动物源性饲料中马、驴源性成分定性检测方法PCR方法

动物源性饲料中马、驴源性成分定性检测方法PCR方法

国家标准 GB/T21107一2007 动物源性饲料中马、驴源性成分 定性检测方法PCR方法 dentifieationofhorseanddonkeyderivedmaterialsinanimaloriginated eedlstufrs一rCRmethoa 2007-10-24发布 2008-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T21107一2007 前 言 本标准的附录A为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口 本标准起草单位:深圳出人境检验检疫局、检验检疫科学研究院、中华人民共 和国辽宁出人境检验检疫局、青岛出人境检验检疫局 本标准主要起草人;宗卉、曾少灵、温燕辉,徐宝梁、高宏伟、陈颖、吴亚君、郑秋月、曹际娟 本标准首次发布
GB/T21107一2007 动物源性饲料中马、驴源性成分 定性检测方法PCR方法 范围 本标准规定了动物源性饲料中马、驴(Equoidea)源性成分检测的PCR方法,该检测方法的检出限 为0.1%质量分数). 本标准适用于动物源性饲料中马、驴源性成分的定性检测 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样(GB/T14699.1一2005,ISO6497:2002,IDT) SN/T1193基因检验实验室技术要求 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 聚合酶链式反应polymerasechainreaction;CR 用于扩增位于两段已知序列之间DNA(deoxyribonuceleosideaaeid,脱氧核糖核酸)的方法 模板 DNA经过高温变性成单链,在DNA聚合酶和适宜的温度下,两条互不互补的寡核苷酸片段即引物分 别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火,接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTP deoxyribonueleosidetriphosphate,脱氧核苷酸三磷酸)为底物,使退火引物得以延伸,如此反复变性、 退火和DNA合成这一循环,使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增，经25个一30个 扩增循环,扩增倍数达到约10 原理 利用裂解液破碎细胞,三氯甲烧抽提蛋白质,异丙醉沉淀得到NAi以提取的NA为模板进行 PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物;应用限制性内切酶酶切反应进行确证 试剂和材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂,实验用水符合GB6682的要求 马、驴源性成分检测用引物(对)序列为 5'tgcceacagttggatacateac3 5'atts tgagattaggegattgtt3 2 5. TaqDNA聚合酶(Ther ,水生栖热菌. 2rmusaquaticu， 限制性内切酶:Suu3A酶,A/uI酶 4 5. dNTP.dATP(doxsysdenosinetriphopharte,脱氧腺苷三磷酸),.dirTP(deoxsythymiadinetriphos
GB/T21107?2007 phate,),dCTP(deoxyeytidinetriphosphate,)dGTP(deoxyguanosine triphosphate, 5.5?;? 5.6?? 5.7? 5.8 5.970% 5. 10??(100bp?2000bp)(bp:basepair , 5.11??;1%cTAB(cetyltrithyla lammoniumbromide,???),0.05mol/I.Tris HClpH8.0)[Tris-;trishydroxymethyIaminomethane,??)],0.7mol/LNaCl 0.01mol/LEDTApH8.0)(ethylenediaminetetraacetieaeid?). 5.12TE?Tris-HClEDTA?);10mmol/LTrisHClpH8.0)1mmol/LEDTA pH8.0) 5.1310PCR?;l00mmol/LKCI,l60mmol/L.(NH,)SO,,20mmol/MgSO,200mmol/L Tris-HCIpH8.8),1%TritonX-100(toetylphenoxypolyethoxyethanol,?) nallumin,??嵰). mg/mlBSAbovineserum ??-Tis54g,27.5g.0.5nmeal1TE?(pH8.0)20mL.,?1000mL;? 5.14 ?10?? ??10mg/ml?? 5.15 55. 16?;0.25%?,40%(?)? 5.17?л?:l0nmnmol/1Tis-HCl(pH7.5),10mmmol/MgC,50mmol/LNaC,0.1mg/mlISA 豸 6.1DNA?? 6.2?(12000g) 6.3?????? 6.4??(0.1aL?2l,0.5lL10AL,2L20l,l0l100l,20l?200aL 200l1000AL). 6.5?? 6.6? 6.7pH? 6 ?? 6 ?(0.01g). ??? GB/T14699.1,??,???á 鲽 8 ?DNA? ?(?20??200mg,60??100g,l00??50mg)1.5ml ?,600L800L.??,65C30min,?????;12000g5min;? ??,400l??(24?1),;12000g5min,??;0.8 ,;12000g5min,?;70%???,;50LTE,?
GB/T21107一2007 也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA 8.2DNA浓度和纯度的测定 取5AlLDNA溶液,用ddH.O(doubledistiled water,双蒸水)稀释至1ml,使用核酸蛋白分析仪 或紫外分光光度计检测260nm和280nm处的吸光值A和An DNA的浓度按式(1)计算 (1 A×N×50/1000 式中: -DNA浓度,单位为微克每微升4g/L):; 260nm处的吸光值; N -核酸稀释倍数 当A/A比值为1.71.9之间时,适宜于PCR扩增 8.3PCR扩增 50l反应体系;l0XPCR缓冲液5l,dNTPs(5mmol/L)ll、引物对(5Amol/I)各2AlTal DNA聚合酶(5U/AL)0.5L,模板DNA(100ng士50ngDNA)10AL,ddH.O31.5L 反应条件:PCR反应条件随仪器不同略有改变 94C预变性1min31 min 94C变性30《0. 57C退火30s60s,72C延伸30s一60s,30个循环 72C延伸5min 4C保存 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照 用已知含马或驴源性成分的样品作阳性对照 用已知不含马和驴源性成分的样品作阴性对照,用等体积的ddHO代替模板DNA作空白对照 eR扩增产物电泳检测 取2.0g琼脂糖，于100ml电泳缓冲液中加热,充分熔化,加人澳化乙锭贮存液至终浓度为 p/mL.制胶 在电泳槽中加人电泳缓冲液,使液面刚刚没过凝散 将5L一8LIcR扩增产物 0.5 分别和适量加样缓冲液混合,点样 9V/c恒压电泳,至澳酚蓝指示剂迁移至凝胶中部 紫外检测仪 下观察电泳结果并记录 限制性内切酶酶切及产物电泳检测 8.5 PCR扩增产物电泳检测结果阳性,进行限制性内切酶酶切反应 反应体系(0L)sSaa3A酶1L.(10U/L),酶切缓冲液5L.PR扩增产物20pL.ddHo 24l 充分混匀反应液,37C水浴1h,65C水浴5min终止酶切反应 酶切完成后电泳,方法见8.4 结果判断与表述 9.1CR扩增产物电泳检测结果 马和驴源性成分的PCR扩增产物大小均为294bp(序列参考附录A). 9.2限制性内切酶酶切电泳检测结果 马源性成分的PCR扩增产物经Sau3A限制性内切酶酶切后,片段大小为226bp和68bp 驴源性成分的PCR扩增产物经AlaI限制性内切酶酶切后,片段大小为113p和181bp 9 结果表述 3 PCR扩增产物电泳检测结果阴性者判为不含有马、驴源性成分,表述为未检出马、驴源性成分 PCR扩增产物电泳检测结果阳性,限制性内切酶酶切产物片段大小正确,判为含有马或驴源性成 分,表述为检出马或驴源性成分 检测过程中防止交叉污染的措施 1 按照SN/T1193执行 11 废弃物处理 检测过程中的废弃物,收集后在焚烧炉中焚烧处理
GB/T21107一2007 附录 A 资料性附录 PCR产物测序结果 马:TGCCACAGTTGGATACATCAACATGATTTATTAATATcGTcTCAATAATc cTAACTcTATTTATTGTATTTCcAACTAAAAATcTCAAAGcACTccTATcc GACACACcCCAGAACTAAAGACAACCAAAATAACAAAACACTATGCCCCT GAGAATCAAAATGAACGAAAATcTATTcGAATCTTTcCGCTAcccCCAACAA TAGTAGGcCTccCTATTGTAATTcTGATCATCATATTTccCAGCATcCTA TTcCcccTCAccCAAccGACTAATCAACAATCGcCTAATcTCAAT 驴:TGCCACAGTTGGATACATCAACATGATrTTATTAATATcGTCTCAATAATC CTAACTCTATTTATTGTATTcCAACTAAAAATTTCAAAGCACTCTTATcCc AATACAcCCAGAAGCTAAAACAACTAAAATAGCTAAACGCCTTAccCCTT GAGAATCAAAATGAACGAAAATcTATTcGccTCTTTcGCTAcccCAACAA TAATAGGCCTccCTATTGTAATcCTAATCATTATATTccCCAGCATCCTA TTTCCCTCATCCAACCGACTAATTAACAATCGCCTAATCTCAAT