河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱-串联质谱法

河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T22959一2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素、甲碱霉素 和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determinationofchloramphenicol,thiamphenicoland florfenmicolresidesinfugu,eelandbakedeel LC-MS-MSmethod 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22959一2008 前 言 本标准的附录A,附录B为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位;秦皇岛出人境检验检疫局、广东出人境检验检 疫局 本标准主要起草人;林海丹、李宪华、谢守新、林峰,黄华军、邵琳智、庞国芳
GB/T22959一2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氧霉素、甲讽霉素 和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素(chloramphenicol)甲碱霉素(thiamphenicol)和氟苯尼 考(lorfenicol)及其代谢物氟苯尼考胺(lorfenicolamine)残留量的液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中的氯霉素、甲碱霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺残留量的测定 本标准的方法检出限;河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素为0.14g/kg,甲讽霉素、氟苯尼考和氟苯尼考 胺为1.04g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第1部分;总则与定义(GBT6379.1- 2004,ISO5725-l:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,IsO5725-2:1994,IDT GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,ISO3696l987,MOD) 原理 样品中的氯霉素、甲碱霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺在碱性条件下,用乙酸乙酯提取,提取液旋转燕 发挥干,残渣以水溶解,经正已烧液液分配脱脂 液相色谱-串联质谱仪检测,氯霉素、甲碱霉素和氟苯 尼考以内标法峰面积定量,氟苯尼考胺以外标法峰面积定量 试剂 所用试剂除注明外均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 甲醇色谱纯 4.2乙酸乙酯 4.3正己炕 4.4氨水:25%28% 4.5无水硫酸钠;使用前经650C灼烧4h 4.6标准物质;氨霉素(CAs;56-75-7),甲碱霉素(CAs;15318-453)和氟苯尼考(CAs;,76639-946),纯 度>99.5%;氟苯尼考胺,纯度>98.0% 4.7内标标准液;爪代氯霉素(d,-氯霉素),1004g/ml,溶剂为乙晴,尔化度>98% 4g/mL标准储备液;分别准确称取适量的氯霉素、甲碱霉素,氟苯尼考和氟苯尼考胺标准物 4.8100 质(4.6),用甲醇分别配成1004g/mL的标准储备液 该溶液于-18C保存 4.91 /mL氯霉素、甲讽霉素和氟苯尼考混合标准储备液:分别准确吸取1.00mL氯霉素、甲碱霉 从g
GB/T22959一2008 素和氟苯尼考标准储备液(4.8),移至100mL容量瓶中,用甲醇配成14g/mL的氯霉素、甲碱霉素和 氟苯尼考混合标准储备液 该溶液于一18C保存 1腿/ml氧苯尼考股标准储备液;准确吸取1.0mL氧苯尼考胺标准储备液(4.8,移至10ml餐 4.10 量瓶中,用甲醇配成1gmL的氟苯尼考胺标准储备液 该溶液于一18C保存 4.1120ng/ml氧霉素、甲碱霉素和氟苯尼考混合标准中间液:准确吸取1.00mL混合标准储备液 (4.9),移至50mL容量瓶中,用水配成20ng/mL的氯霉素甲讽霉素和氟苯尼考混合标准中间液 该 溶液于4C保存 4.1220n AS ng/ml氟苯尼考胺标准中间液;准确吸取1.00ml氟苯尼考胺标准储备液(4.10),移至50 m 容量瓶中,用水配成20ng/mL的氟苯尼考胺标准中间液 该溶液于4C保存 4.1314g/ml内标标准储备液;准确吸取1.00nL内标标准液(4.7),移至10ml容量瓶中,用甲醇 配成1 "g/ml内标标准储备液 该溶液于一18C保存 4 1420ng/ml内标标准中间液;准确吸取1.00mL内标标准储备液(4.13),移至50ml容量瓶中 用水配成20ng/mL的内标标准中间液 该溶液于4C保存 15氯霉素、甲碱霉素和氟苯尼考混合基质标准工作溶液;根据每种标准的灵敏度和仪器线性范围 临用时吸取一定量的混合标准中间液(4.11)和内标标准中间液(4.14),用空白基质溶液配成适当浓度 的混合基质标准工作液,每毫升该混合基质标准工作溶液含有0.15ng爪代氯霉素(d-氯霉素). 4.16氟苯尼考胺基质标准工作溶液;根据标准的灵敏度和仪器线性范围,临用时吸取一定量的标准中 间液(4.12),用空白基质溶液配成适当浓度的氟苯尼考胺基质标准工作液 4.17滤膜;0.2Am. 仪器 液相色谱-串联质谱仪;配有电喷雾离子源 5.2分析天平;感量0.1mg和0.01g 5.3离心机转速>4000r/min 5.4小型台式离心机:转速>13000r/min 5.5组织捣碎醉机 5 .6 匀浆机 5.7减压旋转蒸发仪 5.》超声水浴 5.9 旋涡振荡器 5. 10聚丙烯离心管;带盖,50mL,1.5mL 11鸡心瓶:25mL 5. 5.12具塞比色管;50mL 试样制备与保存 试样的制备 从所取全部样品中取出有代表性样品可食部分约500g,用组织捣醉机充分捣醉均匀,装人洁净容 器,密封,并标明标记 制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化 试样的保存 将试样于一18冰箱中保存
GB/T22959一2008 测定步骤 7.1提取 称取5g试样,精确至0.0g,置于50mL聚丙烯离心管中,加人内标标准中间液(4.l4)75.0L. 加人25ml乙酸乙酯,0.75ml氨水(4.4),3g无水硫酸钠,匀浆提取30s,4000r/min离心5min,上 清液转移至50mL比色管中 另取一50mL离心管加人20mL乙酸乙酯,0.60m氨水,洗涤匀浆刀 头10s,洗涤液移人第一支离心管中,用玻棒搅动残渣,旋涡振荡提取1min,超声波振荡提取5min. 4000r/min离心5min,上清液合并至50mL比色管,乙酸乙酯定容至50.0mL 摇匀后移取10.0mL 乙酸乙酯提取液于25mL鸡心瓶,45C减压旋转浓缩至干 净化 鸡心瓶中的残渣用2.00mL水溶解,旋涡振荡混匀,超声5min,加人3mL正己烧旋涡振荡混合 30s,静置分层,弃掉上层的正已婉,再加3ml正己婉旋涡振荡混合30s,静置分层,移取部分下层的水 相于1.5ml的聚丙烯离心管中,l3000r/min离心5min,经0.2m滤膜过滤后,供液相色谱-串联质 谱测定氯霉素、甲碱霉素和氟苯尼考 另吸取100L滤液于液相进样瓶,加人400L水,混匀,供液相 色谱-串联质谱测定氟苯尼考胺 空白基质溶液的制备 称取5只空白样品,精确至0.01g,除不加人内标标准中间液,其他按7.1和7.2步骤操作 测定条件 液相色谱参考条件 7.4.1.1氯霉素、甲讽霉素和氟苯尼考测定 DiscoveryC,5am,150mm×2.1mm(内径)或相当者 色谱柱sUPELco a b 柱温:40C; e)流动相;甲醇-水(2十3); d 流速;0.30ml/min; 进样量;20L 7.4.1.2氟苯尼考胺测定 a 色谐柱;lntersilC,-3,5Mm,150mm×4.6mm(内径)或相当者 b 柱温;40C; 流动相甲醉-水(4十1). d 流速:0.30mL/min; 进样量:l0AL e) 质谱参考条件 2 7.4. a 离子源;电喷雾离子源(ESI); b) 扫描方式:负离子扫描(氧霉素、甲碱霉素和氟苯尼考测定),正离子扫描(氟苯尼考胺测定). 检测方式:多反应选择离子检测(MRM); c d 电喷雾电压(IS);一4200V氧霉素、甲碱霉素和氟苯尼考测定),4500V氟苯尼考胺测定); 雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体,使用前应调节各气体流量 e 以使质谱灵敏度达到检测要求 辅助气温度TEM):600; 定性离子对、定量离子对、采集时间、去簇电压及碰撞能量见表1 g
GB/T22959一2008 表1氧霉素、甲讽霉素、氟苯尼考、气代氧霉素(d-氯霉素)和氟苯尼考胺的质谱参数 采集时间 定性离子对 定量离子对 去簇电压 碰撞能量 化合物名称 m/2 m/e) ms 320.9/257.o 一l6 氯霉素 320.9/152.0 200 55 320,9/152.0 -26 353.9/290.3 -17 甲碱霉素 353.9/185.2 200 55 353.9/185.2 -27 356.0/336.0 -14 356.0/336.0 200 55 氧苯尼考 356.0/185.0 -27 爪代氯霉素(d-氧霉素) 55 326,0/157.o 326.0/157.0 200 -26 248.3/230.2 18 45 氟苯尼考胺 248.3/130.2 200 248.3/130,2 33 液相色谱-串联质谱测定 定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同试验条件下,样品中待检测物质和内标物 的保留时间之比,也就是相对保留时间,与标准溶液中对应的相对保留时间偏差在士2.5%之内;且样品 谐图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液谐图中对应的定性离子的相对丰度进行比 较,偏差不超过表2规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以%表示 相对离子丰度K K50 20%GB/T2295g一2008 -x是*台入会MI一 式中: -试样中被测物残留量-单位为微克每千克(e/k2) 基质标准工作溶液中被测物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/ml.); 试样溶液中被测物的色谱峰面积; 基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积; 试样溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL). 基质标准工作溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); 基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积; 试样溶液中内标物的色谱峰面积; 样液最终定容体积,单位为毫升(mL.); 试样溶液所代表试样的质量,单位为克(g) m1 计算结果应扣除空白值 氟苯尼考胺残留量的测定结果按式(2)计算: ]1 000 x " -x 2 1000 式中: 试样中被测组分残留量,单位为微克每千克(gg/kg); 从基质标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); 样品溶液最终定容体积,单位为毫升(mL); 样品溶液所代表最终试样的质量,单位为克(g) m7 计算结果应扣除空白值 精密度 9.1一般规定 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,重复性和再现性的值 以95%的可信度来计算 9.2重复性 在重复性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,被测物的添加浓度 范围及重复性方程见表3 表3添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克 化合物名称 添加浓度范围 样品基质 重复性限r" 再现性限R =1.13 uR =1.07 河豚血 lgm十0.691 lgm十0.67m7 gr- 氯霉素 0.100~1.00 鳗鱼 lgr=0.979lgm+0.762 lgR=1.00lgm+0.762 烤蚁 lgr=1.11lgm十0.635 lgR=1.01lgm十0.632 河豚鱼 lgr=0.753lgm一0,0331 lgR=1.08lgm-0.0622 甲碱霉素 1.00~10,0 鳗鱼 lgr=0.99lgm-0.170 lgR=0,996lgm一0,150 烤毁 lg=0.883lgm一0.0969 lgm一0.11m1 lgkR=104
GB/T22959一2008 表3(续 单位为微克每千克 化合物名称 样品基质 添加浓度范围 重复性限" 再现性限R 河豚鱼 lgr=0.985lgm一0.146 lgR=0.997lgm一0.127 苯尼考 鱼 1.0010.0 lgr=0.956lgm一0.159 lgR=0.981lgm-0.130 =0.973 -0.115 -0.148 烤毁 lgR=1.01lgm gr lgm 河豚鱼 lgr=1.09lgm-0.179 lgR=0.974lgm-0.143 鱼 1.12 氟苯尼考胶 lgm一0.190 lgR=0.983lgm一0.170 1.008.00 lgr= lgr=1.17lgm-0.200 lgR=0.969lgm-0.177 烤毁 注，朋为两次测定结果的算术平均值 如果差值超过重复性限r,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 再现性 在再现性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,被测物的添加浓度 范围及再现性方程见表3
GB/T22959一2008 附 录A 资料性附录 标准物质的多反应监测(MRM)色谱图 氯霉素、甲碱霉素和氟苯尼考标准物质的多反应监测色谱图见图A.1,冗代氧霉素的多反应监测色 谱图见图A.2,氟苯尼考胺标准物质的多反应监测色谱图见图A.3 3.70 3.70 320.9/152.0 320.9/257.0 4.9e4 3.0e4 4.04 2.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e4 l.0e4 0.0 0.0 0.51.01.52.02.53.03.54.o 0.51.01.52.02.53.03.54.0 /min t/mim 53.9/185.2 353.9/290.3 1.89 l.89 2.3e4 1.8c4 2.0e4 l.5e4 1.5c4 1.0e4 1.0e4 5000.0 5000.0 0.0 0.0 O.5.0I.2025a.0a54O 0.5l.0 2.0 3.03.54.0 /mim 1/min 356.0/336.0 356.0/185.0 2.33 2.33 8.04 5.0e4 4.0e4 6.0e4 3.0e4 4.0e4 2.0e4 2.0e4 1.0e4 0.0 0.0 1.52.02.53.03.54.0 0.5 3.54.0 /min 1/min 图A.1氯霉素、甲讽霉素和氟苯尼考标准物质的多反应监测(MRM)色谱图
GB/T22959一2008 320.9/157.0 3.63 1.00e4 8000.00 6000.00 4000.00 2000.00 0.00 0.5 2.0 3.0 /min 图A.2气代氯霉素(d-氯霉素)标准物质的多反应监测(MRM)色谱图 248.3/230.2 248.3/130.2 .33 2.0e4 4000- 1.0e 200o 0.0 /minm /minm 图A.3氟苯尼考胺标准物质的多反应监测(MIRM)色谱图
GB/T22959?2008 ? B ?? ù??ù?????????B.1 B.1ù??ù???????? ? ?/u4g/kg ?/% 0.100 92.0 0,200 96.2 ù 0.500 99.0 1.00 92.0 1.00 102 2.00 92.6 ?ù 4.00 96.4 94." 10.0 95.0 1.00 2.00 95.2 ? 4.00 98.0 10.0 98.0 97." 1.00 2.00 95.7 ? 4.00 95.4 8.00 102 93.2 0,200 96.7 ù 0.500 95.6 1.00 95.1 91.6 1.00 2.00 91.3 ?ù 4.00 88.9 10.0 88.2 92.6 .00 2.00 102 ? 4.00 92.5 10.0o 89.4 1.00 96.1 2.00 91.3 ? 4.00 94.4 8.00 93.5
GB/T22959一2008 表B.1续 样品基质 平均回收率" /% 化合物名称 添加浓度/4g/kg 0.100 96.7 0.200 97.9 氯霉素 0,500 97.6 1.00 95.9 1.00 85.7 91.2 2.00 甲碱霉素 4.00 92.l1 10.0 87.8 烤鳗 1.00 97.0 97.1 2.00 氟苯尼考 4.00 95.9 10.0 91.8 1.00 93.7 2.00 93.4 佩苯尼考版 4.00 95.7 8.00 96.3 10