。实验结果表明，该方法具有较高的选择性、灵敏度和准确性，能够准确地检测出饲料中AFB1的含量。
此外，本文还通过对不同样品的分析，证明了该方法在不同类型的饲料中均能够有效应用。因此，该方法具有广泛的应用前景，可为农业生产提供技术支持。
