传染性造血器官坏死病诊断规程

传染性造血器官坏死病诊断规程

国家标准 GB/T15805.2一2017 代替GB/T15805.2一2008 传染性造血器官坏死病诊断规程 Diagnosisofinfetioshaematopoieticneersis 2017-11-01发布 2018-05-01实施 中华人民共利国国家质量监督检验检疙总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB;/T15805.2一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准代替GB/T15805.2一2008《鱼类检疫方法第2部分:传染性造血器官坏死病毒 IHNV)》 本标准与GB/T15805.2一2008相比,除编辑性修改外,主要技术变化如下 修改了标准名称; -增加了缩略语(见第3章); 删除了PCR扩增IHNV786bp,套式PCR扩增IHNV323bp方法(见2008年版3.7); -增加了扩增IHNV693bp的方法(见4.10); 增加了酶联免疫吸附试验(见8.3); -增加了间接免疫荧光抗体试验(见8.4); 增加了综合判定《见第9章) -增加了传染性造血器官坏死病(IHN)(见附录C) 本标准由农业部提出 本标准由全国水产标准化技术委员会(sAc/Tc156)归口. 本标准起草单位;浙江省宁波市海祥与渔业研究院,深圳市检验检疫科学研究院、全国水产技术推 广总站、北京出人境检验检疫局 本标准主要起草人:王建平、沈伟良、高隆英、张利峰、吴雄飞、江育林、陈爱平、乐韵 本标准代替GB/T15805.22008. 本标准所代替标准历次版本发布情况为 GB/T15805.1一1995; GB/T15805.22008
GB;/T15805.2一2017 传染性造血器官坏死病诊断规程 范围 本标准规定了传染性造血器官坏死病毒经细胞分离培养后通过逆转录聚合酶链式反应、酶联免疫 吸附试验和间接免疫荧光抗体试验鉴定的方法 本标准适用于传染性造血器官坏死病的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 缩略语 下列缩略语适用于本文件 CPE:细胞病变效应(eytopathieeffect) e-linkedimmunosorbentassay ELISA:酶联免疫吸附试验(enzyme EPC,鲤上皮瘤细胞系(epithelionm mapapulosum eypriniceline) FCS胎牛血清(fetalcalfserum FHM胖头鳞肌肉细胞系(atheadmonnowcellline) G蛋白:糖蛋白(gly coprotein HEPES;4-胫乙基哌嗓乙碱酸[4(2-hydroxyethyl piperazine-l-ethanesulfonicacid indirectimmunofluorescentantibodytest FAT;间接免疫荧光抗体试验(i IHN;传染性造血器官坏死病(i nfectioushaematopoieticnecros1s haematopoieticnecrosisvirus) IHNV:传染性造血器官坏死病毒(infectious transcriptionpolymerasechainreaction RT-PCR:逆转录-聚合酶链式反应(reverser PBS;磷酸缓冲盐溶液(PhosphateBuferSaline) PBST;磷酸缓冲盐吐温溶液(PhosphateBufferSalin-Tween) ChainReaction) PCR:聚合酶链式反应(Polymerase )resceinisothiocyanate FITC:异硫氮酸荧光素(luore 试剂和材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂 4.1水:GB/T6682中一级水,核酸抽提和RT-PCR应使用无RNA酶的去离子水 4.2IHNV参考株:由国家主管部门指定机构提供
GB/T15805.2一2017 4.3鱼类细胞系;EPC,FHM 4.4细胞生长液;用Earle'、平衡盐的M199培养基配制,另加10%胎牛血清(FcS) 4.5细胞维持液:用Earle'、平衡盐的M199培养基配制,另加2%FCS. 4.6细胞消化液;见A.1 4.7HEPES(N-2-胫乙基听嗓-N'-2-乙碱酸》 4.8 Iaq酶;一20C保存，避免反复冻融或温度剧烈变化. mmol/L 4.9dNTP:含dCTP,dGTP,dATP,dTTP各10 4.10引物;依据IHNV糖蛋白(G蛋白)基因片段序列设计引物,扩增其中693bp片段(参见附录B) 正向引物F1;5'-AGA-GATCCC-TAC-ACCAGAGAC-3' 反向引物R2:5'-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3' 4.11无水乙醉;分析纯,使用前预冷到一20C 4.12AMV逆转录酶;-20C保存,避免反复冻融或温度剧烈变化 4.13RN群排制剂一)七保存，避免反复冻脆或温度剧烈变化 4.14逆转录酶缓冲液和Taq酶缓冲液:分别见A.2、A.3 DNA分子量标准(DNAMarker). 4.15 4.16琼脂糖 4.17TBE电泳缓冲液;见A.4 .18包被稀释液，002mal/L.,pH一9G的碳酸盐缓冲液(见A. 4.19羊抗IHNv免疫球蛋白(Ig);由动物防疫管理部门指定单位提供 4.20鼠抗IHHNV的单克隆抗体;由动物防疫管理部门指定单位提供 4.21辣根过氧化物酶标记的抗鼠抗体 4.22封闭液 4.24FITC标记的抗鼠抗体 4.25样品缓冲液;见A.6 4.26氯化镁溶液;见A.7 S 器材和设备 5.124孔、96孔细胞培养板、细胞培养瓶 5.2倒置荧光显微镜 5.3恒温培养箱 5.4冰箱 5.5微量可调移液器及吸头 5.6离心机和离心管 57 PCR扩增仪 5.8水平电泳仪 5.9紫外透射仪或凝胶成像仪 5.10高压灭菌锅 5.11水浴锅 5.12制冰机 5.13磁力搅拌器 5.14培养液过滤器 5.15酶标仪
GB/T15805.2一2017 8.1.3病毒分离结果判定 在空白对照细胞正常,阳性对照出现CPE的情况下,样品接种细胞并盲传后均无CPE出现,判为 阴性;如有CPE出现,为病毒分离阳性,需要RT-PCR反应或者ELISA或者IFAT方法进行IHNV 鉴定 8.2RI-PCR 8.2.1RNA提取 8.2.1.1样品处理 将450L细胞悬液放人1.5mL的离心管,再加人450AL十六烧基三甲基澳化胺溶液见A.8)并 混匀 25C作用2h2.5h 8.2.1.2RNA抽提 在含有样品的离心管中加人600AL抽提液I(见A.9),用力混合至少30s 12000r/min离心 5min,小心取上层水相(约800L) 再加人700L抽提液I(见A.10),用力混合至少30s 12000r/min离心5min,小心取上层水相(约600AL) 再加人一20丫预冷的1.5倍体积的无水乙醇 (约900AL),倒置数次混匀后， 一20C8h以上沉淀核酸 12000r/min离心30min小心弃去上清 干燥后加1lAL水溶解,用作PCR模板 也可以采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化RNA抽提试剂盒;提取的RNA尽快进行 PCR扩增;若需长期保存,应当放在酒精里 8.2.2RT-PCR扩增 8.2.2.1cDNA合成 在PCR管中加人10"L模板、2.54L反向引物R2(40pmol/AL),2.5AL水使总体积为15L 置 于70C反应5min 立即冰浴,低速离心5s,将液体手在底部 再向反应管中加人5L.逆转录酶缓冲 液(5倍浓缩液),2ALdNTP(10mmol/L),0.5LRNA酶抑制剂(20U/AL)、1AlLAMV逆转录酶 10U/L)和水1.5AL 总体积25ML,42C反应60min以合成模板的cDNA 同时设立阳性对照、 阴性对照、以及DEPC处理的水为模板的空白对照 8.2.2.2DNA扩增 在上述反应管中再继续加人9ALTaq酶缓冲液(10倍浓缩液),9l25mmol/1的氯化镁溶液 NTP2AL(10nmmol/L),2AL正向引物(40pmol/L)、2L 反向引物(40pmol/L)、1AlTaq酶 10U/L),加水到总体积为100AL 如果PCR仪没有热盖,每管还需加人50AL矿物油 混匀后短 时间低速离心,让试剂集中在底部 再将反应管置于PCR扩增仪 95C1min一50C！min-72 1min;35个循环,72C延伸10min,最后4C保温 8.2.3琼脂糖电泳 将TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液)稀释10倍,制备1.5%的琼脂糖(含10mg/mL核酸染色剂,见 A.1l1)凝胶 将凝胶放人水平电泳槽,使电泳缓冲液刚好淹没胶面,将6LPCR扩增产物和2L样品 缓冲液混匀后加人样品孔 在电泳时设立DNA分子量标准作对照 5V/em电泳,当嗅酚蓝到达底部 时停止,在紫外透射仪或凝胶成像仪下观察
GB;/T15805.2一2017 8.2.4结果判定 在阴性对照和空白对照均无扩增出693bp的DNA片段,阳性对照扩增出693bp的DNA片段情 况下,待测样品RT-PCR扩增出693pDNA片段,并经测序验证,结果判定为阳性 无扩增片段或扩 增片段大小不是693bp范围的均判为PCR阴性 8.3酶联免疫吸附试验 8.3.1用0.02mol/L的碳酸盐缓冲液(pH=9.6)按说明书要求稀释纯化的羊抗IHNV的免疫球蛋白 Ig)(100L/孔),包被96孔酶标板 8.3.2包被后的酶标板4C孵育过夜 8.3.3用含0.05%吐温-20的0.01mol/LPIsT(见A.12)洗3次 8.3.4用5%脱脂牛奶(用碳酸盐缓冲液配制)或其他封闭液在37笔封闭1(200L/孔 再用PBST 洗3次 8.3.5每孔加人100AL经2或4倍系列稀释的待检病毒,未感染的细胞悬液(阴性对照),IHNV病毒 悬液(用性对照)及PIsT('空白对照),于7t下和包被的抗IHV抗体反应1h再用sT洗3次 每孔加0.1mL用细胞培养液稀释到工作浓度的鼠抗IHINV单克隆抗体 37C孵育1h;再用 8.3.6 PBST洗3次 8.3.7每孔加100nL.0.1%的H.O.(用双蒸水稀释) 37C反应15min以除掉非特异性的过氧化物 酶 去除孔内液体,用PBST洗2次 8.3.8每孔加人100L 用细胞培养液稀释到工作浓度的辣根过氧化物酶标抗鼠Ig(G(酶标二抗. 37C反应(1h) 8.3.9用PBST冲洗3次 加人四甲基联苯胺溶液(见A.13)0.1mL,37C反应 当阳性对照出现明 显蓝色,阴性对照无色时,每孔立即加人1504L浓度为2mol/1的硫酸溶液终止反应,并立即用酶标仪 测量各孔在波长450nm时的光吸收值(OD值). 8.3.10结果判定;以空白对照的光吸收值调零,再测量各孔的光吸收值 先计算阳性对照和阴性对照 的OD值之比即P/N值) 如果P/N>2.1.表明对照成立 再计算待测样品孔和阴性对照孔的 P/N值 当P/N>2.1时判为IHNV阳性 8.4间接免疫荧光抗体试验 8.4.1在2em的塑料细胞培养板中或盖玻片上制备单层EPC或FHM细胞,25C孵育至长满80% 单层细胞 8.4.2当准备好用作感染的单层细胞后,在传人细胞的当天或第2天,直接将10倍稀释的待鉴定的病 毒悬液接种到细胞培养孔 每个待鉴定的病毒分离物接种6孔,阳性对照2个、阴性对照2个 8.4.3按8.4.2同样方法稀释IHNV病毒参考株的悬液,使得其细胞培养液中病毒滴度要达到 5000PFU/mL10000PFU/mL 8.4.4在15C培养24h .4.5孵育结束后,吸出细胞培养液,立即用0.01mol/L,pH=7.2的PBS(见 A 1 )漂洗1次,然后用 8 -20C预冷的固定液(见A.15)快速漂洗3次 8.4.7使单层细胞在空气中干燥至少30min,立即继续下一步实验或置于一20C保存 8.4.8将单层细胞用含有0.05%吐温-80,浓度为0.01nmol/L,pHH=7.2的PBST浸洗4次,最后一次 清洗后应立即吸除缓冲液 8.4.9用浓度为0.01mol/儿L,pH=7.2的PBST稀释鼠抗IHNV的单克隆抗体到合适的工作浓度 8.4.10加人8.4.9抗血清溶液,每2cm”的孔加0.25mL 将加人单抗后的单层细胞在37C湿盒内反
GB/T15805.2一2017 应1h;再用PBST洗4次 8.4.11将FITC标记的抗鼠抗体按照供应商的操作说明稀释到工作浓度,每2em孔加0.25mL 在 37C下反应1h;再用PBST缓冲液漂洗4次 8.4.12立即观察,或用商品化的封片剂封片 8.4.13用荧光显微镜观察,在观察前首先要观察阳性对照和阴性对照 8.4.14结果判定;在阳性对照出现特异的黄绿色荧光点,阴性对照无黄绿色荧光点或仅有微弱绿色背 景的情况下,待检样品在细胞质上有特异的黄绿色荧光点,判定为阳性;只有微弱的绿色背景,判定为 阴性 O 综合判定 9.1 疑似病例的判定 疑似病例是指在易感鱼中出现典型的临床症状;或者在易感鱼组织中出现典型的病理学特征;或者 在分离培养中出现典型的细胞病变 9.2确诊病例判定 确诊病例指经细胞培养产生典型的细胞病变效应,并将病毒悬液用本标准提供的抗体技术或者分 子实验方法检渊结果为阳性的病例
GB;/T15805.2?2017 ? A 淶?? ? ?? A.1 10L??,??80g?2g,1g?? 23g?2g?6g?4g?6g?pH?7.4?8.0???, ??20C档 A.2????(5??) ool/?250mmol/L??50mmol/L ?Tris-HClpH=8.3)250mmo 0mmol/L.? A.3 ruq??(10?? ?Tris-HCI(pH=8.8)500mn mol/L,?500mmol/1,?1%?? BE??(5??) A.4 1000mL?,?Tris54g27.5g?2.922g,5mol/L pH=8.0 A.5?λ?(plH=9.6 1000nml?,??1.59g?2.93g,???,4C档 A.6?? ?100mL??к:0.25g40g A.7??? 25mmol/L?? A.8???? ???2%?1.4nmol/L,?20mmol/LTis-HCl(pH=7.5) 20mmd nol/L.)?60ml???8.19g,?0.744gTis1.21g,? 0.25ml?0.3mL?pH7.5?8.0.?????2,???100mL
GB/T15805.2一2017 六烧基三甲基溴化胺溶液使用前加筑基乙醇至终浓度为0.25% 抽提液I 异戊醇,氯仿和饱和酚按1;24;25(体积分数)的比例混合,密闭避光保存 A.10抽提液I 异戊醉醇与氯仿按1;24的比例混合,密闭避光保存 A.11核酸染色剂澳化乙锭溶液 用去离子水配制成10mg/ml的嗅化乙锭浓缩液 用时每10ml电泳液或琼脂中加1ML A.12PBSTpH=7.2 在1o0mL水中,分别加人叙化纳&《.氯化钾0.2g.瞬酸二氢娜0.2《.十二水合确酸氢二的 2.9g,吐温-200.05ml,摇匀后,4C保存 A.13四甲基联苯胺使用液 在10.0ml 底物稀释液(见A.16)中依次加人2mg/ml四甲基联苯胺(使用无水乙醇溶解) 0.5mL,0.75%过氧化氢溶液32.0L A.140.01molL，PBs(pH=7.2 在1000ml.水中,分别加人氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸二氢钾0.2g、十二水合磷酸氢二钠 2.9g,充分搅拌完全溶解后,4C保存 A.15固定液 0%丙酮与70%乙醇(体积分数)的混合物 A.16底物稀释液(pH=5.5磷酸盐柠檬酸》 在50.0mL蒸僧水中加人0.2mol/L 磷酸氢二钠28.4g/L)25.7ml,0.1nmol/L柠檬酸(19.2g/L 24.3mL
GB;/T15805.2一2017 录 附 B 资料性附录 IVG蛋白片段 ATGGACACCATGACA.ATCAcTCCGCTCATTCTCATICIAATCACCT(cGGAGCAAACAGcCAAACCcGTCA AACCcCcGACACCGCAAGTGAGTC'AGACCAACcCCACCTGGTCAAACcCGCTCTTCACCTATcCCGAGGATG CAMCTCTGGACAAGCICTCCAAGG,TCAATGCCTCTCAACIGAG.ATGCCCAAGGATCTICGAcCGATGAGAAC AGGGGGCTAATTCCCTATCCCAMCATCCATcCGGT CTCTGTCGGTCGGAAACGACCTCGGGCGATTCACN CcCAAGGGAACTACATCCACAAAGTCITGTACCGCACCATCTGCTCAACAGGGTICTTCG GGTCAGAC GG GATMGAGAAGCCTT AAATGAAACTCTCTACGAAAGAGCAGGGGCGTANTGACAC TGTAG CACAACCGCA GCCG CTCTGTAMCTTCCCAMGC TCCCCGATGC CAATGGTANCACTGACAACGTACAAAACGAT CAGAGACTTCTGG;ACTCAG CACAACCAAAAGAGTGTTCTGAGAG AyTA AGGAAAATGCACCAAATCAC GG:TTTGGATGGGTGA TGCAGcGAT (CTGcCcAGACTcANTTCGTCcAACGT CCAGCCTGTGATTCCAGCCAAGAGTAAAAGGTCACCTCTTTGTTGATAA AGGCAACGAGCTACGGACAC GGCCTGTATGATGACATTCT GTGGGcGGG GTGGATACGGACAGATCTCGGTGACCTAATATCTGTCAGATACAATTCTGGAGCAGAAAT CCGAAGTGTGAGGGCAAGACTGTGGGGATGAGGGGAAACTTGGATGACTTTcCCTATCT4 TGAAGGCCTCTGAGACAGAGAGGAATGTC CGCTGAGATAATATCAACAA ACAGTGTGAC CTATCCAAG ATAAATGACG GCACAAAGG TCCATACCTC TCCATCTATC ACGGGATGTGCATGACGGTC GGACAGGACAACGTACAGGG CCCATCGCGCTACCAGCTTCACGAAATGGAACGACCCT TGGAGATGAGTGGAGGGATTTCACGGAT GCACGGAAACAACACCACCATTATTCCAGACCTGGAGAAATATGTCGCCAGTACAAGACGAGCATGATG GAACCGATGAGCATCAATCCGTGCCCCATCCAAGTATCCTGGCCCTCTACAATGAGACAGACGTATCAG GGATCTCCATCAGGAAATTGGACTCATTCGACCTTCAATCACTCCACTGGAGTTTCTGGCCTACAATCTC CACACTGGGTGGGATTCCCTTTGTTCTCCTCCTTGCTGTTGCCGCGTGCTGCTGCTGGTCAGGGAGACCC CCCCACTCCCCTCAGCGCCGCAGAGTATCCCCATGTATCACCTGGCAAACCGGTCCCTAA 注:带下划线的基因片段为扩增引物
GB/T15805.2一2017 附 录 规范性附录) 传染性造血器官坏死病(IHN) C.1疾病描述 传染性造血器官坏死病(IHN)是由传染性造血器官坏死病毒(IHNV)感染鲑、鳟鱼类为主的一 种 高度传染性、急性流行病 20世纪40年代至20世纪50年代,IHN流行地区仅限于北美洲的西海岸， 现已流传至奥地利、加拿大、法国、德国、意大利、日本,韩国,俄罗斯,斯洛维尼亚、,瑞典,美国和我国 为 我国二类动物疫病 C.2 宿主 多为冷水性鱼类 有虹鳟(Omcorhynchus "ykis)大鳞大麻哈鱼(o.ehaaywxha),红大麻哈鱼 O.nerka)大麻哈鱼(O.keta)、细鳞大麻哈鱼(O.gorbuscha),玫瑰大麻哈鱼(O.rhodurus)、马苏大麻哈 鱼(O.masouu ),银大麻哈鱼(O.kisutch),大西洋鲑(Salmo.salar)和牙鲜(Paralichhysoliaceus. 宿主的易感性往往是仔、稚、幼鱼,越易感 C.3 流行水温 该病主要在水温8亿~12C时流行 水温低于10C为慢性感染,在5C以上时,鱼开始有临床扉 状,但死亡率比较低;10C水温为发病高峰,高于10C呈急性感染,多数鱼苗发病,其潜伏期为1周一 2周,死亡率可高达1o0%,当水温上升到18C以上该病很快停止(形成干扰素,抗体),但此时病毒还能 在体内存活数月 C.4临床症状 在临床肉眼可见的现象有:鱼体游动倦怠并伴有螺旋游泳或快速游动的疯狂发作,整体活动异常 皮肤发暗,眼球突出,钯苍白,腹部肿胀有腹水,并伴有内部和外部出血的瘀斑 在某些种类中有拖带假 粪,即肠黏膜脱落在肛门外形成管状物 在一些存活的鱼中存在脊柱畸形的宏观病变 内部剖检,可见 鱼出现贫血和肠道缺乏食物 肝、肾、脾苍白 在体腔内可见腹水和内脏器官的瘀斑 组织病理学 C.4 组织病理学结果显示;肾,脾,肝,胰腺和消化道变性坏死 肠壁的嗜酸性粒细胞坏死是IHNV感 染所特有的特征 受疾病侵袭的鱼苗的血液显示出,红细胞压积减少,白细胞减少,白细胞和血小板变 性,以及大量细胞碎片 C.6病原 为传染性造血器官坏死病毒(IHNV),属单链RNA病毒;为弹状病毒科,弹状病毒属 病毒颗粒呈 10
GB;/T15805.2一2017 子弹状,长150nm 190nm,宽65nm~ 75nm;具囊膜,囊膜含有宿主脂质和病毒糖蛋白突起,内包含 一条非节段的,反义的单链RNA,基因组约11000个核苷酸,按以下顺序编码6种蛋白质;核蛋白(N 磷蛋白(P,基质蛋白(M)、糖蛋白(G),非结构蛋白(NV)和聚合酶(L) IHNV对热、酸、髅等不稳定 IHNV在淡水中至少存活1个月,特别是在有机物质存在的情况下存活更久 主要感染鱼肾脾 脑和消化道,并在毛细血管的内皮细胞、造血组织和肾细胞上增殖 IHNV可通过水平传播,由粪便、 尿液、精(卵)液和外黏膜传播;也能够随鱼卵进行垂直传播

传染性造血器官坏死病诊断规程GB/T15805.2-2017

传染性造血器官坏死病是一种由于艾滋病毒或人类T细胞淋巴病毒1型（HTLV-1）引起的罕见且致命的疾病。该病主要影响免疫系统和造血系统，在患者身体内导致大量免疫细胞死亡，从而导致严重的免疫抑制和贫血等症状。

根据国家标准GB/T15805.2-2017，传染性造血器官坏死病的诊断需要进行以下步骤：

• 1. 症状分析：传染性造血器官坏死病的症状多样化，包括发热、贫血、乏力、淋巴结肿大、皮肤瘙痒等。医生需要仔细分析患者的临床表现和病史，并排除其他疾病的可能性。
• 2. 实验室检查：传染性造血器官坏死病可以通过检测艾滋病毒或HTLV-1的抗体来进行诊断。此外，医生还需要对患者的免疫功能、造血功能以及内脏功能等进行全面的实验室检查。
• 3. 影像学检查：影像学检查可以帮助医生了解患者的病情程度和病变情况。常用的影像学检查方法包括X线检查、CT扫描、MRI等。
• 4. 病理检查：对于一些病情比较严重的患者，需要进行组织活检或穿刺活检等病理检查，以确定病变范围和病变类型。

总之，传染性造血器官坏死病是一种极具挑战性的疾病，其诊断需要经过多个方面的综合分析和检查。按照国家标准GB/T15805.2-2017进行诊断，可以保证结果的准确性和可靠性。

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