人体外周血中循环游离DNA浓度检测基于Alu序列实时荧光PCR法

人体外周血中循环游离DNA浓度检测基于Alu序列实时荧光PCR法

国家标准 GB/T38165一2019 人体外周血中循环游离DNA浓度检测 基于Alu序列实时荧光PCR法 Deteetionofeireulatingcel-freeDNAconeentrationinhumanperipheralboo Real-timePCRmethodbasedonAlusequence 2019-10-18发布 2019-10-18实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/38165一2019 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口 本标准起草单位:;成都中医药大学、四川省肿瘤医院、上海市计量测试技术研究院 本标准主要起草人:何洋、肖洪涛、宋琪、李燕、闻艳丽、冷平、刘刚、李东梅
GB/38165一2019 人体外周血中循环游离DNA浓度检测 基于Alu序列实时荧光PCR法 范围 本标准规定了人体外周血中循环游离脱氧核糖核酸(DNA)基于Alu序列的实时荧光聚合酶链式 反应(PCR)定量检测方法 本标准适用于循环游离DNA样品中Al序列的定量检测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 循环游离DNAeirculatingcelI-freeDNA;cDNA 血液中来源于细胞凋亡和坏死的细胞外游离状态的短片段DNA 3.2 实时荧光CRreal-timePCR 在PCR反应体系中加人荧光基团,通过荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程,实现对起始 模板的定量及定性分析 3.3 Ct值ceyclethreshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的闵值时所经历的循环数 3.4 Al序列Alsegenee 散在分布于灵长类动物基因组中的中度重复序列 注:A序列具有70%一98%同源性,占人类基因组序列的5%~10%,每个元件长度约为300bp 原理 以提取的外周血循环游离DNA作为检测目标样品,以符合要求的人基因组DNA定量标准物质为 标准品,采用实时荧光PCR技术,设计特异性引物分别扩增Alu序列中长度为115bp和219bp的片 段,以标准品起始模板DNA浓度的对数为横坐标,Ct值为纵坐标,制作标准曲线 根据标准曲线方程 计算样品中的Alu序列拷贝数，结果用copies/L表示
GB/T38165一2019 5 引物 扩增Alu序列引物序列参见表1 表1引物序列 引物名称 序列(5'-3) 碱基数 产物长度/p Aul15F CCTGAGGTCAGGAGTTcGAG 20 115 Alul15R CCCGAGTAGCTGGGATTACA 20 Au219F CACGcCTGTAATCCCAGCACTTT 23 219 Alu219R ATCTCGGCTCAC'TGCAACCTCC 22 6 试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯 试验用水符合GB/T6682中一级水的要求 6.1循环游离DNA提取试剂盒 推荐使用基于磁珠法的循环游离DNA提取试剂盒 6.2实时荧光CR反应混合液 20AL反应体系含1U~2U的TaDNA聚合酶、1×PCR缓冲液,2.0mmol/L的Mg+,0,2U UNG酶(尿啼嚏-N-糖基化酶),0.2mmol/L的d(A,C,G)TPs(dATP为脱氧腺苷三磷酸,dCTP为脱 氧胞苷三磷酸,dGTP为脱氧鸟苷三磷酸),0.2 nol/L.dUTP(脱氧尿苷三磷酸)SYBRGreenI荧光 mm 染料 或者仪器配套的等效SYBRGreen法的实时荧光PCR反应混合液 6.3DNA标准物质 可定量Au序列拷贝数的DNA标准物质,用于建立样品定量检测所需的标准曲线 6.4参比染料(ROX) 根据具体仪器需求决定使用与否 仪器设备 7.1实时荧光PCR仪 7.2恒温金属浴 7.3高速离心机 7.4微量移液器;0.,5A儿L~104L,10L100L、,20lL200AL,100l1000L 8 检验步骤 8.1循环游离NA提取 循环游离DNA按下列步骤提取:
GB/38165一2019 2mL人体外周血于4C以1600×g离心10 min,离心后将上清转移到1.5mL的离心管中， a 避免吸到中间层的白细胞; b 再次以4C16000X区离心10min去除残余细胞-将上清转人新的离心管中,即得所需的 血浆; 按照每500L的血浆中加人1ml结合缓冲液(Bindingbuffer)35L.204g/aL)蛋白酶K min2min; 60AL.(14g/aL RNA比例加人试剂,混匀后于室温放置1" carrier d 将上述混合样品于10000×g,4C离心5min n,吸取上清到另一个新1.5ml离心管中,然后加 人10AL微型磁珠,室温,混匀15min一20min; 将上一步产物分装到1.5mL 离心管中,放于磁力架上,静置1min~2min,吸去废液; fD 加人洗涤缓冲液500AL,混匀后放于磁力架上,静置1 min2min,吸去废液; 加人70%乙醉500AlL混匀后放于磁力架上,静置1min~2min,吸去废液; g h加人40AlTE缓冲液,55C金属浴10min每30混匀一次); mn.收集游液至新的离心管中,即得到循环游离DNA nmin2min 放于磁力架上,静置1 提取后的循环游离DNA样品应立即开展后续的实时荧光PCR扩增试验 j 注，可使用磁珠法或其他等效方法提取循环游离DNA 8.2DNA标准品工作液的配制 取DNA标准物质制备标准品工作液 用非接触式超声波破碎仪将DNA标准物质按超声功率 280w、超声时间5s,间隙时间5s、总工作时间20min的程序片段化为300bp500bp片段,用一级 水按照表2方法进行梯度稀释 注1:DNA标准物质片段化程序可根据实际使用的仪器进行调整 注2超声片段化后,可经过1.5%琼脂糖凝胶电冰检测DNA片段化范围在300bp一500 bp 表2DNA标准品工作液配制方法 DNA标准品工作浓度 配制方法 x×10'e 取10l标准物质母液至90l水中 'copies/L X×10copies/AL 取10ALX×10'c0 opies/L标准品工作液至90AL.水中 X×10'copies/A 取10lX×10copies/L标准品工作液至90L水中 取10LX×10'copies/L标准品工作液至90L水中 X×10copies/AL X×10-'copies/l 取10LX×10"copies/L标准品工作液至90L水中 注x为实际应用的DNA标准物质的赋值,DNA标准品浓度按此进行计算 8.3实时荧光PCR扩增 8.3.1实时荧光CR反应体系 本方法采用SYBRGreen法,按表3配制反应体系,各样品配制3个复孔,加样过程先将除DNA模 板以外的各组分预混合,分装到荧光定量PCR反应孔中19AL/孔,最后加人标准品或待测样品1L 孔,加好后盖紧盖子,短暂离心,立刻进行PCR扩增
GB/T38165一2019 表3实时荧光PCR扩增体系(总体积20L 体系组分 加样量/wl 实时荧光PCR反应混合液(2× 10 PCR上游引物(10mmol/I) 0,4 PCR下游引物(10mmol/L) 0.4 -级水 8.,2 DNA模板(标准品或待测样品 8.3.2实时荧光PCR反应程序 将配制好的PCR反应体系放人实时荧光PCR仪,按表4的反应程序扩增 表4实时荧光CR扩增反应程序 步骤3(40个循环 步骤11个循环) 步骤2(1个循环) 变性环节 退火延伸环节(采集荧光 50C 94 94 60 2min 10min 30 注:可根据不同品牌预混液、仪器设备说明书要求对程序进行调整 质量控制 9 所有样品设3个重复,根据检测数值的取舍标准[如下a),b)]选择有效孔 a 标准曲线上各数据点复孔,可根据标准曲线线性关系的好坏来判断是否舍去,可舍去明显影响 标准曲线相关性(使N'">0.99)的复孔数掘 整条曲线上舍去的复孔数不得超过3个. b 当待测样品各复孔间检测Ct值的标准差大于0.5时,该数据应重新检测 扩增效率应在70%110%之间; 标准曲线的相关系数R'>0.99; 空白对照:Ct值>30.0,若空白对照Ct值小于30.0可采用脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)处理实时 荧光PCR反应混合液和试验用水,灭活DNaseI后重新检测 10 结果计算 采用标准曲线法,对结果进行定量分析,直接测得各稀释梯度标准物质的Ct值,以Ct值为纵坐标 各稀释梯度标准物质浓度的对数(IgX.)为横坐标作图,得到标准曲线和线性回归方程,最后将待测样 品的Ct值带人式(1) 计算出待测样品的Au序列115bp片段和Alu序列219bp片段的拷贝数 X =M×(1十E) 式中: X -样品初始浓度,单位为拷贝数每微升(copies/aL) M -荧光阔值,基线内3个15个循环荧光信号标准差的10倍
GB/38165一2019 E 扩增效率,计算方法为已=10-1Mp一1,slope为标准曲线斜率 检测过程中生物安全措施 按照GB/T19489的规定执行

人体外周血中循环游离DNA浓度检测基于Alu序列实时荧光PCR法GB/T38165-2019

循环游离DNA是指分布于血液中、不与血细胞相结合的DNA分子。循环游离DNA可以通过血液采集和简单的离心操作得到，具有非创伤性、可重复采集、样品来源广泛等优点，因此被广泛应用于临床诊断和疾病监测领域。

Alu序列是人类基因组中最常见的重复序列之一，约占据了整个人类基因组的10%。由于循环游离DNA中含有大量的Alu序列，因此Alu序列成为了循环游离DNA检测的重要靶标，可以有效地评估循环游离DNA在人体中的浓度水平。

实时荧光PCR技术是一种快速、灵敏、特异的分子生物学技术。基于Alu序列的实时荧光PCR技术可以在单个PCR反应中同时完成DNA扩增和检测过程，并且能够定量分析Alu序列的存在情况，从而准确计算出循环游离DNA的浓度水平。

GB/T38165-2019标准是我国在基于Alu序列实时荧光PCR技术应用于人体外周血中循环游离DNA浓度检测方面的第一个国家标准。该标准规定了基于Alu序列实时荧光PCR技术在样品处理、反应条件、数据分析等方面的各项要求和指导原则，为循环游离DNA浓度检测提供了重要的技术支持。

总之，基于Alu序列实时荧光PCR技术是一种快速、灵敏、特异的循环游离DNA浓度检测方法，已被列入GB/T38165-2019标准。该技术对于临床诊断、疾病监测等方面具有重要意义。

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2022/7/28 17:26:35 现行