GB/T27528-2011
口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法
Real-timeRT-PCRfordetectionoffootandmouthdiseasevirus
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2012-03-01
- 文件格式PDF
- 文本页数7页
- 文件大小306.92KB
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口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法
国家标准 GB/T27528一2011 口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法 Real-timeRT-PCRfordeteetionoffootandmouthdiseasevirus 2011-11-21发布 2012-03-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27528一2011 前 言 本标准的附录A,附录B为规范性附录 本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口
本标准起草单位深圳出人境检验检疫局、检验检疫科学研究院、北京盈九思 科技发展有限公司
本标准主要起草人秦智锋、林祥梅、吴绍强、花群义、卢体康、刘建、陈书堰、吕建强、曾少灵、 詹爱军、韩雪清、孙洁、曹琛福,贾广乐、高小博、陈兵、阮周曦、梅琳、张彩虹,陶虹.
GB/T27528一2011 口蹄疫病毒实时荧光RI-PCR检测方法 范围 本标准规定了口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法
本标准适用于口蹄疫病毒的检测与鉴定
规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款
凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本
凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 GB/T18935口蹄疫诊断技术 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1193基因检验实验室技术要求 缩略语 下列缩略语适用于本标准
Ct值:循环闵值(cyclethreshold
试剂耗材和仪器设备 4.1试剂耗材 除非另有说明,在检测中使用的试剂均为分析纯,实验室用水应符合GB/T6682的要求
口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR试剂:一20C保存,见附录A
引物和探针序列 上游引物(FMDV-F)序列为:5'ACTGGGTTTTACAAACCTGTGA3'
下游引物(FMDV-R)序列为;5'GcGAGTccTGcCAcGGA3' TaqMan探针(FMDV-Pb)序列为:5'TCCcTTTGCACGCCGTGGGAC3',其5'端和3'端分别标记 FAM和BHQ. 4.1.4DEPC处理水;见附录B
推荐购买商品化DEPC处理的无DNA酶和RNA酶的水
4.1.5氯仿;分析纯,常温保存
4.1.6异丙醉;分析纯,使用前预冷至一20C
4.1.775%乙醉用DEPC水和无水乙醉配制,使用前预冷至一20c 41. 8 石英砂;市售化学纯,121C,15min高压灭菌后备用
41.90.01mol/儿Pps.pH7.6一7.8,见附录 4.1.10阳性对照为灭活疫苗毒或组织培养灭活毒，-20C保存备用
阴性对照样品可采用健康的猪 或牛的组织材料
4.2主要仪器设备 4.2.1荧光PCR检测仪 2 4.2. 高速台式冷冻离心机:可控温至4C,离心速度可达12000g以上
GB/T27528一2011 4.2.3生物安全柜
采样和样品前处理 5.1样品采集,保存及运输 按照GB/T18088和GB/T18935的要求进行 5.2样品制备 5.2.1样品的制备应符合GB19489规定
5.2.2用无菌的手术刀采取动物机体组织(如舌、鼻、蹄水泡皮)0.2g~1.0g置研钵中,加人等量灭菌 石英砂充分研磨
其他机体组织(如淋巴结,扁桃体,肌肉等)除去包膜和其他结缔组织,选取内部实质 部分,置研钵中,加人石英砂充分研磨
然后按照1:5比例加人0.01mol/1PBS(pH7.6~7.8),4C 浸泡过夜或者一0七反复冻融2次,每次30mn
然后4仑80oE离心5mn. 液体样品如水泡液或者食道咽部黏液(O-P液)不必经过研磨或者冻融处理,直接进行下一步
核酸提取 核酸提取要求 6 核酸提取应按照SN/T1193进行
6.2传统酚氧仿法抽提核酸 6.2.1取灭菌的1.5mL离心管,做好标识
每管加人600L裂解液,分别加人被检样本、阴性对照、阳性对照各200L,再加人200AlL氯 仿,混匀器上振荡混匀5s,于4C12000g离心15min. 取灭菌的1.5mL离心管,加人一20C预冷400lL异丙醇,吸取本标准6.2各管中的上清液转 移至相应的管中,避免吸出中间层,颠倒混匀
6.2. 于4C12000g离心15min,弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体;加人600ML.75%预冷乙醇， 颠倒洗涤
于4C12000g离心10min,弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体
6.2.5 100o离心10s,用微量加样器将其吸干,室温干燥5min" 10min 6.2.7加人15ALDEPC水,溶解管底的RNA,5000g离心5s,冰上保存备用,若需长期保存应放置 70C冰箱
6.3核酸提取等效方法 口蹄疫病毒核酸提取也可以采用等效RNA提取试剂及方法如采用自动化核酸抽提仪和配套核 酸抽提试剂进行核酸抽提
实时荧光R-PCR检测 反应液的配制 配制每个PCR反应混合液:实时荧光RT-PCR反应液14.5AL，Taq酶0.25L,反转录酶 0.25wl
将以上PCR反应试剂按使用量吸取到一个离心管中,充分混匀,然后在每个CR管中分装15L 转移至样本处理区 7.2加样 在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加人已提取好的核酸10L,盖上管盖,将PCR管放 人荧光PCR检测仪内,记录样本放置顺序
GB/T27528一2011 7.3PCR扩增检测 7.3.1反应条件设定 min,95C5min
第一步;42301 第二步;9510s,55C1min, n,7230s,5个循环 第三步;95C5s,6030s,40个循环,60C时设置采集荧光 7.3.2荧光素设定 RReportDye设定为FAM.,QuenchDye都设定为BHQ,Referencedye设定为Non One
结果判定 8.1判定前的设置 综合分析仪器给出的各项结果,基线以仪器给出的默认值作为参考,闵值设定原则以阔值线刚好超 过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准.,具体根帮仪然嗓声悄况进行调整,选择FAMM通道进行 分析
8.2试验成立判定 选用FAM通道进行分析,阳性对照样品有对数扩增曲线,而且C值二30,阴性对照没有对数扩增 曲线,而且ct值为无,二者均成立才可判定试验成立,否则试验无效
8.3阳性判定 C值<30的样本为阳性,表明口蹄疫病毒核酸阳性
阴性判定 C值显示为无的样本为阴性样本,表明口蹄疫病毒核酸阴性
8.5可疑判定 如果30
GB/T27528一2011 附 录 B 规范性附录 溶液的配制 B.1DEPC水 每升三蒸水中加人1nmlLDEPC,用力摇匀,使DEPC充分混匀在水中,37C放置12h以上,再经 121C15min高压灭菌备用
B.20.01mol/LPBs(pH7.6~7.8 磷酸氢二钠(Na,HPO12H,(O) 3.0g 磷酸二氢钾(KHPO 0.2g 氯化钾(KCD) 0.2g 氯化钠(NaCD) 8g 加三蒸去离子水定容至1000mL.,完全溶解后用3mol/儿的Na(OH调pH为7.67.8
经 121C,l5min高压灭菌,室温保存
口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法GB/T27528-2011
口蹄疫病毒是一种急性高热传染病，对猪、牛、羊等反刍动物造成威胁。在疫情爆发期间，及时准确地检测并隔离病毒是关键。为此，国家制定了GB/T27528-2011标准，规定了实时荧光RT-PCR检测方法。
实时荧光RT-PCR技术是一种基于核酸检测的分子诊断技术，具有灵敏度高、特异性强、快速准确等优点。该技术可通过检测病毒RNA的存在与否，确定样本中是否存在口蹄疫病毒。
GB/T27528-2011标准规定了实时荧光RT-PCR检测方法应该具有的条件和要求。首先，要求实时荧光RT-PCR检测方法必须具备高度敏感性和特异性，以确保检测结果的可靠性。其次，要求检测过程中应该采取严格的防污染措施，避免样本交叉感染。同时，还规定了检测时间、温度和荧光强度等参数的范围和要求。
对于实时荧光RT-PCR检测方法的操作流程，主要包括以下步骤：
- 提取RNA：将样本中的核酸提取出来，并进行纯化处理。
- 逆转录：将RNA转录成cDNA，以便后续的PCR反应。
- PCR扩增：使用引物和荧光探针扩增目标基因片段，并记录荧光信号变化情况。
- 数据分析：根据荧光信号变化情况，确定样本中是否存在口蹄疫病毒。
总之，实时荧光RT-PCR检测方法是一种快速、准确、可靠的口蹄疫病毒检测技术。GB/T27528-2011标准的制定和实施，为该技术的规范应用提供了保障。
